細胞工程之種質保存技術要點植物種質：植物親代通過生殖細胞或體細胞傳遞給后代的遺傳物質植物種質資源：攜帶各種不同遺傳物質的植物總稱種質資源是育種、開發(fā)利用以及科學研究的重要物質基礎，故世界各國均非常重視植物種質資源的考察、收集、保存植物種質plant

germplasm據美國《時代》雜志網站報道，距北極點約1000公里的挪威斯瓦爾巴群島的一處山洞中有一座“世界末日種子庫”假設有一天地球上發(fā)生毀滅性的災難，那時幸存的人類就可以取出種子庫中存放的種子植物諾亞方舟傳說中的諾亞方舟“植物諾亞方舟”據介紹，挪威政府興建的全球種子庫有兩個特點一是建在凍土地帶的巖石中，幾乎不受氣候變化的影響（-18℃），且能抵御原子彈爆炸和強烈地震二是位置高于海平面１３０米左右，即便格陵蘭的冰蓋和南極洲的冰層完全融化，也不會被淹沒世博會---英國館“種子殿堂”由6萬根蘊含植物種子的透明亞克力桿組成所有的種子都來自‘千年種子銀行項目’植物為人類提供了氧氣、食物、藥品和建材，然而到本世紀末，它們中的2/3卻面臨永遠地滅絕的危險。如果氣溫升高兩度，那么15%到40%的植物將滅絕。種子銀行的主要功能是進行物種儲存，一旦某個植物物種滅絕，種子銀行就可隨時起用其種子，讓這個物種得以恢復。為什么要保存種子？在適宜的環(huán)境條件下，貯存植物種質，使其保持生命力與遺傳性的技術一般有2種方式就地保存：通過建立自然保護區(qū)、森林公園等來實現(xiàn)種質保存的目的遷地保存：通過建立植物園、種質資源圃、種子庫、離體保存等方法來實現(xiàn)植物種質保存世界第一個保護區(qū)、1872年、美國黃石公園西安周至金絲猴保護區(qū)白河川金絲猴保護區(qū)沿渡河金絲猴保護區(qū)紅拉山滇金絲猴保護區(qū)巴東縣沿渡河金絲猴自然保護區(qū)芒康滇金絲猴國家級自然保護區(qū)西安金絲猴自然保護區(qū)金絲猴自然保護區(qū)臥龍大熊貓自然保護區(qū)王朗大熊貓自然保護區(qū)佛坪大熊貓自然保護區(qū)勿角大熊貓自然保護區(qū)甘肅隴南文縣白水江大熊貓自然保護區(qū)文縣尖山大熊貓自然保護區(qū)武都裕河大熊貓自然保護區(qū)迭部多兒大熊貓自然保護區(qū)阿夏大熊貓自然保護區(qū)彭州白水河國家級大熊貓自然保護區(qū)崇州鞍子河大熊貓自然保護區(qū)都江堰龍溪虹口國家級大熊貓自然保護區(qū)

四川臥龍大熊貓自然保護區(qū)江蘇大豐麋鹿國家級自然保護區(qū)可可西里自然保護區(qū)蘇鐵自然保護區(qū)九寨溝國家級自然保護區(qū)彩林植物西鄂爾多斯珍稀植物自然保護區(qū)現(xiàn)有的自然保護區(qū)中，國家級自然保護區(qū)243個，占保護區(qū)總數(shù)的10.34%，地方級保護區(qū)中省級自然保護區(qū)773個，地市級保護區(qū)421個，縣級自然保護區(qū)912個植物園種質資源圃種子庫無論是就地保存還是建立植物園和苗圃，均會耗費大量的土地以及人力物力還有可能受病蟲害及其他自然災害的影響使植物種質遭受損失種子貯存是最常用的種質保存方法在一定范圍內，種子的濕度每降低1%，保存時間翻番；同樣，保存溫度每降低5℃，種子生命活性保持也能倍增基于這樣的研究，種子庫的濕度一直低于10%，而溫度則維持在零下20℃。保存條件一般情況下，種子庫的植物種子在濕度小于10%和零下20℃的條件下至少能保持10年內仍充滿活性。每過10年，科研人員就會對種子進行發(fā)芽抽樣測試，以確保它們仍具有生命力，如果效果不好，就立即更換一批。理論上講，種子的最長保存期可以達到200年。英國皇家植物園的生物學家在2006年成功地在實驗室條件下將200多年前、英王喬治三世時期（1803年）保留下來的一些槐樹種子培育發(fā)芽，創(chuàng)造了擱放時間最久還能生長發(fā)育的植物種子的紀錄。

