新型人趨化素樣因子超家族8對(duì)人白血病細(xì)胞增殖和表皮生長(zhǎng)因子受體表達(dá)的影響【摘要】本研究探討新型趨化因子CKLFSF8對(duì)人白血病HL60細(xì)胞的增殖和表皮生長(zhǎng)因子受體表達(dá)的影響，應(yīng)用RTPCR方法檢測(cè)CKLFSF8基因在HL60細(xì)胞中的表達(dá)；利用脂質(zhì)體將CKLFSF8基因轉(zhuǎn)染到HL60細(xì)胞，在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)；MTT法檢測(cè)細(xì)胞的增殖程度；免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測(cè)CKLFSF8基因轉(zhuǎn)染前后HL60細(xì)胞EGFR的表達(dá)。結(jié)果表明：在細(xì)胞生長(zhǎng)過(guò)程中可檢測(cè)到CKLFSF8表達(dá)；CKLFSF8基因轉(zhuǎn)染前后HL60細(xì)胞的增殖受到了明顯的抑制，與空白對(duì)照組和空質(zhì)粒組相比有顯著性差異；對(duì)比轉(zhuǎn)染前后細(xì)胞EGFR表達(dá)的陽(yáng)性率具有顯著性差異。結(jié)論：CKLFSF8基因轉(zhuǎn)染對(duì)白血病細(xì)胞HL60的增殖和EGFR的表達(dá)有明顯抑制作用。

【關(guān)鍵詞】CKLFSF8；HL60細(xì)胞；細(xì)胞增殖；EGFR

EffectsofNovelHumanChemokinelikeFactorSuperfamily8onProliferationandEGFRExpressionofHL60Cells

AbstractThisstudywasaimedtoinvestigatetheeffectofchemokinelikefactorsuperfamily8(CKLFSF8)onproliferationandexpressionofepidermalgrowthfactorreceptor(EGFR)ofHL60cells.ExpressionofCKLFSF8mRNAonHL60celllinewasassayedbyRTPCR;thetargetgenewastransfectedintothecellsbylipidvector,cellproliferationwasdeterminedbyMTTassay,whileexpressionofEGFRinHL60wasdeterminedbyimmunocytochemicaltechnique.TheresultsindicatedthatexpressionofCKLFSF8existedinHL60cells.Aftertransfection,cellproliferationwasinhibited(P﹤)andtheexpressionofEGFRinHL60cellswasalsodiscoveredtobeinhibited(P﹤).ItisconcludedthattheproliferationandexpressionofEGFRinHL60cellscanbeinhibitedbytransfectionofCKLFSF8.Thenovelchemokinemayprovideanewapproachinthetreatmentofleukemia.

KeywordsCKLFSF8;HL60cell;cellproliferation;EGFR

趨化因子是一組具有趨化活性的小分子蛋白質(zhì),在炎癥、腫瘤、自身免疫性疾病、變態(tài)反應(yīng)及AIDS的演化等過(guò)程中發(fā)揮重要作用［1］。趨化素樣因子超家族成員8(chemokinelikefactorsuperfamily，CKLFSF8)是新近發(fā)現(xiàn)的新型人類(lèi)趨化因子。研究發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)細(xì)胞內(nèi)都有該因子的表達(dá)，在肝臟、肺臟和胰腺細(xì)胞內(nèi)高表達(dá)；CKLFSF8在某些腫瘤組織和腫瘤細(xì)胞中也有表達(dá)［2］，但有關(guān)CKLFSF8對(duì)腫瘤細(xì)胞表皮生長(zhǎng)因子影響的研究報(bào)道尚少。為了探討這種新的趨化因子在白血病的發(fā)生發(fā)展中的作用，我們選擇白血病細(xì)胞株HL60為研究對(duì)象，觀察新型細(xì)胞因子CKLFSF8對(duì)HL60的增殖和表皮生長(zhǎng)因子受體(epidermalgrowthfactorreceptor，EGFR)表達(dá)的影響。

