基因克隆的基本理論及實(shí)驗(yàn)技術(shù)第一頁，共五十六頁，編輯于2023年，星期五課時(shí)及內(nèi)容安排第一課時(shí):基因克隆的基本概念及理論知識(shí)第二課時(shí):基因克隆的操作過程及注意事項(xiàng)第三課時(shí):實(shí)驗(yàn)操作過程演示(錄像)第二頁，共五十六頁，編輯于2023年，星期五第一課

基因克隆的基本概念及理論知識(shí)第三頁，共五十六頁，編輯于2023年，星期五基因克隆的定義：

1.工具書上：

插入有同一個(gè)基因或DNA片段的重組質(zhì)粒的一個(gè)群體，這個(gè)群體是由一個(gè)重組質(zhì)粒增殖而來，通過基因克隆技術(shù)可獲得某個(gè)基因或DNA片段的克隆。2.學(xué)術(shù)文獻(xiàn)上：基因克隆是指在體外對(duì)DNA按照即定目的和方案進(jìn)行人工重組,將重組DNA進(jìn)行擴(kuò)增以獲得目的基因的大量拷貝。它是將DNA或基因組的DNA片段嵌入克隆載體，再將載體植入培養(yǎng)的宿主細(xì)胞?？茖W(xué)家將這一過程稱為基因克?。夯虮磉_(dá)需有調(diào)節(jié)的DNA片斷控制，要使克隆到的基因能表達(dá)、發(fā)揮作用，必須將其與調(diào)節(jié)單位連接起來。第四頁，共五十六頁，編輯于2023年，星期五什么是基因？1、基因是存在于細(xì)胞內(nèi)有自體繁殖能力的遺傳單位。2、基因是一個(gè)具有遺傳功能的特定核苷酸序列的DNA片段。3、編碼一個(gè)RNA或一條多肽鏈的DNA片段稱為一個(gè)基因。4、基因是生物體遺傳的基本單位，存在于細(xì)胞的染色體上，作直線排列。5、基因通過指導(dǎo)蛋白質(zhì)的合成來傳遞遺傳信息，從而控制生物的性狀。第五頁，共五十六頁，編輯于2023年，星期五染色體、DNA與基因之間的關(guān)系第六頁，共五十六頁，編輯于2023年，星期五基因的結(jié)構(gòu)及其表達(dá)蛋白的過程翻譯蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)錄初級(jí)轉(zhuǎn)錄本（hnRNA）加工成熟mRNA加帽加poly（A）基因（DNA）轉(zhuǎn)錄起始調(diào)控區(qū)轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)外顯子內(nèi)含子轉(zhuǎn)錄終止點(diǎn)5’非翻譯區(qū)3’非翻譯區(qū)

RT-PCR雙鏈cDNA第七頁，共五十六頁，編輯于2023年，星期五RT-PCR擴(kuò)增基因的編碼區(qū)序列mRNA5’AAAAAAAAAAAAAAAAA3’3’TTTTTTTTTTTT5’RT反應(yīng)TTTTTTTTTTTT5’單鏈cDNA3’PCR擴(kuò)增3’3’5’5’第八頁，共五十六頁，編輯于2023年，星期五轉(zhuǎn)錄起始調(diào)控區(qū)（啟動(dòng)子區(qū)）的擴(kuò)增基因（DNA）轉(zhuǎn)錄起始調(diào)控區(qū)轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)外顯子內(nèi)含子轉(zhuǎn)錄終止點(diǎn)PCR擴(kuò)增3’3’5’5’啟動(dòng)子區(qū)序列第九頁，共五十六頁，編輯于2023年，星期五基因的編碼區(qū)及啟動(dòng)子區(qū)序列必須通過連接到質(zhì)粒上構(gòu)建成重組表達(dá)載體，然后進(jìn)行目的片段擴(kuò)增及功能研究。第十頁，共五十六頁，編輯于2023年，星期五什么是質(zhì)粒（Plasmid）？質(zhì)粒是染色體外能夠進(jìn)行自主復(fù)制的遺傳單位，包括真核生物的細(xì)胞器和細(xì)菌細(xì)胞中染色體以外的脫氧核糖核酸(DNA)分子?，F(xiàn)在習(xí)慣上用來專指細(xì)菌、酵母菌和放線菌等生物中染色體以外的DNA分子。在基因工程中質(zhì)粒常被用做基因的載體。許多細(xì)菌除了染色體外，還有大量很小的環(huán)狀DNA分子，這就是質(zhì)粒(plasmid)。第十一頁，共五十六頁，編輯于2023年，星期五質(zhì)粒的重要特征（1）是染色質(zhì)外的環(huán)形雙鏈DNA分子；（2）能自主復(fù)制，是能獨(dú)立復(fù)制的復(fù)制子；（3）質(zhì)粒對(duì)宿主生存并不是必需的；（4）質(zhì)粒上常帶有耐抗生素基因；

