資料內(nèi)容僅供您學(xué)習(xí)參考，如有不當或者侵權(quán)，請聯(lián)系改正或者刪除。一株沼澤紅假單胞菌VOTO1-G的分離鑒定及應(yīng)用研究摘要:目的分離、篩選去除富營養(yǎng)化水體營養(yǎng)鹽的高效菌株。方法采用富集、培養(yǎng)常規(guī)細菌分離方法,經(jīng)過多次分離純化,從河流沉積物中篩選出1株光合細菌菌株,命名為VOTO1-G。在研究其生長規(guī)律的基礎(chǔ)上,采用分子生物學(xué)方法對該菌株進行了鑒定。將分離純化的光合細菌富集培養(yǎng)后進行除污試驗,探討其不同濃度的除污效果。結(jié)果經(jīng)過形態(tài)學(xué)、革蘭染色、并結(jié)合16SrDNA序列同源性分析,其鑒定結(jié)果為沼澤紅假單胞菌(Rhodopseudomonaspalustris)。經(jīng)過對該菌株在培養(yǎng)過程中吸光度的測定,進一步研究了其生長規(guī)律:在5～10天,活菌數(shù)迅速增加,處于對數(shù)生長期,在10～14天,處于穩(wěn)定期。利用不同投加量的沼澤紅假單胞菌對富營養(yǎng)化河流水體進行處理研究,篩選的菌株具有一定的脫氮除磷、去除有機物的能力。COD、TP、TN的去除率分別為12%、25%、13%。結(jié)論從河流沉積物中分離出的沼澤紅假單胞菌具有一定的脫氮除磷、去除有機物的能力。關(guān)鍵詞:光合細菌沼澤紅假單胞菌富營養(yǎng)化河流沉積物景觀水體PhotosyntheticbacteriaofRhodopseudomonaspalustrisisolatedfromriversedimentAbstract:ObjectiveOnestrainofphotosyntheticbacteriaassociatedwithhighlyremovalcapabilityofpollutantwasisolated,andinvestigatedaboutitsgrowth．MethodsByusinganenrichmentcultureandplatedilutionmethod,onestrainofbacteria,namedVOTO1-G,wasisolatedfromriversedimentmainlyreceiveddomesticwastewater．TheVOTO1-Gbacteriawasresearchedaboutitsgrowthlaw,andidentifiedbymolecularbiologymethod,andfurtherusedtotestitsabilityintheremovingofnitrogen,phosphorusandorganiccompoundfromeutrophicwaterby0.05‰,0.1‰and0.2‰．ResultsBycheckingtheindividualmorphology,colonyculturecharacteristics,DNAsequencingand16SrDNAgenebank,VOTO1-GwasidentifiedasRhodopseudomonaspalustris．Theisolatedbacteriastrainhadsomenitrogen,phosphorusandorganiccompoundremovalability．ConclusionOnestrainofphotosyntheticbacteriawassuccessfullyisolatedfromsewagesediments．Itsremovalcapacityofnitrogen,phosphorusandorganiccompoundfromeutrophicwaterwasgood,whichremovedCOD12%,TP25%,TN13%．