怎樣選擇色譜柱液相色譜柱的種類與方法開發(fā)第一頁，共三十九頁，編輯于2023年，星期六內(nèi)容概要色譜基本概念回顧色譜柱類型、選擇和方法開發(fā)第二頁，共三十九頁，編輯于2023年，星期六色譜基本概念回顧

第三頁，共三十九頁，編輯于2023年，星期六色譜（chromatography）色譜原理色譜分類：氣相/液相和高效液相（HPLC）；反相/正相/離子交換/HILIC/混合固定相色譜功能：分析（種類/定量），純化液相色譜儀器結(jié)構(gòu)及功能：泵，脫氣機(jī)，混合器，進(jìn)樣器（閥），色譜柱，柱溫箱，檢測器（流通池）第四頁，共三十九頁，編輯于2023年，星期六分離度

Rs-ResolutionN–TheoreticalPlateNumberα–Selectivityk–RetentionFactor拖尾第五頁，共三十九頁，編輯于2023年，星期六1.SeparationofCompoundsAandB第六頁，共三十九頁，編輯于2023年，星期六靈敏度ＬＯＤ：LimitofDetectionＬＯＱ：LimitofQuantification

－柱效－峰形（拖尾因子）

第七頁，共三十九頁，編輯于2023年，星期六重現(xiàn)性分離度（Ｒ）－保留時間（Ｖ，Ｔ，Ｋ）－選擇性（α）－柱效（Ｎ）靈敏度

第八頁，共三十九頁，編輯于2023年，星期六色譜柱類型、選擇和方法開發(fā)第九頁，共三十九頁，編輯于2023年，星期六色譜柱與色譜條件對色譜性能的影響分離度《

-選擇性〈鍵合類型，基質(zhì)表面特性；流動相、溫度

-柱效〈保留體積，粒徑，柱長，基質(zhì)表面特性；流動相，溫度，上樣量，流速峰對稱性《基質(zhì)表面特性，鍵合類型，流動相，溫度保留體積《柱長，孔隙率，比表面積，基質(zhì)表面特性，鍵合類型；流動相，溫度靈敏度《粒徑，基質(zhì)表面特性，鍵合類型；流動相，溫度穩(wěn)定性和重現(xiàn)性《基質(zhì)表面特性，鍵合類型；流動相，溫度流動相《

pH，緩沖鹽種類，溶劑；第十頁，共三十九頁，編輯于2023年，星期六影響色譜柱性能的主要因素1、色譜柱的構(gòu)型

色譜柱內(nèi)徑色譜柱長度2、

固定相柱填料粒徑比表面積孔徑孔隙率基質(zhì)表面特性：

-表面活性：硅膠純度、硅羥基的酸性、均勻性和數(shù)量-耐堿性鍵合類型-官能團(tuán)、是否封尾

-鍵合相的保留行為、耐酸性第十一頁，共三十九頁，編輯于2023年，星期六色譜柱的構(gòu)型對色譜柱性能的影響第十二頁，共三十九頁，編輯于2023年，星期六色譜柱的構(gòu)型對色譜柱性能的影響：長度和直徑色譜柱尺寸對色譜分離的影響：?短柱(15-100mm)-運(yùn)行時間短,柱壓低

?長柱(150-250mm)-分辨率高,運(yùn)行時間長

?窄徑柱(2.1mm)–滿足檢測器和樣品量限制

?寬徑柱(3-7.8mm)-載樣量高，抗污染，壽命

制備柱

(內(nèi)徑>10mm)–用于純化制備第十三頁，共三十九頁，編輯于2023年，星期六柱填料對色譜柱性能的影響第十四頁，共三十九頁，編輯于2023年，星期六柱填料對C18色譜柱性能的影響：粒徑

