法獲取目的基因演示文稿當前第1頁\共有21頁\編于星期三\6點（優(yōu)選）法獲取目的基因當前第2頁\共有21頁\編于星期三\6點PCR技術(shù)的定義及其發(fā)展歷史PCR技術(shù)的原理PCR的反應(yīng)體系和條件PCR法獲取目的基因PCR技術(shù)的未來展望當前第3頁\共有21頁\編于星期三\6點PCR技術(shù)多聚酶鏈式反應(yīng)

(PolymeraseChainReaction)

PCR技術(shù)即多聚酶鏈式反應(yīng)，又稱聚合酶鏈式反應(yīng)。是一種選擇性體外擴增DNA或RNA的方法。

在生物學(xué)實驗中做為基礎(chǔ)存在，可以說是現(xiàn)代分子生物學(xué)研究中最重要的技術(shù)。

當前第4頁\共有21頁\編于星期三\6點一、PCR技術(shù)的創(chuàng)建1.Khorana等1971年提出在體外經(jīng)DNA變性、與適當引物雜交、再用DNA聚合酶延伸,克隆DNA的設(shè)想。2.1983年,Mullis發(fā)明了PCR技術(shù),使Khorana的設(shè)想得到實現(xiàn)。3.1988年Saiki等將耐熱DNA聚合酶（Taq）引入了PCR技術(shù)。

4.1988年，第一臺PCR儀問世。5.1989年美國《Science》雜志比喻1989年為PCR爆炸年,Mullis榮獲1993年度諾貝爾化學(xué)獎。當前第5頁\共有21頁\編于星期三\6點二、PCR技術(shù)的原理

1.PCR技術(shù)在微量離心管中,加入適量的緩沖液,微量的模板DNA,四種脫氧核苷酸,耐熱性DNA聚合酶,一對合成DNA的引物,通過高溫變性、低溫退火和中溫延伸三個階段的循環(huán)合成DNA，每一次循環(huán)使特異區(qū)段的基因拷貝數(shù)放大一倍。一般樣品經(jīng)過30次循環(huán),可使基因的拷貝數(shù)達到數(shù)百萬。當前第6頁\共有21頁\編于星期三\6點

PCR原理

（1）類似于DNA的天然復(fù)制過程，其特異性依賴于寡核苷酸引物的存在

（3）重復(fù)“變性--退火--延伸”的循環(huán)，可獲得大量的新DNA鏈，而且這種新鏈又可成為下次循環(huán)的模板，從而指數(shù)級地獲得大量DNA產(chǎn)物，數(shù)小時內(nèi)可使目的基因的數(shù)量擴增數(shù)百萬倍。（2）PCR過程：由變性—復(fù)性（退火）--延伸三個基本反應(yīng)步驟構(gòu)成①變性：94℃左右，使雙鏈DNA模板解離成為單鏈；②復(fù)性：55℃左右，引物與模板DNA單鏈互補配對結(jié)合；③延伸：72℃左右，“模板-引物結(jié)合物”在DNA聚合酶作用下，以dNTP為原料，以靶序列為模板，按堿基配對與半保留復(fù)制原理，合成新的DNA鏈當前第7頁\共有21頁\編于星期三\6點2.PCR技術(shù)的特點1）速度快，靈敏度高：經(jīng)過30輪循環(huán)，理論上目的產(chǎn)物的擴增量達230個拷貝（109拷貝）。2）特異性：引物的序列及其與模板結(jié)合的特異性是決定PCR反應(yīng)結(jié)果的關(guān)鍵；引物設(shè)計的最大原則是最大限度地提高擴增效率和特異性，同時盡可能減少非特異性擴增。3）操作簡便易行：只需要數(shù)小時就可以用電泳法檢出1μg基因組DNA中僅含數(shù)個拷貝的模板序列。當前第8頁\共有21頁\編于星期三\6點三、PCR的反應(yīng)體系和基本步驟H2O

35μL10×PCR反應(yīng)緩沖液

5μL25mmol/LMgCl2

4μL4種dNTP

4μL上游引物（引物１）

0.5μL下游引物（引物２）

0.5μL模板DNA

(約1ng)

0.5μLTaq酶0.5μL

1.反應(yīng)體系組成成分（總體積：50L）當前第9頁\共有21頁\編于星期三\6點模板DNAdNTP引物BufferMg2+預(yù)變性模板DNAdNTP引物BufferMg2+TaqDNA聚合酶94℃5min2.基本程序PCR排管當前第10頁\共有21頁\編于星期三\6點Taq酶模板DNAdNTP引物BufferMg2+