Keywords:photosyntheticbacteria,Rhodopseudomonaspalustris,eutrophication,riversediment,eutrophicwater第6期王琳,等.一株沼澤紅假單胞菌VOTO1-G的分離鑒定及應(yīng)用研究939近年來,國內(nèi)外關(guān)于光合細菌去除水體中營養(yǎng)物質(zhì)的報道很多［1-5］,主要集中在發(fā)展生物脫氮除磷的新工藝和新概念［6-7］、菌株選育［8-10］等方面。在菌種的選育方面,雖然已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了多種不同類型的光合細菌,可是不同光合細菌的脫氮除磷能力不同。如何獲得高效的降解菌株以及如何使其成為反應(yīng)體系中的優(yōu)勢種群而發(fā)揮更好的脫氮除磷效果依然是研究的熱點。本試驗從受納生活污水的河流沉積物中分離、篩選光合細菌高效降解菌株,并采用形態(tài)學(xué)特征、分子生物學(xué)等多種方法進行鑒定,為研究其在富營養(yǎng)化水體中的脫氮除磷性能和相關(guān)污水的處理提供微生物基礎(chǔ)。1材料與方法1.1富集培養(yǎng)北京市清河主要是生活污水的受納水體,氮、磷含量很高,其中總氮濃度(TN)為9.46mg/L(以N計),總磷濃度(TP)為0.96mg/L(以P計)。取清河的底泥100g裝入透明的玻璃圓桶標本缸內(nèi),與1000ml光合細菌液體富集培養(yǎng)基攪拌均勻,然后在標本缸上層加入液體石蠟以隔絕空氣,在(25～35)℃下,以4000lx光照強度培養(yǎng)2周。用無菌滴管從光合細菌生長良好的圓桶玻璃標本缸內(nèi)壁處,吸取紅色細菌和污水水樣5ml,移植到無菌試劑瓶中,加入滅菌后的富集培養(yǎng)液,加上橡皮塞,造成厭氧狀態(tài),繼續(xù)光照,厭氧培養(yǎng)時保持(25～35)℃,試劑瓶中菌液的顏色逐漸變紅。待生長良好后,再按上述同樣步驟轉(zhuǎn)接3次,至試劑瓶中菌液成棕紅色,紅螺菌科細菌占優(yōu)勢。紅螺菌科分離培養(yǎng)基:NH4Cl0.1g,MgCl20.02g,酵母膏0.01g,K2HPO40.05g,NaCl0.2g,瓊脂2g,蒸餾水90ml,0.1MPa滅菌20min。滅菌后,無菌操作加入經(jīng)過濾除菌的0.5g/5mlNaHCO3;再無菌加入過濾除菌的0.1gNa2S·9H2O;最后再加5ml經(jīng)過除菌的4%丙氨酸。用過濾滅菌的0.1mol/LH3PO4調(diào)pH至7.0。紅螺菌科富集培養(yǎng)基:NH4Cl0.1g,NaHCO3(5%NaHCO3水溶液,過濾除菌取2ml加入無菌培養(yǎng)基中)0.1g,K2HPO40.02g,CH3COONa0.1g,MgSO4·7H2O0.02g,NaCl0.05g,生長因子(維生素B10.001mg、尼克丁酸0.1mg、對氨基苯甲酸0.1mg、生物素0.001mg,以上藥品溶于蒸餾水中,定容至10ml,然后過濾除菌)1ml,蒸餾水97ml,微量元素溶液(FeCl3·6H2O5mg、CuSO4·5H2O0.05mg、H3BO41mg、MnCl2·4H2O0.05mg、ZnSO4·7H2O1mg、Co(NO3)2·6H2O0.5mg,以上藥品分別溶于蒸餾水中,并定容至1000ml)1ml,pH7.0［11］。除NaHCO3、生長因子和微量元素溶液外,各成分溶解后0.1MPa滅菌20min,然后再分別加入NaHCO3、生長因子和微量元素溶液。1.2分離純化分離用固體培養(yǎng)基:在液體培養(yǎng)基中加入2%的瓊脂,其它成分不變。將已融化并冷卻至(45～50)℃紅螺菌分離培養(yǎng)基傾倒平板;再用已經(jīng)過過濾除菌的0.05%抗壞血酸溶液對富集培養(yǎng)的紅螺菌科細菌菌懸液適當稀釋;以涂布分離法將稀釋的紅螺菌科細菌菌懸液在平板上,然后再倒入(45～50)℃紅螺菌分離培養(yǎng)基,造成厭氧環(huán)境,(25～35)℃,4000lx光照下培養(yǎng)。