（5）質(zhì)粒DNA上有多個(gè)酶切位點(diǎn)。第十二頁，共五十六頁，編輯于2023年，星期五第十三頁，共五十六頁，編輯于2023年，星期五限制性核酸內(nèi)切酶限制性核酸內(nèi)切酶（restrictionendonuclease）:是從細(xì)菌中分離出來的一種識(shí)別并切割特異的雙鏈DNA序列的內(nèi)切核酸酶。目前已從多種細(xì)菌中分離出超過400種，識(shí)別各自不同的核苷酸順序。GAATTCCTTGGAAAGCTTTTCGAAEcoRIGCTTGGAATTCAHindIIIATTCGAAGCTTA第十四頁，共五十六頁，編輯于2023年，星期五限制性核酸內(nèi)切酶的命名法則限制性核酸內(nèi)切酶的命名：一般是以微生物屬名的第一個(gè)字母和種名的前兩個(gè)字母組成，第四個(gè)字母表示菌株(品系)。例如：EcoRI是從大腸桿菌EscherichiacoliRY13中第一個(gè)發(fā)現(xiàn)的內(nèi)切酶I。EEscherichia(屬)cocoli(種)RRY13(品系)I首先發(fā)現(xiàn)在此類細(xì)菌中發(fā)現(xiàn)的順序第十五頁，共五十六頁，編輯于2023年，星期五

DNA連接酶是1967年在三個(gè)實(shí)驗(yàn)室同時(shí)發(fā)現(xiàn)的，最初是在大腸桿菌細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的。它是一種封閉DNA鏈上缺口酶，借助ATP或NAD水解提供的能量催化DNA鏈的5’-PO4與另一DNA鏈的3’-OH生成磷酸二酯鍵將兩條緊鄰DNA鏈連接起來。DNA連接酶GAATTCCTTGGA連接酶GCTTGGAATTCA連接酶CTGGACATTTAACTGATTGACTAAOHPO4第十六頁，共五十六頁，編輯于2023年，星期五內(nèi)切酶和連接酶是基因克隆實(shí)驗(yàn)中兩種重要的工具酶，它們?nèi)缤肿由飳W(xué)家剪刀和針線，可以任意地將感興趣的基因片段進(jìn)行切割和連接，實(shí)現(xiàn)DNA序列的重組。第十七頁，共五十六頁，編輯于2023年，星期五質(zhì)粒(plasmid)和載體(vector)有什么區(qū)別？質(zhì)粒是指細(xì)菌細(xì)胞質(zhì)中的小型環(huán)狀DNA分子，是天然存在的，主要控制細(xì)菌的次級(jí)代謝。載體是指在基因工程中用以協(xié)載目的基因的小型環(huán)狀DNA分子，載體一般是經(jīng)過改造的質(zhì)粒，還包括病毒，部分高等生物細(xì)胞中的DNA。第十八頁，共五十六頁，編輯于2023年，星期五載體的種類克隆載體：一般是只用來在大腸桿菌中擴(kuò)增基因序列的拷貝數(shù)。表達(dá)載體：除了能擴(kuò)增基因序列的拷貝數(shù)之外，還能在原核或真核細(xì)胞中表達(dá)目的蛋白，也可用鑒定基因表達(dá)調(diào)控元件的功能。根據(jù)表達(dá)目的蛋白所使用啟動(dòng)子不同分為原核表達(dá)載體（原核啟動(dòng)子）和真核表達(dá)載體（真核啟動(dòng)子）。第十九頁，共五十六頁，編輯于2023年，星期五非定向克隆+或第二十頁，共五十六頁，編輯于2023年，星期五TA克隆載體第二十一頁，共五十六頁，編輯于2023年，星期五TTAA第二十二頁，共五十六頁，編輯于2023年，星期五酶切位點(diǎn)定向克隆的克隆載體第二十三頁，共五十六頁，編輯于2023年，星期五非定向克隆+克隆的片段只能按特定方向連接第二十四頁，共五十六頁，編輯于2023年，星期五EcoRI+HindIII切EcoRIHindIIIEcoRIHindIIIEcoRIHindIIIEcoRIHindIIIAAEcoRI+HindIII切PCR擴(kuò)增EcoRIHindIII第二十五頁，共五十六頁，編輯于2023年，星期五表達(dá)載體根據(jù)表達(dá)目的蛋白所使用啟動(dòng)子不同分為：原核表達(dá)載體（原核啟動(dòng)子）真核表達(dá)載體（真核啟動(dòng)子）第二十六頁，共五十六頁，編輯于2023年，星期五原核表達(dá)載體第二十七頁，共五十六頁，編輯于2023年，星期五真核表達(dá)載體第二十八頁，共五十六頁，編輯于2023年，星期五目的蛋白表達(dá)載體中的表達(dá)盒啟動(dòng)子（Promoter）基因編碼蛋白序列（CDS）轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)區(qū)（CDS）第二十九頁，共五十六頁，編輯于2023年，星期五基因克隆是將DNA或基因組的DNA片段嵌入克隆載體，再將載體植入培養(yǎng)的宿主細(xì)胞，進(jìn)行載體擴(kuò)增或表達(dá)蛋白。第三十頁，共五十六頁，編輯于2023年，星期五大腸桿菌大腸桿菌（Escherichiacoli，E.coli）革蘭氏陰性短桿菌，大小0.5×1～3微米。周身鞭毛，能運(yùn)動(dòng)，無芽孢。能發(fā)酵多種糖類產(chǎn)酸、產(chǎn)氣，是人和動(dòng)物腸道中的正常棲居菌，嬰兒出生后即隨哺乳進(jìn)入腸道，與人終身相伴，其代謝活動(dòng)能抑制腸道內(nèi)分解蛋白質(zhì)的微生物生長，減少蛋白質(zhì)分解產(chǎn)物對(duì)人體的危害，還能合成維生素B和K，以及有殺菌作用的大腸桿菌素。正常棲居條件下不致病。第三十一頁，共五十六頁，編輯于2023年，星期五第三十二頁，共五十六頁，編輯于2023年，星期五大腸桿菌在生物技術(shù)中的應(yīng)用大腸桿菌作為外源基因表達(dá)的宿主,遺傳背景清楚,技術(shù)操作簡單,培養(yǎng)條件簡單,大規(guī)模發(fā)酵經(jīng)濟(jì),倍受遺傳工程專家的重視.目前大腸桿菌是應(yīng)用最廣泛,最成功的表達(dá)體系,常做高效表達(dá)的首選體系。第三十三頁，共五十六頁，編輯于2023年，星期五生物安全性生物工程用的菌株是在不斷篩選后被挑選出的菌株。這些菌株由于失去的細(xì)胞壁的重要組分，所以在自然條件下已無法生長。甚至普通的清潔劑都可以輕易地殺滅這類菌株。這樣，即便由于操作不慎導(dǎo)致活菌從實(shí)驗(yàn)室流出，也不易導(dǎo)致生化危機(jī)。此外，生物工程用的菌株基因組都被優(yōu)化過，使之帶有不同基因型（例如β半乳糖甘酶缺陷型），可以更好的用于分子克隆實(shí)驗(yàn)。第三十四頁，共五十六頁，編輯于2023年，星期五基因克隆的實(shí)驗(yàn)常用菌株1：DH5a

