蘆葦根降糖活性成分篩選方案第一階段材料：蘆葦根儀器：粉碎機(jī)、40目篩、超聲波清潔機(jī)、真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀、鐵架臺(tái)、1000mL漏斗、燒杯、具塞試管、移液管、吸耳球、分光光度計(jì)試劑：95%乙醇、蒸餾水、二氯甲烷、乙酸乙酯、10%的乙醇、鹽酸小檗堿片20片DNS試劑的配制稱取1.625g3，5-二硝基水楊酸，加入2mol/l氫氧化鈉溶液81.25ml，丙三醇（甘油）11.25g，搖勻，加水定容至250ml，超聲助溶，待全部溶解并澄清后，冷卻全室溫，置棕色試劑瓶中備用。［2］。a-淀粉酶液的配制稱取0.0600ga-淀粉酶，用0.2mol/lpH6.5磷酸鹽緩沖溶液（PBS緩沖液）定容室100ml，超聲助溶，過(guò)濾，即得。該試劑宜現(xiàn)配現(xiàn)用。磷酸鹽緩沖液（pH6.5）取磷酸二氫鉀0.68g,加0.1mol/L氫氧化鈉溶液15.2ml，用水稀釋至100ml，即得。（一） 提取方法蘆葦根用粉碎機(jī)粉碎，過(guò)40目篩，取30g，超聲波提取，取95%乙醇按1:10加入，在350w下提取30min，提取液過(guò)濾，用真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀將濾液濃縮至1:2（g/ml）（二） 液-液萃取法（來(lái)自植物有效成分分離與應(yīng)用技術(shù)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)）取2mL濃縮液加入100mL蒸餾水用鐵架臺(tái)固定好1000mL漏斗，加入1中的萃取水溶液，再加入100mL二氯甲烷，振蕩?kù)o置待分離清晰后，打開(kāi)活塞，使下層的水層慢慢流出用燒杯接住，上層的二氯甲烷層從上口倒出，倒出的二氯甲烷用真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮40r，按照步驟3用二氯甲烷萃取3次。往漏斗中加入3步中的水層，再加入100mL乙酸乙酯，方法如3萃取3次分別將二氯甲烷層、乙酸乙酯層、水層用真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮（三） 活性跟蹤-活性測(cè)定確定有效部位目前，以酶或受體為靶點(diǎn)的藥物篩選已成為尋找新藥的關(guān)鍵途徑。本實(shí)驗(yàn)即采用體外對(duì)a-淀粉酶的抑制作用來(lái)評(píng)價(jià)降糖成分的降糖活性。a-淀粉酶（a-amylase）是一種內(nèi)切葡萄糖苷酶，能水解淀粉分子中的a-1，4-葡萄糖苷鍵，將淀粉逐級(jí)降解。在a-淀粉酶存在條件下，加入可溶性淀粉及供試品，通過(guò)測(cè)定被a-淀粉酶降解生成的還原糖的量來(lái)評(píng)價(jià)供試品的活性。濃縮液稀釋10倍作為高濃度組。以高濃度組稀釋5倍作為中濃度組。以高濃度組稀釋10倍作為低濃度組。二氯甲烷用小于10%的乙醇稀釋，乙酸乙酯用水稀釋。鹽酸小檗堿（陽(yáng)性對(duì)比）取鹽酸小檗堿片20片，稱量得總重為3.0744g，以每片含量0.100g計(jì)算得鹽酸小檗堿含量為65.05%。將藥片研為粉末，分別稱取0.7686g，0.0769g，0.0077g，定容至100ml，配制為5mg/ml、0.5mg/ml、0.05mg/ml溶液。4.3.2測(cè)定方法-重復(fù)3次在具塞試管中依次加入600〃g/ml的a-淀粉酶液lml，供試液lml，20mg/l可溶性淀粉溶液1ml，混勻后，37°C水浴反應(yīng)。每管精確計(jì)時(shí)20min以加入DNS試劑5ml終止反應(yīng)。沸水浴5min顯色，冷卻全室溫后，在540nm處測(cè)定吸光度值。