待棕紅色菌落出現(xiàn)后,挑單菌落在2ml液體富集培養(yǎng)基中進行擴增培養(yǎng)。重復(fù)上述操作,重復(fù)進行涂平板挑單菌落,直至獲得純菌種。同時保存純菌種:(1)液態(tài)保存:將液體培養(yǎng)基滅菌后接入菌種,經(jīng)光照培養(yǎng)后,置于4℃冰箱中,以后每隔30天轉(zhuǎn)接一次;(2)固態(tài)保存:制備固體培養(yǎng)基,挑取較大的菌落穿刺接種,經(jīng)光照培養(yǎng)后用液體石蠟封口,用黑布包裹后,置于－70℃下,每隔一年轉(zhuǎn)接一次［12］。1.3菌種的生長規(guī)律試驗在菌種篩選試驗的基礎(chǔ)上,對獲得的菌種進行細胞生長測定及其生長規(guī)律的試驗研究。在光合細菌的富集培養(yǎng)基中按20%的接種量接種,在30℃光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng),每天同一時間取3個重復(fù)于波長600nm處,測其吸光度(A值),以便將菌體培養(yǎng)到對數(shù)生長期的初期或在對數(shù)生長期到穩(wěn)定期之間。1.4菌種的鑒定對所篩選到的菌株進行鑒定,經(jīng)過觀察菌落形態(tài)、顯微鏡下菌體形態(tài)觀察、革蘭染色、16SrDNA擴增以及DGGE等分子生物學(xué)手段相結(jié)合的方法進行了菌株的鑒定等,依照微生物學(xué)細菌分類鑒定實驗方法,對獲得的菌株進行初步鑒定。1.5DNA提取及PCR-DGGE技術(shù)1.5.1樣品準備和細菌DNA提取取分離純菌株的液體培養(yǎng)液于8ml離心管中,8000r/min,4℃,離心20min,棄上清液,取沉淀,加入0.5mlDNA提取緩沖液(1mol/LTris-HCl,pH8.0)備用。單菌株DNA的提取采用BenzylChloride方法［13］。1.5.2PCR擴增PCR擴增采用AmpliTaqGoldTM反應(yīng)系統(tǒng)(PerkinElmer,AppliedBiosyst-ems,NJ,USA)。引物為357F和517R,它們的序940衛(wèi)生研究第41卷列分別為5’-CCTACGGGAGGCAGCAG-3’,5’-ATTACCGCGGCTGCTGG-3’。PCR的反應(yīng)程序:95℃10min;下面的程序進行25個循環(huán),93℃1min,50℃1min,72℃1min30s;之后,93℃1min,50℃1min,72℃5min。反應(yīng)體系(50μl):1μldNTP(10mmol/L)、5μl10×PCRGoldBuffer、4μlMgCl2(25mmol/L)、0.5μl357F(45pmol/μl)、0.5μl517R(45pmol/μl)、1μl模板DNA(10ng/μl)和0.5μlTaq酶(2U/ml),其余體積用無菌水補充。PCR產(chǎn)物以2%瓊脂糖凝膠電泳檢測,經(jīng)純化后送測序公司測序,所獲得的DNA序列與BLAST程序的數(shù)據(jù)庫序列比較,確定菌株的分類地位。1.5.3DGGE電泳及分析采用DCode系統(tǒng)(Bio-Rad,Laboratories,Hercules,Calif)對PCR擴增產(chǎn)物用雙變性法進行DGGE分析［14］。聚丙烯酰胺凝膠濃度為6%～12%,尿素變性梯度為20%～55%(尿素為7mol/L,甲酰胺為40%時的變性濃度為100%),在61℃恒溫下,電壓為200V時電泳5h,采用SYBRGREENⅠ(MolecularProbes,Eugene,Ore)染色30min,紫外凝膠成像系統(tǒng)分析結(jié)果［15］。