硅膠粒徑和類型對柱效的影響d硅膠粒徑和類型對壓力的影響第十五頁，共三十九頁，編輯于2023年，星期六柱填料對C18色譜柱性能的影響：粒徑II

目前市場主要可供選擇的填料粒徑1.7μm，1.8μm，2.2μm－快速液相色譜柱：匹配快速色譜儀

2.7μm－多孔殼層：在常規(guī)液相色譜儀上實現(xiàn)快速分離(Halo)3.0μm，3.5μm－普通快速分析5.0μm－常規(guī)分析顆粒越小，柱效越高,但是耐污染性能下降，柱壓升高.第十六頁，共三十九頁，編輯于2023年，星期六柱填料對C18色譜柱性能的影響：比表面積

每克填料的表面積，與粒度，孔徑有關(guān)比表面積大，保留增加，載樣量增加，平衡時間增加(梯度洗脫尤為注意)根據(jù)需要選擇合適的比表面積第十七頁，共三十九頁，編輯于2023年，星期六柱填料對C18色譜柱性能的影響：孔徑I

多孔材料的95%以上表面在孔內(nèi)部樣品分子直徑小于平均孔徑，才能進(jìn)入微粒內(nèi)部孔徑至少是樣品流體學(xué)直徑的4倍

300?孔徑用于：超過50個氨基酸的肽或25個殘基的低聚寡核苷酸樣品分子直徑小于平均孔徑，才能進(jìn)入微粒內(nèi)部第十八頁，共三十九頁，編輯于2023年，星期六柱填料對C18色譜柱性能的影響：孔徑II

由于小孔徑填料比表面積大，小分子的保留值在小孔徑填料通常更大條件： C8色譜柱，4.6×150mm， 3.5um，A溶劑，0.1%TFA水溶液；B溶劑，0.1%TFA于80%乙腈－

水中；20min梯度，10 30%B；60°C， 1.5ml/min第十九頁，共三十九頁，編輯于2023年，星期六柱填料對C18色譜柱性能的影響：硅膠純度I2.3-二羥基萘2.7-二羥基萘TF=1.31BrandW,AQColumn5μm,4.6mm×150mm

BrandZ,C18Column5μm,4.6mm×150mm

VenusilMPC185μm,4.6mm×150mmBrandH,C18Column5μm,4.6mm×150mmBrandU,C18Column5μm,4.6mm×150mm！TF=1.42TF=1.39TF=1.69TF=？流動相：

甲醇：水=65：35流速：

1mL/min溫度： 35℃檢測波長： 230nm進(jìn)樣量： 20μL硅膠純度－金屬含量第二十頁，共三十九頁，編輯于2023年，星期六硅膠基質(zhì)類型及發(fā)展史TypeA：原料來源：水玻璃；高金屬含量，高活性，極性化合物容易形成拖尾和死吸附TypeB：原料來源：有機(jī)硅烷（四乙氧基硅烷）水解/燒結(jié)/酸洗雜化及表面雜化整體柱殼層柱第二十一頁，共三十九頁，編輯于2023年，星期六柱填料對C18色譜柱性能的影響：硅膠純度II

硅膠純度－金屬含量d第二十二頁，共三十九頁，編輯于2023年，星期六固定相對色譜柱性能的影響：硅羥基的影響殘余硅羥基的影響普通硅膠當(dāng)流動相的pH值大于4.5-5.0時，表面的硅羥基會帶負(fù)電荷，堿性化合物拖尾。解決方法封尾雙層表面修飾表面雜化第二十三頁，共三十九頁，編輯于2023年，星期六固定相對色譜柱性能的影響：殘余硅羥基的影響封尾鍵合填料與小硅烷進(jìn)行后續(xù)反應(yīng)，如三甲基氯硅烷，反應(yīng)掉部分殘余硅羥基，以增加表面覆蓋率。缺點(diǎn)：不能完全反應(yīng)（仍有50%的硅羥基未被反應(yīng)）在pH<3時，TMS易流失，耐用性，穩(wěn)定性不好TMS第二十四頁，共三十九頁，編輯于2023年，星期六固定相對色譜柱性能的影響：殘余硅羥基的影響不同長度和體積的鍵合相對表面覆蓋率的影響第二十五頁，共三十九頁，編輯于2023年，星期六固定相對色譜柱性能的影響：殘余硅羥基的影響雙層表面修飾降低表面硅羥基活性，硅膠表面更加均勻第二十六頁，共三十九頁，編輯于2023年，星期六固定相對色譜柱性能的影響：殘余硅羥基的影響硅膠雙層表面修飾后