材料和方法

菌株和質(zhì)粒

DH5α購(gòu)自Gibco公司。帶有目的基因片段CKLFSF8的質(zhì)粒和pEGFP由北京大學(xué)人類(lèi)疾病基因研究中心馬大龍教授惠贈(zèng)。人白血病限制性?xún)?nèi)切酶EcoRⅠ、BamHⅠ為T(mén)akaRa產(chǎn)品。質(zhì)粒提取試劑盒為Vegen產(chǎn)品。RPMI1640及TRIZOLRNA提取試劑為Gibco產(chǎn)品。RTPCR試劑為上海生物工程技術(shù)有限公司產(chǎn)品。小牛血清為杭州四季青生物工程材料有限公司產(chǎn)品。轉(zhuǎn)染試劑LipofectamineTM2000為Invitrogen公司產(chǎn)品。山羊抗人EGFR抗體為SantaCruz公司產(chǎn)品。免疫組織化學(xué)試劑盒為北京中杉生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品。

HL60細(xì)胞的培養(yǎng)和RNA的提取

將HL60細(xì)胞接種于含100ml/L小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液，置37℃5%CO2培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。取生長(zhǎng)旺盛的HL60細(xì)胞，按TRIZOL試劑盒說(shuō)明書(shū)提取腫瘤細(xì)胞總RNA。

HL60細(xì)胞CKLFSF8的檢測(cè)

采用RTPCR法，將HL60細(xì)胞總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。根據(jù)CKLFSF8mRNA序列設(shè)計(jì)引物，上游為3‘GCCTTCATGAGTCAAGGTCGT5‘，下游為5‘AGAGAGGTAGAAGACGAAGGC3‘。PCR反應(yīng)條件94℃7分鐘,94℃30秒,59℃30秒,72℃40秒,72℃7分鐘，共進(jìn)行35個(gè)循環(huán)。βactin做內(nèi)對(duì)照。10g/L瓊脂糖凝膠電泳，觀察擴(kuò)增產(chǎn)物片段。

質(zhì)粒擴(kuò)增和鑒定

制備感受態(tài)細(xì)胞，用質(zhì)粒－CKLFSF8進(jìn)行轉(zhuǎn)化，涂在含有氨芐青霉素的培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)12小時(shí)，挑取單個(gè)菌落，37℃震搖培養(yǎng)3小時(shí)，按質(zhì)粒提取試劑盒方法提取質(zhì)粒。將質(zhì)粒分別進(jìn)行EcoRⅠ單酶切和EcoRⅠ、BamHⅠ雙酶切。瓊脂糖電泳鑒定獲得的CKLFSF8基因片段。

CKLFSF8基因轉(zhuǎn)染HL60細(xì)胞

按試劑盒使用說(shuō)明書(shū)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。取1×106個(gè)處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HL60細(xì)胞，用無(wú)血清培養(yǎng)基洗2次，用500μl無(wú)血清培養(yǎng)基接種于6孔培養(yǎng)板，將2μg帶有目的基因片段CKLFSF8的質(zhì)粒與10μl脂質(zhì)體混合后緩慢均勻加到細(xì)胞表面，孵育5小時(shí)后更換2倍血清濃度的完全培養(yǎng)液，培養(yǎng)24小時(shí)。更換完全培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)48小時(shí)收獲細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)。首先以帶綠色熒光蛋白的質(zhì)粒pEGFP－CKLFSF8轉(zhuǎn)染HL60細(xì)胞來(lái)檢測(cè)轉(zhuǎn)染率。用熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染后綠色熒光蛋白表達(dá)的情況，計(jì)數(shù)10個(gè)視野的細(xì)胞，取平均值作為轉(zhuǎn)染率。然后分別設(shè)未轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的對(duì)照組、質(zhì)粒對(duì)照組和－CKLFSF8質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組。

HL60細(xì)胞增殖的檢測(cè)

將200μl105個(gè)轉(zhuǎn)染細(xì)胞和對(duì)照組細(xì)胞分別加入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每組3個(gè)復(fù)孔，37℃5%CO2培養(yǎng)48小時(shí),每孔加入MTT10μl,繼續(xù)培養(yǎng)4小時(shí)。小心吸出培養(yǎng)上清，每孔加入100μl二甲基亞砜，震蕩溶解顆粒,用酶標(biāo)檢測(cè)儀測(cè)定A570值。