循環(huán)儀94℃55℃72℃72℃5～7min循環(huán)25～35次擴增出的目標基因當前第11頁\共有21頁\編于星期三\6點瓊脂糖凝膠電泳轉(zhuǎn)移點樣進行電泳擴增出的目的基因當前第12頁\共有21頁\編于星期三\6點3.PCR反應(yīng)條件循環(huán)參數(shù)（1）預(yù)變性：94℃5min（2）變性：94℃20s-45s使雙鏈DNA解鏈為單鏈（3）退火：溫度由引物的解鏈溫度Tm決定，時間45s左右。增加溫度能減少引物與模板的非特異性結(jié)合；降低溫度可增加反應(yīng)的靈敏性。（4）延伸：一般為72℃，時間由擴增片段長度決定。（5）循環(huán)次數(shù)：主要取決于模板DNA的濃度，一般為25-35次次數(shù)過多，導(dǎo)致擴增效率降低，錯誤摻入率增加。到達平臺期所需循環(huán)次數(shù)取決于樣品中模板的拷貝數(shù)。（6）延伸補齊：72℃5min—10min當前第13頁\共有21頁\編于星期三\6點PCR技術(shù)的注意事項1.合理分隔實驗室將樣品的處理、配制PCR反應(yīng)液、PCR循環(huán)擴增及PCR產(chǎn)物的鑒定等步驟分區(qū)或分室進行，特別注意樣本處理及PCR產(chǎn)物的鑒定應(yīng)與其他步驟嚴格分開。2.吸樣槍由于操作時不慎將樣品或模板核酸吸入槍內(nèi)或粘上槍頭是一個嚴重的污染源，因而加樣或吸取模板核酸時要十分小心，吸樣要慢，吸樣時盡量一次性完成，忌多次抽吸，以免交叉污染或產(chǎn)生氣溶膠污染。3.試劑分裝所有的PCR試劑都應(yīng)小量分裝，-20℃保存，以減少重復(fù)加樣次數(shù)，避免污染機會。另外，PCR試劑和PCR反應(yīng)液應(yīng)與樣品及PCR產(chǎn)物分開保存。4.防止操作人員污染一次性手套、吸頭、小離心管應(yīng)一次性使用。當前第14頁\共有21頁\編于星期三\6點四、PCR法獲取目的基因當前第15頁\共有21頁\編于星期三\6點由TaqDNA聚合酶擴增的PCR產(chǎn)物中，其3’末端總是會帶有一個非模板依賴型的突出堿基，而且這個堿基幾乎總是A，因為TaqDNA聚合酶對dATP具有優(yōu)先聚合活性。由于該突出堿基的存在，克隆時可以使用T載體克隆目的基因。1.T載體克隆PCR獲取的目的基因當前第16頁\共有21頁\編于星期三\6點具有3‘-5’外切酶活性的DNA聚合酶（如pfu聚合酶），其擴增的PCR產(chǎn)物是平末端,要對這種平末端的PCR產(chǎn)物進行克隆,應(yīng)首先對PCR產(chǎn)物的3‘末端進行加A的工作。工作程序如下方案一膠回收平末端PCR產(chǎn)物，進入5μl10×TagDNAPolymeraseBuffer、4種dNTP或dATP（終濃度為200nM）、2.5UTagDNAPolymerase，加水至終反應(yīng)體積為50μl，72℃保溫10min，純化PCR片段后進行TA克隆方案二PCR反應(yīng)（50μl反應(yīng)體積）結(jié)束以后，加入1μl20mMdATP和2.5U的Tag酶，72℃保溫10min，然后進行直接進行TA克隆當前第17頁\共有21頁\編于星期三\6點2.設(shè)計酶切位點克隆PCR獲取的目的基因3’5’限制性內(nèi)切酶的識別序列目的基因的PCR片段3’5’限制性內(nèi)切酶的識別序列經(jīng)限制酶切割得到的具有粘性末端的線性載體經(jīng)限制酶切割得到粘性末端體外連接獲得目的基因的克隆當前第18頁\共有21頁\編于星期三\6點1、不對稱PCR2、反向PCR(reversePCR)3、多重PCR（復(fù)合PCR）4、LP-PCR（Labelledprimers)5、錨定PCR（anchoredPCR,A-PCR）6、PCR固相分析法7、原位PCR8、反轉(zhuǎn)錄PCR（RT-PCR)9、

熒光定量PCR（real-timePCR)

五、PCR的類型當前第19頁\共有21頁\編于星期三\6點熒光定位PCR技術(shù)（FQ-PCR）FQ-PCR的工作原理是利用Taq酶的5′→3′外切酶活性，在PCR反應(yīng)系統(tǒng)中加入一個熒光標記的探針。該探針可與引物包含序列內(nèi)的DNA模板發(fā)生特異性雜交，探針的5′端標以熒光報告基團，靠近3′端標以熒光淬滅基團，兩者之間構(gòu)成能量傳遞結(jié)構(gòu)。當PCR反應(yīng)每復(fù)制一個特異核酸片段，就有一個探針被切斷，伴隨一個熒光信號的釋放。由于被釋放的熒光基團數(shù)目和PCR產(chǎn)物是一對一的關(guān)系，因此用熒光檢測技術(shù)檢測出的熒光信號有無或強弱，即代表擴增產(chǎn)物有無或多少。由于熒光信號是代表擴增產(chǎn)物的有效特異信號,實現(xiàn)了儀器實時檢測，為新的PCR定量原理創(chuàng)造了條件。當前第20頁\共有21頁\編于星期三\6點PCR技術(shù)的應(yīng)用舉例：研究：基因克隆；DNA測序；分析突變；基因重組與融合；鑒定與調(diào)控蛋白質(zhì)結(jié)合DNA序列；轉(zhuǎn)座子插入位點的繪圖；檢測基因的修飾；人類基因組工程：用散布重復(fù)序列產(chǎn)生DNA標志