1.對于壽命短的種子，每隔幾年就得繁殖一次，成本較高2.某些種子干燥時會失去活力或受到損傷3.對于長壽樹種，可能會有很多年不結種子4.很多植物通過無性繁殖繁衍后代，沒有種子對于上述植物可通過離體保存技術來長期保存種子保存的困難離體培養(yǎng)的植物細胞、組織、器官和試管苗等保存于人工環(huán)境下，一般是在低溫或超低溫條件下，抑制其生長，達到長期保存的目的植物離體保存invitropreservation節(jié)約大量土地、人力物力，節(jié)省費用種質不受病蟲害侵染，便于種質交流保存的種質一旦需要，可迅速通過組織培養(yǎng)技術進行快速繁殖，有利于種質的利用和推廣離體保存技術的優(yōu)點超低溫冷凍保存技術低溫保存技術常溫保存技術離體保存的類型基本原理：將植物材料加入一定的冷凍防護劑，再經一定的方法處理后，貯存在-80℃（干冰溫度）至-196℃（液氮溫度）的超低溫條件下所用的植物材料離體培養(yǎng)的原生質體、細胞、組織、器官、小植株植物的花粉、蕨類植物或海藻的孢子等一、超低溫冷凍保存-196℃的超低溫條件下，細胞內的物質代謝及生命活動處于幾乎完全停止的狀態(tài)，遺傳變異也降到最低。理論上植物材料放在液氮中可以無限期貯存。植物細胞中含有大量的水分，約占細胞總重量的60～90％。細胞中的水是由游離水和束縛水組成，其中游離水約占90％，很容易凍結。種質超低溫保存成功的關鍵，在于降溫冰凍過程中避免細胞內結冰細胞內外水的凍結狀態(tài)是關鍵超低溫保存有三個重要操作步驟：預凍在-196oC下長期貯存解凍超低溫保存植物種質資源的程序細胞質濃厚的分生細胞處于旺盛的對數(shù)分裂期的細胞常選擇細胞培養(yǎng)物、植物莖尖、幼胚、幼苗等作為冷凍保存的材料1.植物材料的選擇注意事項1培養(yǎng)代數(shù)過多，可能會使細胞失去再生能力2培養(yǎng)時間過長會使細胞液泡化3長期培養(yǎng)的愈傷組織和細胞在遺傳上容易變異選擇培養(yǎng)代數(shù)低的材料結構緊密的細胞團與愈傷組織要比單個細胞及松散的細胞團更耐受冷凍細胞或愈傷組織保存野外生長的材料選擇經過冬天低溫鍛煉過的植株來自于抗寒植物的材料，其抗凍性較一般植株強在冷凍之前對細胞進行預處理，可改善細胞的抗寒能力，從而提高細胞冷凍處理后的存活率常用方法低溫培養(yǎng)基加入滲透劑、DMSO脫水處理2.預處理通常將材料放在0℃左右處理數(shù)天至數(shù)周對于低溫敏感的植物材料尤為重要康乃馨無性系在4℃培養(yǎng)3天后進行超低溫保存，解凍后莖尖存活率較未進行預處理的材料明顯提高2.1低溫預處理滲透劑：甘露醇、山梨醇、蔗糖、脯氨酸等脯氨酸是植物體內天然的防護劑使細胞的體積降低，提高材料的抗凍性，增加冷凍后的存活率2.2培養(yǎng)基加入滲透劑將細胞脫水到適當程度，可大大提高材料冷凍及解凍后的存活率而且含水量低的材料，對解凍速度的要求更為寬松2.3脫水處理降低冰點，促進過冷卻和玻璃態(tài)化的形成；提高溶液的黏滯性，阻止冰晶形成；DMSO可以使膜物質分子重新分布，增加細胞膜的透性，在溫度降低時，加速細胞內的水流往細胞外結冰；穩(wěn)定細胞內的大分子正常結構，特別是膜結構，阻止低溫對膜的傷害。3.加入冷凍防護劑(DMSO)甘油、糖、糖醇類、DMSO、脯氨酸DMSO二甲基亞砜：預培養(yǎng)24-48

