LightCycler480Software1.5軟件操作〔中文版〕第一局部根本界面及圖標(biāo)概述：一、Overview界面ExitLC480軟件Logoff：從目前使用的數(shù)據(jù)庫中退出并可登陸其他的數(shù)據(jù)庫Overview：點擊該圖標(biāo)進(jìn)入“Overview”界面Navigator：點擊該圖標(biāo)進(jìn)入“Navigator”界面，可進(jìn)展數(shù)據(jù)的導(dǎo)入導(dǎo)出等操作，詳見。。。。。。Save：點擊該圖標(biāo)進(jìn)展保存Export：導(dǎo)出當(dāng)前翻開的文件ClosePrintTools：翻開“Tools”界面，可進(jìn)展密碼修改，建立和編輯用戶，系統(tǒng)設(shè)置，查看數(shù)據(jù)庫狀態(tài)、儀器狀態(tài)、濾光片組合等操作Help：查看軟件版本，操作說明書等二、NewExperiment界面RunModulePCR程序及查看PCR實時數(shù)據(jù)SubsetEditor：點擊該模塊后可進(jìn)展子集的編輯SampleEditor：點擊后進(jìn)展樣品信息的編輯AnalysisModule:點擊進(jìn)展結(jié)果分析或查看已保存的分析結(jié)果ReportModule：選擇需要的內(nèi)容以報告的形式給出結(jié)果SummaryModule:查看試驗的總體概況，包括試驗名稱，所用的程序，檢測模式，濾光片組合等。概況的內(nèi)容由系統(tǒng)自動生成三、Navigator界面Import：導(dǎo)入一個文件Export：導(dǎo)出一個文件BatchImport：導(dǎo)入一批數(shù)據(jù)BatchExport：導(dǎo)出一批數(shù)據(jù)New：建一個試驗或文件夾NewFolder：建一個文件夾Open：翻開一個文件Rename：重命名Delete：刪除選中的目標(biāo)CopyNote：全部上述圖標(biāo)在深藍(lán)色時為激活狀態(tài)，灰色時為滅活狀態(tài)也就是不行用狀態(tài)。各圖標(biāo)的功能在不同狀態(tài)下以顏色來區(qū)分是否具備。軟件操作一．翻開軟件，Windows操作系統(tǒng)的用戶名為operator，密碼為LC480〔區(qū)分大小寫〕，電腦操作系統(tǒng)啟動完畢，檢查電腦右下角是否有 沒有，點擊桌面“Exor4forXDMS_R”快捷方式文件。然后右鍵點擊 圖標(biāo)，左鍵點擊“Show”一欄，如最終一句話顯示“Exor4serverisrunning”表示數(shù)據(jù)庫加載成功。假設(shè)顯示“Exor4failedtostart”則表示數(shù)據(jù)庫沒有加載上，關(guān)閉該窗口，右鍵點擊 圖標(biāo)，選“Shutdown”一欄，退出數(shù)據(jù)庫，重點擊桌面“Exor4forXDMS_T”文件，加載數(shù)據(jù)庫。然后點擊桌面“LightCycler480Software”快捷方式文件，運行該軟件?！?，LightCycler480〔區(qū)分大小寫〕，如用戶已經(jīng)建立用戶名，則可以依據(jù)用戶名登錄。二．用戶治理為了試驗結(jié)果的有效治理，可以建立不同級別的用戶。如: 標(biāo)準(zhǔn)用戶〔StandardUser〕、專業(yè)用戶〔ExpertUser〕、治理者〔LocalAdministrator〕。一般試驗室建議建立專業(yè)用戶〔ExpertUser〕用戶名，然后以該用戶名登錄軟件進(jìn)展試驗操作。建立用戶操作：翻開LightCycler480操作軟件，點擊右側(cè) 按鈕翻開“Tools”工具欄，選擇“UserAccess/UsersandGroups”選項。在右邊窗口中點擊“NewUser”鍵，在右邊“Entertheuser’sfullname”一欄中填寫用戶的全名，在“”Enterthenametheuserwantstologinas”一欄填寫用戶登錄名，在“Entertheuser’spassword”一欄中輸入密碼〔密碼須含有6個以上字母，1個以上數(shù)字，其中有至少一個字母大寫〕，在“Confirmthepassword”一欄中重輸入一次密碼，加以確認(rèn)，在“Selecttheuser’srole”一欄中選擇用戶級別，然后點擊右下方“Close”按鈕加以確認(rèn)。