常用于質(zhì)?？寺〉木辍Ｊ褂胮UC系列質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)化時(shí)，可與載體編碼的β－半乳糖苷酶氨基端實(shí)現(xiàn)α－互補(bǔ)?？捎糜谒{(lán)白斑篩選鑒別重組菌株。2：TOP10

該菌株適用于高效的DNA克隆和質(zhì)粒擴(kuò)增，能保證高拷貝質(zhì)粒的穩(wěn)定遺傳。3：HB101

該菌株遺傳性能穩(wěn)定，使用方便，適用于各種基因重組實(shí)驗(yàn)。4：JM109

該菌株在使用pUC系列質(zhì)粒載體進(jìn)行DNA轉(zhuǎn)化或用M13phage載體進(jìn)行轉(zhuǎn)染時(shí)，由于載體DNA產(chǎn)生的LacZa多肽和JM09編碼的LacZΔM15進(jìn)行α－互補(bǔ)，從而顯示β－半乳糖苷酶活性，由此很容易鑒別重組體菌株。5：BL21(DE3)

用于高效表達(dá)克隆于含有噬菌體T7啟動(dòng)子的表達(dá)載體（如pET系列）的基因。T7噬菌體RNA聚合酶位于λ噬菌體DE3區(qū)，該區(qū)整合于BL21的染色體上。該菌適合表達(dá)非毒性蛋白。第三十五頁，共五十六頁，編輯于2023年，星期五質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌的過程第三十六頁，共五十六頁，編輯于2023年，星期五基因克隆實(shí)驗(yàn)的一般過程獲得基因序列：通過RT-PCR或基因組數(shù)據(jù)庫獲得引物設(shè)計(jì)及PCR擴(kuò)增目的片段PCR產(chǎn)物連接到載體上構(gòu)建成重組載體重組載體轉(zhuǎn)化到大腸桿菌中進(jìn)行質(zhì)粒擴(kuò)增或表達(dá)蛋白第三十七頁，共五十六頁，編輯于2023年，星期五第二課