新增加表面層硅羥基活性更低－新硅羥基pH=5.2，普通硅羥基pH約為3.5更對稱的峰型，提高柱效，提高靈敏度

硅膠表面更均勻－硅膠微晶形成過程中的不光滑表面被覆蓋重現(xiàn)性更好

表面純度更高－硅膠金屬雜質(zhì)被覆蓋極性化合物保留和分離更好第二十七頁，共三十九頁，編輯于2023年，星期六鍵性化合物峰形對比

Testconditions:Columndimension:4.6mmx150mmSample:doxepin,nortriptyline,trimipramineamitriptylineMobilephase:Acetonitrile/0.01Msodiumphosphate(pH=6)=70/30Temperature:30oCFlow:1mL/minDetection:UV254nmBrandAC18(non-endcapped,)C18(non-endcapped,twin-layer第二十八頁，共三十九頁，編輯于2023年，星期六ASBC18ZorbaxSBC18SaponinsExtract

4.6x150mmcolumn,1%formicacid/MeOH=80/20第二十九頁，共三十九頁，編輯于2023年，星期六固定相對色譜柱性能的影響：殘余硅羥基的影響雙層表面修飾代表產(chǎn)品：StableBondC18，PolarBondC18，SurfBondC180.01ng/mLPseudoephedrineAUMIBauloStableBondC18,2.1×50mm,5μmBrand

A

C182.1×50mm,5μmPhenomenexLunaC18,2.0×50mm,5μm第三十頁，共三十九頁，編輯于2023年，星期六固定相對色譜柱性能的影響：鍵合類型A縱向交聯(lián)：保留和選擇不穩(wěn)定B橫向交聯(lián)：寬pH適用C單體鍵合：重現(xiàn)性好，柱效高D單體（空間保護(hù)）：低pH穩(wěn)定Ｅ極性官能團(tuán)嵌合反相固定相第三十一頁，共三十九頁，編輯于2023年，星期六固定相對色譜柱性能的影響：

基質(zhì)表面特性+鍵合類型〉反相鍵合相的保留行為同一廠家相同硅膠基質(zhì)的反相柱：

保留值隨含碳量的增加而增加比表面積越大，保留值越大鍵合碳鏈越長，保留越大C18

C8>C3>C1，長鏈之間差別不大≈第三十二頁，共三十九頁，編輯于2023年，星期六反相鍵合相的保留行為不同廠家色譜柱的保留值，選擇性與峰型色譜柱：4.6*150mm，流動相：乙腈－0.05M磷酸鉀緩沖液，pH3.2(65:35);流速：1ml/min，拖尾峰T0（尿嘧啶）P:

吡啶L:

苯酚N:

N,N-二甲基苯胺

B:

4-丁基苯甲酸J:

甲苯第三十三頁，共三十九頁，編輯于2023年，星期六固定相對色譜柱性能的影響：

基質(zhì)表面特性+鍵合類型〉鍵合相的穩(wěn)定性鍵合相的穩(wěn)定性

低pH值，鍵合相流失高pH值，硅膠溶解影響色譜柱壽命，方法不重現(xiàn)

第三十四頁，共三十九頁，編輯于2023年，星期六鍵合類型對鍵合相穩(wěn)定性影響低pH值，鍵合相流失第三十五頁，共三十九頁，編輯于2023年，星期六鍵合類型對鍵合相穩(wěn)定性影響（II）空間位阻保護(hù)，延緩鍵合相流失第三十六頁，共三十九頁，編輯于2023年，星期六固定相對色譜柱性能的影響：鍵合硅膠的穩(wěn)定性高pH