在 “Tools”工具欄中的“SystemSettings”界面中可以設(shè)置各用戶級的權(quán)限，以及密碼的時效。三．儀器自檢如放置了樣本，儀器右側(cè)指示燈變綠。在自檢時，不能放置反響板，否則自檢無法通過。四．建立試驗程序翻開LightCycler480操作軟件，成功登錄后點擊 按鈕，進(jìn)Protocol程序設(shè)置界面。在“DetectionFormat”一欄中選擇所使SYBRGreenI染料、MonoColorHydrolysisProbeTaqMan水解探針、MultiColorHydrolysisProbeTaqMan水解探針。點擊“√”確認(rèn)。

按鈕選擇用戶所承受的熒光檢測通道，在 一欄中填寫反響體積。在“Programs”界面中設(shè)置試驗程序：在“ProgramName”下方命名程序，“Cycles”一欄內(nèi)填寫該程序的循環(huán)數(shù)，在“AnalysisMode”一欄選擇該程序的分析模式。定量分Quantification”，溶解曲線分析選擇“MeltingCure，顏色補償試驗選擇“ColorCompensation”。而后在“TemperatureTargets”界面內(nèi)設(shè)置所指定程序的內(nèi)容，在“Target(℃)”處填寫目標(biāo)溫度，“AcquisitionMode”處選擇信號采集方式，“Hold”一欄填寫該溫度RampRate(℃/s)”處填寫升降溫速率〔50℃以下時，為了削減硬件的損耗，必需將降溫速率調(diào)至1.5℃/s以下〕。如一個程序有多個步驟，則在TemperatureTargets界面的左側(cè)處點擊 ，增加步驟；也可點擊上下箭頭各步驟的先后挨次。如一個試驗中有多個程序，也可在“Programs”界面左側(cè)點擊 ，增加程序，也可點擊上下箭頭調(diào)整各程序的先后挨次。試驗程度設(shè)置完成后，在下方“Overview”界面內(nèi)會自動生成溫度隨時間變化的溫圖檢查一下程度設(shè)置是否正確。設(shè)置好的試驗程序可以保存成模板文件，下次使用同樣的試驗程序時可以調(diào)用。具體操作如下：點擊 按鈕右側(cè)的下拉箭頭，選中“SaveAsTemplate”選項，系統(tǒng)默認(rèn)將試驗程序模板文件保存在所登錄的用戶名下“Templates”名目中，用戶可將其存放在其下的子名目“RunTemplates”下，填寫該程序模板文件的名稱，點擊“√”按鈕即完成保存。調(diào)用模板程序時可點擊“ApplyTemplate”按鈕，從名目樹中選定所要調(diào)用的模板，點擊“√”按鈕確認(rèn)。五．樣本設(shè)置1、樣本亞組編輯：LightCycler480軟件擁有一個獨特的樣本編輯治理功能——亞組編輯〔SubsetEditor〕，馬上反響板上全部的樣本依據(jù)用戶需要分成亞組，對亞組進(jìn)展獨立地分析定量。具體操作如下：在“NewExperiment”界面中，點擊左側(cè) 按鈕，進(jìn)入Subset設(shè)置界面，點擊按鈕建亞組，并給其命名。點擊 按鈕可復(fù)制所選定的亞組，點擊 改組的名稱，點擊“Delete”按鈕可刪除所選定的亞組。設(shè)置亞組：在Subsets界孔位中都消滅深蘭色凹陷的，點擊下方按鈕加以確認(rèn)。行程序都全都〔TaqMan水解探針時比較簡潔實現(xiàn)〕，由于各檢測工程均有各自的質(zhì)控比照，因而，設(shè)定亞組可以單獨對各檢測工程進(jìn)展分析。2．樣本屬性編輯點擊NewExperiment界面左側(cè) 置樣本信息。在“Workflow”一欄在選擇試驗方案：AbsQuant：確定定量或定性分析；RelQuant：相對定量；Scanning：基因掃描；ColorComp：顏色補償；Tm：熔解溫度檢測；MeltGeno：熔解曲線法基因分型；EndptGeno：終點法基因分型。