淺論CTGF反義RNA對血管平滑肌細胞增殖和遷移的影響【摘要】目的應用反義RNA技術特異性下調(diào)結締組織生長因子(CTGF)的表達，觀察其對血管平滑肌細胞(VSMC)增殖和遷移的影響，并探討其作用機制。方法培養(yǎng)原代VSMC，使用脂質(zhì)體法將攜帶有CTGF反義RNA的真核表達載體(+)-CTGF(-)轉(zhuǎn)染入VSMC，WesternBlot技術觀察CTGF的表達以及蛋白激酶B(Akt)的活性，MTT法及劃痕試驗測定VSMC增殖和遷移情況。結果(+)-CTGF(-)轉(zhuǎn)染VSMC后CTGF的表達明顯降低，Akt的活性降低，VSMC的增殖和遷移受到明顯抑制。結論應用反義RNA技術可特異性下調(diào)CTGF表達，并通過降低Akt的活性抑制VSMC的增殖和遷移。

【關鍵詞】血管平滑肌細胞結締組織生長因子細胞增殖細胞遷移反義RNA

Abstract：ObjectiveTospecificallydown-regulatetheexpressionofCTGFbyapplyinganti-senseRNAtechniqueandobserveitseffectonproliferationandmigrationofVSMC.MethodsPrimaryVSMCswereculturedbyadherencemethod.Anti-senseRNAtechniquewasappliedtospecificallydown-regulatetheexpressionofCTGF.ExpressionofCTGFandactivityofAktweredetectedbyWB.ProliferationandmigrationofVSMCweredeterminedbyMTTandscratchassay.ResultsTransferofpcDNA(+)-CTGF(-)couldspecificallydown-regulateCTGFexpressionandtheactivityofAkt.TheproliferationandmigrationofVSMCwereinhibited.ConclusionsSpecificdown-regulationofCTGFexpressionbyanti-senseRNAtechniquecouldinhibittheproliferationandmigrationofVSMCsbydecreasingthephosphorylationofAkt.

Keywords：vascularSmoothmusclecell(VSMC);connectivetissuegrowthfactor(CTGF);cellproliferation;cellmigration;anti-senseRNA

動脈粥樣硬化(Atherosclerosis，AS)始于血管內(nèi)膜損傷［1］。在AS發(fā)生前，常有多種因素的刺激對血管內(nèi)膜造成損傷，內(nèi)皮細胞發(fā)生功能性和器質(zhì)性改變，造成通透性改變和分泌功能障礙，促進血液中的脂質(zhì)進入動脈壁。內(nèi)皮細胞和動脈中層的血管平滑肌細胞(vascularendothelialcell，VSMC)進一步激活，大量合成并分泌多種生長因子，使自身和周圍細胞大量增殖，增殖的VSMC還可迅速合成膠原等細胞外基質(zhì)［2］，促使VSMC在損傷修復過程中發(fā)生纖維化，形成瘢痕修復，血管壁在結構和功能上發(fā)生了變化，最終導致了AS的形成［3］。

結締組織生長因子(connectivetissuegrowthfactor，CTGF)是從培養(yǎng)的人臍帶靜脈血內(nèi)皮細胞的條件培養(yǎng)基中發(fā)現(xiàn)的。有研究表明［4］，CTGF參與了血管的損傷修復，能夠直接誘導結締組織細胞增殖和細胞外基質(zhì)合成，促進AS的發(fā)展。AS病灶中CTGF的mRNA和蛋白質(zhì)較正常的血管內(nèi)有較高表達，可見CTGF在AS的發(fā)生和發(fā)展中有著重要意義［5］。

本課題旨在探討CTGF在AS中對VSMC增殖和遷移的影響并明確其相關機制，為CTGF對動脈粥樣硬化性血管狹窄病變過程的影響提供實驗依據(jù)。

1材料與方法

實驗材料

1月齡SD大鼠由遼寧醫(yī)學院實驗動物中心提供。CTGF反義RNA的真核表達載體(+)-CTGF(-)質(zhì)粒由遼寧醫(yī)學院科學實驗中心構建。羊抗大鼠CTGF多克隆抗體，ECLTM顯影液，BCA-100蛋白質(zhì)定量測定試劑盒(美國SantaCruz公司);Akt和磷酸化Akt抗體，平滑肌α肌動蛋白單克隆抗體(美國Sigma公司);低糖DMEM培養(yǎng)基(美國Gibco公司);小牛血清，胰蛋白酶(杭州四季青生物工程公司);其他試劑均為國產(chǎn)分析純產(chǎn)品。