1.6水質(zhì)凈化試驗設(shè)計試驗水體取自北京動物園內(nèi)有代表性的水域———污染比較嚴重的水禽湖,水體COD為87.6mg/L,TN為1.55mg/L,TP為0.15mg/L,pH為7.3。將取回的水樣分裝在3L的錐形瓶中,每個瓶中裝1L水,菌液的添加量為處理水體積的0.05‰、0.1‰和0.2‰。分別用滅菌后的100ml離心管在無菌條件下取富集好光合細菌培養(yǎng)物,用無菌生理鹽水離心洗滌2～3次(4000r/min,每次10min),再用無菌生理鹽水稀釋至相同體積,振蕩混合均勻,制成菌體懸液于4℃冰箱中保存?zhèn)溆?。投加微生物后以及微生物處?天后,分別取樣,測定水體中的COD、TP、TN。研究所篩光合細菌是否具有脫氮除磷、去除有機物能力。1.7化學(xué)指標測定方法［16］總氮(TN)為紫外分光光度法,總磷(TP)為鉬銻抗分光光度法,化學(xué)需氧量(COD)為重鉻酸鉀氧化法,pH采用pH計進行測定。2結(jié)果2.1光合細菌的富集培養(yǎng)將采集的沉積物接種到紫色非硫細菌液體富集培養(yǎng)基中,經(jīng)過7天左右,培養(yǎng)液開始出現(xiàn)淺紅色,經(jīng)4～5次轉(zhuǎn)接培養(yǎng)后,顏色逐漸加深,呈紫紅色,此時主要是紫色非硫細菌科的混合菌。2.2細胞形態(tài)特征和菌落特征采用平板分離的方法得到純菌株,命名為VOTO1-G,該菌株在光照厭氧和黑暗好氧條件下均能生長,屬于兼性厭氧菌。VOTO1-G菌株革蘭染色為陰性,單個細胞為卵形或短桿狀(圖1),菌體大小為(0.6～0.9)×(1.2～2.0)μm。單菌落在分離固體培養(yǎng)基上呈棕紅色(圖2),直徑1～2mm,表面光滑濕潤,中央突起,邊緣整齊。圖1菌株VOTO1-G的顯微照片F(xiàn)igure1LightmicrographofstrainVOTO1-Gshowingcellshape圖2VOTO1-G菌株的菌落Figure2ColonyofstrainVOTO1-G2.3VOTO1-G菌株的生長曲線在0～5天,這一時期為光合細菌的延滯期(見圖3),在5～10天,活菌數(shù)迅速增加,處于對數(shù)生長期,在此階段,VOTO1-G菌株生長活躍,大量繁殖;在10～14天,處于穩(wěn)定期。在應(yīng)用中常選擇既保持旺盛增殖能力,又達到較高的濃度以縮短發(fā)酵周期［17］。因此,選取培養(yǎng)至9天的菌體進行水質(zhì)凈化試驗。2.4DGGE分析將光合細菌液體培養(yǎng)液收集后用氯苯法提取DNA,將提取的DNA進行2%瓊脂糖電泳,然后進行16SrDNAV3區(qū)序列PCR擴增,將PCR擴增產(chǎn)物進行DGGE電泳,電泳圖譜如圖4,從DGGE圖中能夠檢測到只有一條帶。2.5菌種鑒定經(jīng)過平板分離純化和DGGE篩選,確定獲得的菌株VOTO1-G是純菌種。經(jīng)過16SrDNA基因測序并與NCBI基因數(shù)據(jù)庫中已有菌種的16S第6期王琳,等.一株沼澤紅假單胞菌VOTO1-G的分離鑒定及應(yīng)用研究941圖3VOTO1-G菌株的生長曲線Figure3GrowthcurveofstrainVOTO1-GwhenitwasculturedM:Maker;G:VOTO1-G圖4VOTO1-GDGGE圖譜Figure4DGGEprofileofV3regionof16SrDNAfromVOTO1-GrDNA序列進行同源性分析和相似性分析,在分子水平對VOTO1-G進行系統(tǒng)發(fā)育、種屬鑒定。在顯微鏡下觀察菌體細胞主要為卵形或短桿狀(見圖1),平板上培養(yǎng)的菌落為深紅色(見圖2),經(jīng)過16SrDNA基因序列并與數(shù)據(jù)庫近緣種Rhodopseudomonaspalustris(AB275664)進行比較分析,相似率為93.2%,根據(jù)同源性檢索和相似性分析鑒定菌株VOTO1-G為沼澤紅假單胞菌(Rhodopseudomonaspalustris),登錄號為FJ6955-08。