SelectSamples/Subset選項中選定待編輯的樣本亞組：在界面右方編輯各樣本的名稱屬性等：96384孔板上的座標(biāo)位置；ReplOf：重復(fù)樣本設(shè)置；SampleName：樣本名稱；QuantificationSampleType：定量樣本類型；Concentration：濃度；TargetName：檢測類型?！?5個〕、陰性比照、陽性比照、未知樣本。各樣本的名稱可參考以上“SampleName”中的命名習(xí)慣表示標(biāo)準(zhǔn)品、NC表示陰性比照、Positive表示陽性比照、Sample表示待檢測的未知樣本〕，也可以自行編輯。在“QuantificationSampleType”一欄內(nèi)需要對各樣本的類型進(jìn)展明確地編輯〔標(biāo)準(zhǔn)StandardNegativeControlPositiveControl類Unknown類型〕，此外標(biāo)準(zhǔn)品系濃度的陽性樣本，其設(shè)定為StandardConcentration一欄中對各標(biāo)準(zhǔn)品分別設(shè)定其相應(yīng)的濃度，以及在Quant/Unitscopies、pg等。毒、沙門氏菌等。Of一欄中填寫該樣本其所重復(fù)的樣本的座標(biāo)號〔留意，只能填寫座標(biāo)號，不能填寫樣本名〕。PCR檢測試驗，則在SelectFilterCombinations一欄中選定各檢測通道，分別進(jìn)展樣本編輯。相應(yīng)較簡潔，可參考以下設(shè)置六．運行試驗試驗程序和樣本均設(shè)置完畢后，即可運行試驗，具體操作：進(jìn)入“NewExperiment”界面，點擊左側(cè) 按鈕，如反響板已經(jīng)放入儀器，儀器主機正面右側(cè)的會由桔黃色變?yōu)榫G色，軟件界面右下邊的這時點擊“StartRun”按鈕，軟件界面跳出一對話框提示用戶給該試驗文件命名，以保存試驗結(jié)果。一般建設(shè)用戶以時間命等。命名后點擊確認(rèn)鍵，儀器就開頭運行了，在運行過程中可觀看到溫度和熒光信號的變化曲線。如進(jìn)展試驗，可在熒光歷史“FluorescenceHistory”界面內(nèi)上的下拉菜單中切換不同的檢測通道，以分別觀看其擴增狀況。在試驗運行過程中，用戶可以依據(jù)需要，點擊“＋10Cycles”按鈕增加正在運行的程序10個循環(huán)，也可以點擊“EndProgram”按鈕終止正在運行的子程序，直接進(jìn)入下一個子程序。七．?dāng)?shù)據(jù)分析〔定性和定量〕LightCycler480軟件，成功登錄后點擊右側(cè) ，在名目樹內(nèi)選定之前已完成的試驗文件，點擊下方“Open”按鈕，或雙擊文件名翻開試驗文件，點擊左側(cè)按鈕，進(jìn)入分析界面。在“Createnewanalysis”窗口內(nèi)顯示了可使用的分析方法，在“Openexistinganalysis”窗口內(nèi)顯示已經(jīng)進(jìn)展分析的結(jié)果內(nèi)容。AbsQuant分析功能，其有兩種分析模式，2ndFitPoints點擬合法。選定分析功能類型后會跳出對話框，用戶可以自行選擇分析類型、選擇要分析的亞組〔Subset〕，以及命名分析結(jié)果〔Name〕。點擊“√”按鈕確認(rèn)。AbsQuant／2ndDerivativeMax，點擊“Calculate”按鈕，生該方法在反響體系優(yōu)化得比較成熟，信號噪音比較低時使用較好。FitPoints點擬合法加以人工調(diào)整。具體操作如下：AbsQuant／FitPoints，在“CycleRangeFirstCycle和Background”一欄設(shè)置熒光信號本底的區(qū)域，一般將熒光值呈S形曲線增長前趨于水平的循環(huán)區(qū)域作為背景本底區(qū)。點擊“NoiseBand”按鈕，上下移動紅色的噪音本底線來消退個別樣本由于信號噪音較高而對結(jié)果造成的影響。一般將紅線置于盡可能低，但又要足以蓋過陰性線和曲線不平的噪音線，與熒光信號曲線交于線性增長區(qū)。軟件只分析紅色噪音本底線上方的曲線數(shù)據(jù)，所以要確保其上方無曲折不平的噪音信號。