基因克隆的操作過程及注意事項(xiàng)第三十八頁，共五十六頁，編輯于2023年，星期五基因克隆實(shí)驗(yàn)室安全事項(xiàng)儀器設(shè)備的使用及維護(hù)實(shí)驗(yàn)試劑及安全性第三十九頁，共五十六頁，編輯于2023年，星期五儀器設(shè)備的使用及維護(hù)1.移液器(加樣槍)2.5μl10μl200μl1000μl

(1)根據(jù)液體體積使用盡可能小規(guī)格的槍；(2)吸取液體時(shí)應(yīng)緩慢，以防液體沖上來污染槍。(3)不要用吸收強(qiáng)酸液體（如濃鹽酸和濃硫酸）以防止腐蝕槍。應(yīng)用有刻度的玻璃吸管替代。(4)如較長時(shí)間不使用槍時(shí)應(yīng)將吸取刻度調(diào)至最大處，豎直置于架子上。第四十頁，共五十六頁，編輯于2023年，星期五2.離心機(jī)(1)樣品要保持平衡；(2)如低溫（4度）離心機(jī)應(yīng)先降溫后離心樣品；(3)使用間隙應(yīng)經(jīng)常蓋上，防止冷氣喪失。(4)使用最大離心速度應(yīng)略低于廠家規(guī)定的最大速度。第四十一頁，共五十六頁，編輯于2023年，星期五3.超凈工作臺(tái)(1)使用前開紫外燈照15至30分鐘，進(jìn)行殺菌處理；然后關(guān)上紫外燈打開照明燈和吹風(fēng)機(jī)吹5分鐘才能使用，以排除臭氧。(2)使用切記關(guān)上紫外燈，以燒傷皮膚；(3)使用完應(yīng)打紫外燈照15至30分鐘，一般情況下不需要開紫外過夜。第四十二頁，共五十六頁，編輯于2023年，星期五4.恒溫?fù)u床及培養(yǎng)瓶(1)先開電源開關(guān)，將速度調(diào)至最低處然后緩緩加速至所需速度，以防止培養(yǎng)瓶震出來，或瓶中培養(yǎng)液溢出。(2)瓶中培養(yǎng)液不能超過培養(yǎng)瓶最大體積的1/3，以防止液體溢出和保證菌培養(yǎng)所需的氣體空間。第四十三頁，共五十六頁，編輯于2023年，星期五5.恒溫培養(yǎng)箱工作時(shí)切記關(guān)上門，以保證溫度恒定和減少加熱器的工作時(shí)間。第四十四頁，共五十六頁，編輯于2023年，星期五6.水浴槽第四十五頁，共五十六頁，編輯于2023年，星期五8.電泳系統(tǒng)第四十六頁，共五十六頁，編輯于2023年，星期五分子克隆常用的有毒試劑

1.溴化乙錠:（Ethidiumbromide，EB）用來染DNA和RNA的染料,是一種致癌物質(zhì)；它是DNA突變的誘變劑，可以嵌入DNA，使DNA發(fā)生突變，致癌。有累積效應(yīng)，不要直接接觸，但是要注意通過呼吸攝入，故此環(huán)境要通風(fēng)。EB可以被皮膚吸收。做實(shí)驗(yàn)的時(shí)候一定要帶手套。但是，只要按照標(biāo)準(zhǔn)的操作使不會(huì)有問題的。嚴(yán)禁隨便丟棄。因?yàn)镋B是強(qiáng)致癌性，而且易揮發(fā)，揮發(fā)至空氣中，危害很大。

2.DEPC：DEPC即二乙基焦碳酸酯（diethylprocarbonate），可滅活各種蛋白質(zhì)，是RNA酶的強(qiáng)抑制劑；DEPC是一種潛在的致癌物質(zhì)，在操作中應(yīng)盡量在通風(fēng)的條件下進(jìn)行，并避免接觸皮膚。DEPC毒性并不是很強(qiáng)，但吸入的毒性是最強(qiáng)的，使用時(shí)戴口罩。不小心占到手上注意立即沖洗。第四十七頁，共五十六頁，編輯于2023年，星期五

3.苯酚：苯酚又名酚或石碳酸,為高毒類原漿毒物,對(duì)人體危害嚴(yán)重。它的濃溶液對(duì)皮膚有強(qiáng)烈的腐蝕性,苯酚所致的急性中毒常常造成死亡。4.氯仿：三氯甲烷，侵入途徑：吸入、食入、經(jīng)皮吸收。健康危害：主要作用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)，具有麻醉