此為A樣本抑制率（E）A=［、—AQ—（A樣本—本底基P］/（七廠AQX100%式中:Emin為以水代替供試液和a-淀粉酶，Emax為以水代替供試液，本底基數(shù)為以水代替可溶性淀粉溶液。*DNS試劑的配制稱取1.625g3，5-二硝基水楊酸，加入2mol/l氫氧化鈉溶液81.25ml，丙三醇（甘油）11.25g，搖勻，加水定容至250ml，超聲助溶，待全部溶解并澄清后，冷卻全室溫，置棕色試劑瓶中備用。［2］。a-淀粉酶液的配制稱取0.0600ga-淀粉酶，用0.2mol/lpH6.5磷酸鹽緩沖溶液（PBS緩沖液）定容室100ml，超聲助溶，過(guò)濾，即得。該試劑宜現(xiàn)配現(xiàn)用。磷酸鹽緩沖液（pH6.5）取磷酸二氫鉀0.68g,加0.1mol/L氫氧化鈉溶液15.2ml，用水稀釋至100ml，即得。（四）化學(xué)成分預(yù)實(shí)驗(yàn)-定性測(cè)定甾體或三萜類氯仿-濃硫酸反應(yīng)試劑：氯仿、濃硫酸方法：將樣品殘?jiān)?ml氯仿溶解，加1ml濃硫酸，如氯仿層有紅或青色反應(yīng)，硫酸層有綠色熒光出現(xiàn)，表明含有甾體或三萜類。揮發(fā)油和油脂一般檢查將提取液滴于濾紙上，如濾紙上的斑點(diǎn)經(jīng)揮發(fā)消失，就可能含有揮發(fā)油。如果不消失，則有可能含有油脂。生物堿沉淀反應(yīng)碘化鉍鉀取水溶液加鹽酸至酸性，加碘化鉍鉀試劑，產(chǎn)生橘紅色或黃色沉淀黃酮類三氯化鋁試劑：1%三氯化鋁乙醇溶液或5%三氯化鋁水溶液方法：將樣品點(diǎn)在紙上，噴灑該試劑，干燥后黃色斑點(diǎn)于紫外熒光燈下觀察顯明顯熒光。醌類Borntragers反應(yīng)試劑：10%氫氧化鉀水溶液方法:：將樣品點(diǎn)在紙上，噴灑該試劑，醌類物質(zhì)呈黃、橙、紅色熒光。酚類化合物和腹質(zhì)試劑：0.5g三氯化鐵溶解于50ml水中方法：將樣品點(diǎn)在紙上，噴灑該試劑，立即呈明顯的藍(lán)色斑點(diǎn)。有機(jī)酸類漠酚藍(lán)反應(yīng)試劑：0.1%漠酚藍(lán)溶液方法：將樣品點(diǎn)在紙上，噴灑該試劑，立即在藍(lán)色背景上呈黃色的斑點(diǎn)。氨基酸、肽和蛋白質(zhì)類雙縮脲反應(yīng)試劑：1%硫酸銅和40%氫氧化鈉溶液等量混合方法：取1ml水浸出液加入上述試劑，搖動(dòng)，冷時(shí)呈紫紅色，表示可能有蛋白質(zhì)或肽。茚三酮反應(yīng)試劑：0.2%茚三酮的乙醇溶液方法：將樣品點(diǎn)在紙上，噴灑該試劑，在100°C左右的烘箱中放置2分鐘，可看見(jiàn)藍(lán)或藍(lán)紫色斑點(diǎn)。表明有氨基酸或多肽。糖、多糖和苷類a-萘酚試劑反應(yīng)（Molish反應(yīng)）試劑：5%a-萘酚乙醇溶液，濃硫酸方法：取熱水提液1ml于試管中，加5%a-萘酚乙醇溶液2-3滴，搖勻，沿管壁慢慢加入0.5ml濃硫酸，如在試液和濃硫酸的交界處很快形成紫色環(huán)，表明樣品中含有糖、多糖或苷類。皂苷類泡沫試驗(yàn)皂苷的水溶液劇烈振搖產(chǎn)生細(xì)微的持久性泡沫，因?yàn)樵碥站哂斜砻婊钚?。（五?分離（液-液萃取法）確定了有效部位，就知道用那種溶劑來(lái)萃取（六） 純化（大孔吸附純化）大孔吸附樹(shù)脂的預(yù)處理以95%乙醇浸泡樹(shù)脂24h,充分溶脹后，除去上浮樹(shù)脂碎片和雜物，用濕法裝柱,繼續(xù)用95%乙醇以適當(dāng)流速通過(guò)樹(shù)脂柱，洗全流出液與水（1：5）混合不呈渾濁，再用水洗全無(wú)醇味，備用。上樣、洗脫：樣品液以1mL/min流速上柱，吸附1次，吸附90min后，收集過(guò)柱液。用10倍量蒸餾水洗至無(wú)色，用5倍0.1%NaOH