當前,沼澤紅假單胞菌(Rhodopseudomonaspalustris)是研究和應(yīng)用較廣泛的一種光合細菌。(1)在廢水處理研究上。KIM等［18］從水產(chǎn)養(yǎng)殖水體的光合污泥中篩選到一株其強烈脫氮作用的沼澤紅假單胞菌,能夠把水體中硝酸鹽轉(zhuǎn)化為氮氣去除,而在轉(zhuǎn)化過程中,只積累了少量的亞硝酸鹽。SAWAYAMA等［10］從厭氧污泥反應(yīng)器中分離到一株沼澤紅假單胞菌用于污水中有機物的去除。HONDA等［19］在實驗室條件下,在反應(yīng)器中接種沼澤紅假單胞菌去除水體中可溶性有機碳。(2)產(chǎn)類胡蘿卜素和輔酶Q10的研究。類胡蘿卜素不但具有增色功效,而且還具有營養(yǎng)功能。同時用經(jīng)發(fā)酵法生產(chǎn)類胡蘿卜素工藝又具有較高的安全性、低成本及強著色力等優(yōu)點,一直受到格外青睞。方立超等［8］從水塘污泥中分離到一株產(chǎn)輔酶Q10的菌株,進16SrDNA序列分析表明是沼澤紅假單胞菌。(3)在水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中的應(yīng)用。在水質(zhì)凈化方面,邱宏端等［9］選育出的沼澤紅假單胞菌在0.1%～0.4%的鹽度下均具有較高的去除NH+4♂、NO-2♂的能力。(4)降解有機污染物。KAMAL和WYNDHAM［4］、KROONEMAN等［5］研究表明沼澤紅假單胞菌能夠降解3-氯苯甲酸,能夠?qū)θ玖线M行脫色和降解［20］。(5)其它領(lǐng)域的研究。MARIA等［21］和YOU等［22］從能源的角度對沼澤紅假單胞菌產(chǎn)氫進行了研究。2.6水質(zhì)凈化生物降解過程中存在一個微生物濃度和水體中污染物相對應(yīng)的關(guān)系,也就是在一定的投菌濃度下,污染物存在一個能夠被有效降解的適宜濃度。本試驗以小水體(1L)探討沼澤紅假單胞菌凈化富營養(yǎng)化水體的初步效果以及適宜的投菌濃度。經(jīng)過5天的處理,各處理的COD、TP、TN的去除率如表1所示。沼澤紅假單胞菌對富營養(yǎng)化水體中的COD、TP、TN均有一定的去除效果。該研究中,沼澤紅假單胞菌在投菌濃度為0.1‰時處理效果較好。表1沼澤紅假單胞菌處理富營養(yǎng)化水體5天后的COD、TP、TN去除率Table1After5daystreatmenttheremovalratesofCOD、TP、TN處理投菌濃度(‰)COD(%)TP(%)TN(%)空白05.20±2.014.9±0.36.4±0.5光合細菌0.0512.1±0.223.2±1.012.2±1.00.112.7±0.325.5±1.013.9±0.20.212.0±0.223.6±1.112.2±0.43結(jié)論(1)采用常規(guī)細菌分離方法,成功地從受納生活污水的河流沉積物中分離出了1株光合細菌,命名為VOTO1-G,并探索出了其分離、純化方法。經(jīng)過對VOTO1-G菌株進行形態(tài)學(xué)、革蘭染色、16SrDNA序列同源性分析,鑒定為沼澤紅假942衛(wèi)生研究第41卷單胞菌(Rhodopseudomonaspalustris)。進一步研究其生長規(guī)律,發(fā)現(xiàn)光合細菌VOTO1-G在5～10d,活菌數(shù)迅速提高,處于對數(shù)生長期,為水質(zhì)凈化提供依據(jù)。(2)采用沼澤紅假單胞菌VOTO1-G對北京市動物園內(nèi)的富營養(yǎng)化的景觀水體進行預(yù)處理研究,經(jīng)過5天的處理,不同的投加濃度對富營養(yǎng)化水體中的COD、TP、TN均有一定的去除效果。其中投加量為0.1‰時,去除效果較好。