CKLFSF8基因轉(zhuǎn)染HL60細(xì)胞前后EGFR表達(dá)的檢測(cè)

采用免疫細(xì)胞化學(xué)方法檢測(cè)。HL60細(xì)胞做細(xì)胞滴片，用800ml/L丙酮固定10分鐘，pHPBS沖洗，依次在標(biāo)本片上滴加1∶500稀釋的山羊抗人EGFR抗體，用PBS沖洗后，滴加辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的小鼠抗山羊二抗，DAB顯色，光學(xué)顯微鏡下觀察，陽(yáng)性細(xì)胞是被染成棕色的細(xì)胞，各觀察10個(gè)視野，計(jì)數(shù)200個(gè)細(xì)胞，計(jì)算EGFR陽(yáng)性表達(dá)率。

陽(yáng)性率=(陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù))×100%

統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)用SPSS軟件進(jìn)行t檢驗(yàn),用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±SD)表示。

結(jié)果

CKLFSF8基因在HL60細(xì)胞中的表達(dá)

白血病細(xì)胞株HL60總RNARTPCR結(jié)果顯示，在100-250bp之間出現(xiàn)單一電泳帶。根據(jù)所設(shè)計(jì)引物和GeneBank中CKLFSF8mRNA的序列，擴(kuò)增產(chǎn)物片段應(yīng)為187bp，與電泳帶符合。這說(shuō)明CKLFSF8基因在這種細(xì)胞中有表達(dá)。

Figure1.mRNAexpressionofCKLFSF8inHL60.Lane1:β－actin.Lane2:CKLFSF8fragment.M:markerDL2000.

CKLFSF8質(zhì)粒的酶切鑒定

質(zhì)粒CKLFSF8經(jīng)EcoRI單酶切得到該質(zhì)粒的全長(zhǎng)DNA片段，為6020bp。經(jīng)EcoRI和BamHI雙酶切得到長(zhǎng)度分別為5500bp和520bp兩個(gè)DNA片段，其中520bp片段為CKLFSF8基因。

Figure2.RestrictiveanalysisoftherecombinantplasmidCKLFSF8Lane1:CKLFSF8/EcoRI+BamHI.Lane2:CKLFSF8/EcoRI.M:DNAmarker.

CKLFSF8基因轉(zhuǎn)染對(duì)HL60細(xì)胞增殖的影響

與空質(zhì)粒對(duì)照組和空白對(duì)照組相比CKLFSF8質(zhì)粒組A570值顯著降低，而空質(zhì)粒組和空白組無(wú)顯著性差異。這說(shuō)明CKLFSF8對(duì)白血病細(xì)胞HL60有明顯抑制作用。

Table.EffectofCKLFSF8onproliferationofHL60cells

GroupHL60CKLFSF8±**±*Control±*P﹥comparedwithcontrolgroup；**P﹤comparedwithcontrolgroupand

CKLFSF8基因轉(zhuǎn)染對(duì)HL60EGFR表達(dá)的影響

熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染后綠色熒光蛋白的表達(dá)情況，并且經(jīng)過(guò)計(jì)算得出脂質(zhì)體介導(dǎo)的HL60細(xì)胞的轉(zhuǎn)染率是％。CKLFSF8質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HL60細(xì)胞前后EGFR表達(dá)的陽(yáng)性率比較，轉(zhuǎn)染前陽(yáng)性率為％，轉(zhuǎn)染后陽(yáng)性率為％,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說(shuō)明CKLFSF8對(duì)HL60細(xì)胞的EGFR表達(dá)有抑制作用。