點擊“Analysis”按鈕，再點擊“Threshold”按鈕，使用顯示“Auto”字樣，然后點擊下方 量分析，則會生成各標(biāo)準(zhǔn)曲線，以及各樣本的濃度值。點擊軟件右側(cè)的 分析結(jié)果保存入試驗文件，或在名目樹中另找保存位置。償功能來校正相鄰?fù)ǖ赖臒晒庑盘柛蓴_，詳見顏色補償一章。八．報告生成翻開一個分析完結(jié)果的文件，或者剛分析完結(jié)果并貯存后，點擊左側(cè)工具欄中General”和“Detailed”兩欄中選擇試驗報告所要包含的內(nèi)容?！癎eneral”一欄中顯示的選項為本次試驗結(jié)果均需要顯示的報告參數(shù)；“Detailed”一欄則顯示本次試驗屢次分析中所要的報告參數(shù)的明細(xì)。點擊“Generate”按鈕，生成報告預(yù)覽。點擊右上方“PDF”按鈕可將報告保存為*.pdf文件。報告顯示所包括的內(nèi)容可以保存成模板文件，同類報告要求的試驗可以調(diào)用一樣的報告模板。在“General”和“Detailed”兩欄中選定了內(nèi)容后點擊下方 箭頭，點擊“SaveAsTemplate”將其保存至Templates/ReportTemplates名目下，點擊“√”按鈕確認(rèn)。調(diào)用報告模板時點擊“ApplyTemplate”按鈕，選定模板文件，點擊“√”按鈕確認(rèn)。九．?dāng)?shù)據(jù)導(dǎo)出與導(dǎo)入該軟件所產(chǎn)生的試驗數(shù)據(jù)均保存在其自帶的數(shù)據(jù)庫中，從Windows操作系統(tǒng)中無法找到其試驗數(shù)據(jù)的文件。這樣可以很好地保護(hù)試驗文件不被誤刪和竊取。如用戶期望將試驗結(jié)果備份保存，可以將數(shù)據(jù)從數(shù)據(jù)庫中導(dǎo)誕生成可見的文件，保存于其它電腦中或本電腦的其它名目下。同時，也可以將試驗文件導(dǎo)入數(shù)據(jù)庫查看文件內(nèi)容或?qū)ξ募M(jìn)展分析。LightCycler480軟件，成功登錄后點擊右側(cè)圖標(biāo)，進(jìn)入Navigator導(dǎo)航界面，在名目樹內(nèi)選定試驗文件，點擊下方 擇保存文件的名目位置，點擊“Save”按鈕將文件導(dǎo)出。LightCycler480軟件，成功登錄后點擊右側(cè) 面，在名目樹內(nèi)選定要導(dǎo)出文件所在的文件夾，點擊 按鈕，在“SelectFolders”一欄中選定保存預(yù)導(dǎo)出文件的名目，點擊按鈕，將所要導(dǎo)出的文件名目均選至右側(cè)對話框，點擊 進(jìn)入“Target”界面，點擊“Browse”按鈕選定導(dǎo)出的文件所要存放的名目，點擊“Next”按鈕進(jìn)入點擊“Next”按鈕，進(jìn)入“Start”界面，點擊“Next”按鈕，軟件顯示文件導(dǎo)出的過程和狀態(tài)，完成后進(jìn)入“Done”界面，顯示導(dǎo)出文件的報告。點擊“Done”按鈕確認(rèn)。軟件，成功登錄后點擊右側(cè)圖標(biāo)，Navigator導(dǎo)航界面，在名目樹內(nèi)選定試驗文件，點擊下方“Import”按鈕，選定所要導(dǎo)入的文件，點擊“Open”按鈕，即導(dǎo)入該文件。LightCycler480軟件，成功登錄后點擊右側(cè) 圖標(biāo)，進(jìn)入Navigator導(dǎo)航界面，在名目樹內(nèi)選定試驗文件，點擊下方“BatchImport”按鈕，進(jìn)入“Source”界面，點擊“Add”按鈕選定待導(dǎo)入的文件所在的文件夾，點擊“Next”按鈕，進(jìn)入“Target”界面，選定放置導(dǎo)入文件的文件夾，點擊按鈕進(jìn)入“Start”界面，點擊“Next”按鈕，進(jìn)入“Status”界面，開頭導(dǎo)入文件，最終進(jìn)入“Done”界面，生成導(dǎo)入文件報告，點擊“Done”確認(rèn)。十．單點定標(biāo)做四至五個標(biāo)準(zhǔn)品來作標(biāo)準(zhǔn)曲線。