這表明VOTO1-G具有一定的脫氮除磷、去除有機物的能力,這對于城市污水脫氮除磷、去除有機物工藝的發(fā)展具有重要意義。(3)該試驗只是初步探討所篩選菌株對富營養(yǎng)化水體具有一定的凈化效果,應(yīng)進一步分析其投加該菌株后水質(zhì)的變化特點,以及對不同富營養(yǎng)化程度的水體進一步研究,探索出富營養(yǎng)化程度和投菌濃度的線性關(guān)系,以便達到經(jīng)濟、有效。參考文獻1李景生,黃韻珠.應(yīng)用PSB處理乳產(chǎn)品廠廢水的試驗研究［J］.環(huán)境科學(xué)學(xué)報,1997,10(3):17-20．2樊凌雯,張肇銘,張德詠,等.利用光合細菌法處理糖蜜酒精發(fā)酵廢液中試研究［J］.中國環(huán)境科學(xué),1998,18(2):173-175．3陳繁中,朱好根,崔明超,等．利用光合細菌處理養(yǎng)豬廠污水的試驗研究［J］．環(huán)境工程,,18(5):10-12．4KAMALVS,WYNDHAMRC．Anaerobicphototrophicmetabolismof3-chlorobenzoatebyRhodopseudomonaspalustris［J］．ApplEnvironMicrobiol,1990,56(12):3871-3873．5KROONEMANJ,VANDERAKKERS,GOMESTMP,etal．Degradationof3-chlorobenzoateunderlow-oxygenconditionsinpureandmixedculturesoftheanoxygenicphotoheterotrophRhodopseudomonaspalustrisDCP3andanaerobicaerobicAlcaligenesspecies［J］．ApplEnvironMicrobiol,1999,65(1):131-137．6MUNOZR,KOLLNERC,GUIEYSSEB．Biofilmphotobioreactorsforthetreatmentofindustrialwastewaters［J］．JHazardousMaterials,,161:29-34．7SCHRYVERPD,VERSTRAETEW．Nitrogenremovalfromaquaculturepondwaterbyheterotrophicnitrogenassimilationinlab-scalesequencingbatchreactors［J］．BioresourceTechnol,,100:1162-1167．8方立超,黃雪峰,杜珍輝,等．產(chǎn)生輔酶Q10的光合菌株的分離及鑒定［J］．微生物學(xué)報,,45(5):772-775．9邱宏端,石賢愛,郭養(yǎng)浩．耐鹽和降高NH+4♂、NO-2♂紅螺菌科細菌的選育及應(yīng)用［J］．水產(chǎn)學(xué)報,1999,23:92-96．10SAWAYAMAS,HANADAS,KAMAGATAY．Isolationandcharacterizationofphototrophicbacteriagrowinginlightedupflowanaerobicsludgeblanketreactor［J］．JBiosciBioengineering,,89(4):396-399．11錢存柔,黃儀秀．微生物學(xué)實驗教程［M］．北京:北京大學(xué)出版社,:211-212．12劉如林,刁虎欣,梁鳳來．光合細菌及其應(yīng)用［M］．北京:中國農(nóng)業(yè)科技出版社,1991:12．13ZHUH,QUF,ZHULH．IsolationofgenomicDNAsfromplants,fungiandbacteriausingb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