霍曉川，等：CTGF反義RNA對血管平滑肌細胞增殖和遷移的影響遼寧醫(yī)學院學報2008年2月，29(1)實驗方法

VSMC的培養(yǎng)和鑒定

處死大鼠浸于75%乙醇中消毒10min。無菌狀態(tài)取出雙側頸總動脈，去除血管外結締組織，剖開血管，刮去內(nèi)膜，剝離外膜，將中膜剪成1mm2左右的組織塊植入經(jīng)明膠包被處理的培養(yǎng)皿中，種植密度約為1塊/cm2，37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱培養(yǎng)倒置培養(yǎng)2h，待組織塊貼壁后，加入含20%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，培養(yǎng)1周左右，待細胞爬出融合后，用%的胰蛋白酶進行消化、傳代，VSMC鏡下見典型的“谷峰樣”生長特點，平滑肌α肌動蛋白(α-actin)免疫細胞化染色陽性，證實為VSMC。選3～5代對數(shù)生長期VSMC進行實驗。

實驗分組

取培養(yǎng)第3～5代的VSMC細胞30瓶，隨機分為３組：反義RNA組，對照組及空白組，每組10瓶細胞。分別實施(+)-CTGF(-)轉(zhuǎn)染、空白脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染以及空白處理。

(+)-CTGF(-)轉(zhuǎn)染VSMC

轉(zhuǎn)染前更換無血清培養(yǎng)基，待VSMC生長到50%～60%后，加入含有4μg(+)-CTGF(-)的轉(zhuǎn)染復合物，置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱孵育。4h后移除轉(zhuǎn)染復合物，加入無血清培養(yǎng)基，置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱孵育48h后，備用于指標檢測。

指標檢測

Westernblot檢測３組細胞CTGF表達和Akt磷酸化狀態(tài)。

取第3～5代VSMC長至次融合后，給予相應干預因素后，無血清DMEM培養(yǎng)24h，使細胞統(tǒng)一于G0期，加入700μＬ預冷的改良RIPA裂解緩沖液(Tris-HCl，50mmol/L，;NaCl，150mmol/L;NP-40，1%;脫氧膽酸鈉，%;SDS，%;EDTA，mmol/L;PMSF，mmol/L;Leupeptin，μg/mＬ)裂解細胞，冰浴30min，其間不時搖晃培養(yǎng)瓶;收集細胞，10000g4℃離心15min，上清液即為細胞提取物，保存樣品于-20℃?zhèn)溆谩CA-100蛋白質(zhì)定量測定試劑盒檢測總蛋白濃度。按分子克隆的操作進行免疫印跡雜交測定:取樣本30μg進行SDS電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉。1:500稀釋的抗CTGF多抗雜交4℃過夜，1:5000稀釋的辣根過氧化物酶標記的二抗雜交1h，ECL顯影液放射自顯影，以20min曝光時間較佳。圖像分析由TotalLab分析軟件進行光密度掃描。

甲基噻唑基四唑(MTT)比色法檢測各組VSMC增殖情況

第3代VSMC按5×104/mL接種于96孔培養(yǎng)板上，每孔mL，培養(yǎng)24h后進行各分組的相應處理，測定前2h加入MTT，置于37℃孵育箱中保溫2h以上，棄去上清液，加DMSO150μL/孔，使結晶物充分溶解，用酶聯(lián)免疫檢測儀于570nm處測定OD值。每培養(yǎng)板接種12孔，每天取1板，連續(xù)測7d，繪出生長曲線。

劃痕實驗檢測各組VSMC遷移情況

各組細胞接種于在35mm的培養(yǎng)皿中(2×105/mL)，待細胞匯合成單層用滅菌移液器頭在細胞上小心的做一個劃痕，PBS徹底漂洗3次，顯微鏡下拍照，然后加入含10μg/mL衣霉素的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，各組細胞于第24h觀察劃痕愈合情況，顯微鏡下拍照，選取3個不同的位置，用刻度尺測量劃痕寬度，計算平均值，根據(jù)這些數(shù)值計算劃痕愈合指數(shù)。劃痕愈合指數(shù)＝(初始劃痕寬度-愈合后劃痕寬度)/初始劃痕寬度。

統(tǒng)計學分析

各組細胞指標檢測內(nèi)容重復測量3次，所有數(shù)據(jù)以x±s表示，采用軟件，首先進行方差齊性檢驗，然后進行重復測量的方差分析進行比較分析，P＜為有統(tǒng)計學意義。

2結果

原代VSMC形態(tài)及細胞特異性蛋白免疫組化的鑒定

倒置相差顯微鏡下單個平滑肌細胞呈梭形或帶狀，有多個細胞突起，胞漿豐富，胞質(zhì)密度高，不透明，核卵圓形居中，有多個核仁。細胞生長致密時平行排列成束，部分重疊，表現(xiàn)為典型“谷峰狀”生長。培養(yǎng)第5代的細胞經(jīng)特異的平滑肌α-actin免疫細胞化學染色后，胞漿著色，呈陽性反應，高倍鏡下可見胞漿內(nèi)大量棕色、與細胞長軸平行的纖維細絲，即平滑肌α肌動蛋白絲，細胞來源于VSMC(見圖1)。