第一輪檢測試驗成功完成后，可以將該試驗產(chǎn)生的標(biāo)準(zhǔn)曲線保存下來，下一輪檢測試驗時，只需選與第一輪試驗對應(yīng)的一種濃度的標(biāo)準(zhǔn)品參與試驗即可。在分析數(shù)據(jù)時可以調(diào)用第一輪的標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)展定量。據(jù)，最終得到數(shù)據(jù)結(jié)果后，點擊標(biāo)準(zhǔn)曲線下方“StdCurve(Inrun)”右側(cè)下拉前頭SpecialData\StdCurve文件夾下，點擊“√”按鈕確認(rèn)。已有標(biāo)準(zhǔn)曲線的調(diào)用：在使用單點定標(biāo)的檢測試驗中，所選用的一個標(biāo)準(zhǔn)品照舊定開頭無標(biāo)準(zhǔn)曲線生成，點擊“StandardCurve(InRun)”按鈕右側(cè)下拉箭頭，選中“StdCurve(external)”選項，雙擊所要調(diào)用的標(biāo)準(zhǔn)曲線文件，點擊“Calculate”按鈕，即可調(diào)用從前試驗中的標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)展本次試驗的定量分析。才能成功調(diào)用標(biāo)準(zhǔn)曲線。十一．相對定量試驗設(shè)計和分析完成。1、相像相對定量所謂相像相對定量是指默認(rèn)看家基因和靶基因這兩對引物的PCR擴增效率均為2.00Cp值的差值來推算濃度的差異。PCR手冊規(guī)定，PCR0.1的狀況下，可進(jìn)展相像相mRNA水平表達(dá)量變化的趨勢，假設(shè)其擴增效率差異超過0.1，則不能使用相像相對定量算法〔否則在很多期刊發(fā)文章時會被要求補試驗或重做定量試驗〕。消滅這種狀況時，方法一：重設(shè)計引物，優(yōu)化反響體系，使擴增效率差0.12。進(jìn)展相像相對定量時，可同時設(shè)定多個靶基因跟同一個看家基因進(jìn)展比較。如下ReferenceGeneTargetATargetB進(jìn)展相對定量。在建立了含有全部本次試驗中檢測樣本孔位的Subset后，點擊 鈕，在RelQuant相對定量界面內(nèi)設(shè)置樣本信息。A2A3A1位A2A3ReplofA1即可。在SampleName一欄填寫樣本名，留意，只要是加同一模板的反響孔位，均給其命名為一樣的樣本名。例如A1、B1、C1SampleName一欄中填寫一樣的樣本名，可以用鍵盤“Ctrl+CReferenceGene的樣本名，然后用鍵盤“Ctrl+VTargetGeneA和TargetGeneB的樣本名中，以確保所命名全都。另外，確定要設(shè)置陰性比照試驗PCRNCNTC〔NoTemplateControl〕SampleType一欄中分別選擇各樣本的不同類型?？醇一虻臋z測孔位均選擇帶ReferenceTarget的類型，如上圖。其中將即標(biāo)準(zhǔn)樣本，在相對定量計算時，其它樣本均與該標(biāo)準(zhǔn)樣本進(jìn)展比較，以得到基因表達(dá)量更多或更少的數(shù)據(jù)。一般可以將試驗中的空白比照樣本選為標(biāo)準(zhǔn)樣本，例如用不同的藥物A、B、C處理一批細(xì)胞，其它有一批細(xì)胞是正常培Calibrator，其它用藥組樣本Unkown，檢測看家基因的ReferenceUnknownTargetUnknown。陰性比照ReferenceNegativeTargetNegative。B-actin作為看家基因的話，在全部TargetNameB-actin；而靶基因以此類推，如上圖。2.00PCR反響程序，即可運行儀器，進(jìn)展試驗。試驗完畢后，可點擊左側(cè)的 按鈕，進(jìn)入分析界面，選擇RelativeQuantification分析數(shù)據(jù)，點擊 按鈕即可生成相對定量的數(shù)據(jù)。Negative樣本產(chǎn)生了擴增曲線，軟件會判定該試驗失敗，承受SYBRGreenI進(jìn)展試驗時，由于不行避開地產(chǎn)生一些非特異擴增和引物二聚表達(dá)象，往往會導(dǎo)致