討論

趨化因子是一組結(jié)構(gòu)相似的小分子蛋白質(zhì)，在蛋白質(zhì)水平上含有4個(gè)保守的半胱氨酸，根據(jù)前2個(gè)半胱氨酸的相對(duì)位置不同，可分為CXC、CC、C和CX3C4個(gè)亞家族，C代表半胱氨酸，X代表任一氨基酸［3］。北京大學(xué)人類(lèi)疾病基因研究中心從人單核細(xì)胞的前體細(xì)胞株U937細(xì)胞中分離出一種新的細(xì)胞因子命名為趨化素樣因子1(chemokinelikefactor1，CKLF1)［4］，因其氨基酸序列中有3個(gè)半胱氨酸，最后2個(gè)連續(xù)排列，呈CC家族趨化因子的特征性結(jié)構(gòu)，因此將其歸為CC家族趨化因子［5］。隨后運(yùn)用生物信息學(xué)的方法,又發(fā)現(xiàn)與CKLF1有同源性的其它8個(gè)基因,分別命名為趨化素樣因子超家族成員1-8(chemokinelikefactorsuperfamily1-8，CKLFSF18)［6］。其中，CKLFSF8基因位于第3號(hào)染色體，其cDNA全長(zhǎng)1185bp，其中第295816位核苷酸編碼173個(gè)氨基酸組成的CKLFSF8蛋白分子，該蛋白屬CKLF1超家族成員，包括4個(gè)跨膜區(qū)和1個(gè)MARVEL結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域與TM4SF結(jié)構(gòu)相似，且CKLFSF8與TM4SF有％氨基酸相同［3］。CKLFSF8分子有2個(gè)變異體，分別由173和115個(gè)氨基酸殘基組成。本實(shí)驗(yàn)就其中1個(gè)變異體即由173個(gè)氨基酸殘基組成的趨化因子進(jìn)行了研究。

在本實(shí)驗(yàn)中，利用含CKLFSF8的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HL60細(xì)胞，對(duì)轉(zhuǎn)染前后細(xì)胞株中該因子的表達(dá)情況進(jìn)行觀察。結(jié)果顯示，HL60細(xì)胞能表達(dá)CKLFSF8，轉(zhuǎn)染CKLFSF8后細(xì)胞內(nèi)CKLFSF8過(guò)表達(dá)，細(xì)胞的增殖明顯被抑制，與對(duì)照組相比有顯著性差異。

表皮生長(zhǎng)因子受體是一種位于細(xì)胞膜上的酪氨酸激酶受體，其編碼基因又稱(chēng)erbB1。EGFR與其配體結(jié)合后，通過(guò)自身磷酸化介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)一系列的生長(zhǎng)信號(hào)，促進(jìn)細(xì)胞增殖。同時(shí)EGFR還能促進(jìn)腫瘤部位新生血管的形成，而促進(jìn)腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移［7］。人類(lèi)的多種腫瘤細(xì)胞中也可見(jiàn)EGFR和其配體的高表達(dá)［8］。臨床研究顯示，針對(duì)EGFR的藥物和單克隆抗體能夠抑制腫瘤細(xì)胞的增殖［9］。因此，EGFR是與腫瘤生長(zhǎng)明顯相關(guān)的膜分子。為探討CKLFSF8轉(zhuǎn)染后細(xì)胞的增殖被抑制的可能機(jī)制，我們研究了轉(zhuǎn)染后細(xì)胞表面EGFR的表達(dá)，結(jié)果顯示CKLFSF8質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HL60細(xì)胞后EGFR表達(dá)明顯降低，與對(duì)照組相比，有顯著差異。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，趨化因子CKLFSF8基因可在HL60細(xì)胞株中表達(dá)，轉(zhuǎn)染該基因后白血病細(xì)胞過(guò)表達(dá)這種趨化因子，且該基因?qū)L60細(xì)胞表面EGFR的表達(dá)有明顯抑制作用，這提示CKLFSF8可能通過(guò)抑制HL60細(xì)胞EGFR的表達(dá)而達(dá)到抑制HL60細(xì)胞生長(zhǎng)的作用。

目前對(duì)于這種新型趨化因子的結(jié)構(gòu)已經(jīng)有了比較深入的了解，但是對(duì)于它的功能研究很少，后續(xù)還需作許多體內(nèi)外相關(guān)實(shí)驗(yàn)，比如趨化實(shí)驗(yàn)、動(dòng)物實(shí)驗(yàn)等，以便對(duì)這種新型趨化因子有更全面深入的了解，為這種新型趨化因子的應(yīng)用打下堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)。從對(duì)這種新型趨化因子的現(xiàn)有研究結(jié)果來(lái)看，有望對(duì)白血病的治療提供新的思路。

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