Westernblot檢測轉(zhuǎn)染后CTGF的表達

Westernblot結果顯示，反義RNA轉(zhuǎn)染組VSMC中CTGF的表達水平顯著低于對照組和空白組(P＜)，結果表明CTGF反義RNA轉(zhuǎn)染能夠有效的下調(diào)VSMC內(nèi)CTGF的表達(見圖2)。

MTT法測定下調(diào)CTGF表達對VSMC增殖的影響

大鼠的VSMC經(jīng)分離、培養(yǎng)和傳代后，取第3-5代VSMC，經(jīng)過相應因素處理后，MTT法檢測反義RNA組、對照組和空白組第1d至第7d細胞增殖狀況，繪制細胞增殖曲線，結果顯示CTGF反義RNA組VSMC的增殖較其它組受到顯著的抑制，表明下調(diào)VSMC內(nèi)CTGF的表達能夠明顯的抑制VSMC的增殖(見表1，圖3)。表1MTT法檢測第1～7d細胞增殖(OD值)因素

大鼠的VSMC經(jīng)分離、培養(yǎng)和傳代后，取第3-5代VSMC，經(jīng)過相應因素處理后，劃痕試驗法檢測反義RNA組、對照組和空白組0h及24h創(chuàng)口愈合情況，結果顯示CTGF反義RNA組VSMC的創(chuàng)口愈合較其它組受到顯著的抑制，表明下調(diào)VSMC內(nèi)CTGF的表達能夠明顯的抑制VSMC的遷移(圖4)。

Westernblot測定細胞Akt的表達和磷酸化水平

為了進一步探討下調(diào)CTGF表達后，VSMC增殖和遷移受到抑制的相關機制，我們通過使用Westernblot技術測定各組細胞內(nèi)Akt的表達以及磷酸化Akt的表達情況。Akt的活性是通過其磷酸化程度而得到實現(xiàn)的，我們的實驗結果顯示下調(diào)CTGF表達可降低Akt磷酸化的水平，而對Akt總量的表達無影響(圖5)。

3討論

CTGF最初是在血小板源性生長因子的誘導下從人臍靜脈內(nèi)皮細胞cDNA庫中克隆出來的，是一種富含半胱氨酸的分泌性多肽，其分子量為36～38kD。它廣泛表達于人類多種組織器官中，在病理情況下，其過度表達與某些增生性或纖維化疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關，如硬皮病、腎纖維化、肝硬化、肺纖維化、動脈粥樣硬化等［5］。研究表明［6］，CTGF能夠直接誘導結締組織細胞增殖和細胞外基質(zhì)合成，CTGF-mRNA及其蛋白質(zhì)在動脈粥樣硬化血管中的表達比在正常血管中高50～100倍。

VSMC是一種多功能性間葉細胞，其功能主要是通過收縮和舒張來維持血管壁的張力，通過增生和ECM，來維持血管的完整性。VSMC的增殖、遷移可導致新生內(nèi)膜形成，這在血管損傷修復后AS形成和發(fā)展的過程中起到了關鍵性的作用，如何有效的促進損傷血管壁的修復，抑制VSMC的過度增殖和遷移是控制動脈粥樣硬化進展的關鍵步驟［7］。

細胞增殖和遷移是一個嚴格的受控過程，受細胞內(nèi)外多種信號分子的調(diào)節(jié)。蛋白激酶B(Akt)是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，在細胞分化、細胞生長、細胞遷移等過程中具有重要的調(diào)節(jié)作用，目前的研究表明Akt的磷酸化水平增高可以促進細胞增殖和遷移［8］。本研究通過反義RNA技術能夠特異性的下調(diào)CTGF的表達，并且經(jīng)過進一步的實驗研究證實，下調(diào)CTGF的表達可以通過減少Akt的磷酸化來顯著降低VSMC的增殖和遷移能力。

CTGF在AS病變整個發(fā)生發(fā)展過程中起著的不同作用，本實驗初步探討了CTGF對VSMC增殖和遷移的影響，豐實了動脈粥樣硬化性缺血性腦血管病發(fā)病機制的研究。而AS的影響因素畢竟是多方面的，我們應繼續(xù)深入綜合研究其相關影響因素，為動脈粥樣硬化性腦血管病開辟有效的治療方法打下基礎。

【參考文獻】

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［3］CaiX.Regulationofsmoothmusclecellsindevelopmentandvasculardisease:currenttherapeuticstrategies［J］.ExpertRevCardiovascTher，2006，4(6):789-800.

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［5］GameBA，HeL.Pioglitazoneinhibitsconnectivetissuegrowth