h，或用二甲基亞砜進行預冷處理，一般時間為20-60

min，可大大提高存活率但是應注意其細胞毒性，使用濃度不宜超過5%滲透性冷凍防護劑多屬于低分子量的中性物質，容易與水分子結合，發(fā)生水合作用，從而增加溶液的黏度，降低溶液冰點，減弱水的結晶過程，即冰點中心增長速度下降，削弱了水的固化程度故在冷凍與解凍過程中，培養(yǎng)基與細胞內的冰點降低，從而保護了植物材料乙二醇的含量為68％時，冰點可降低至-68℃作用原理：由于冷凍防護劑的加入，培養(yǎng)基的滲透壓提高，使細胞產生輕微的質壁分離，增加了細胞的耐寒能力二甲基亞砜等極易滲入細胞內部，從而防止在冷凍及融化過程中細胞過度脫水而受到破壞非滲透性冷凍防護劑在特定溫度下可降低溶質（電解質）濃度，從而起到保護材料的作用大部分冷凍防護劑具細胞毒性，處理溫度愈高，毒性愈大，故需在0

℃下進行處理時間不宜過長，一般不超過1

h根據不同的植物材料，選擇不同的冷凍防護劑若單獨使用效果不大，往往組合使用可獲得較好的效果冷凍時，細胞內外主要發(fā)生理化變化細胞外的溶液水分子先形成冰晶中心冰晶中心的形成速度與溶液成分和降溫速度有關一般在-20～-60℃范圍內，冰晶中心增長最快，形成大塊冰晶后速度減慢，到-140℃時完全停止增長冷凍方法慢速冷凍法、快速冷凍法、逐步冷凍法、預冷凍法、干凍法、包埋脫水法、玻璃化法、利用馴化冰箱法4.冷凍將加入冷凍防護劑的材料，以0.1～10℃/min的速度逐漸降低其溫度，待降至-40℃或-100℃時，浸入液氮中貯存慢速冷凍過程中細胞內的水分外滲并轉化為冰晶，既對冷凍細胞有脫水作用，又防止了細胞內冰晶的形成，避免了冰凍傷害適用于液泡化的成熟細胞4.1慢速冷凍法經冷凍防護劑處理的樣品直接轉入-196℃液氮罐或液氮庫，冷卻速度達到1000℃/min快速冷凍時，由于迅速通過細胞冰晶生長的臨界溫度區(qū)域，避免了細胞內形成致死的大冰晶適用于細胞體積小、胞質濃、含水量低的材料（莖尖、生長點或花粉）4.2快速冷凍法又稱逐步冷凍法先逐漸冷卻（1

℃/min）或分步冷卻（約5℃/min）至-30～50℃，停留約30

min，使材料脫水，然后投入液氮迅速冷卻對于莖尖和芽的冷凍保存最有效，對懸浮細胞也有一定效果4.3預凍法經脫水處理后投入液氮中冷凍脫水（干燥）預處理能增強材料的抗凍性適用含水量較高的薄壁細胞常用的脫水方法真空干燥法、烘箱、硅膠干燥、在含高濃度滲透性化合物（甘油、糖類等）的培養(yǎng)基上培養(yǎng)4.4干凍法效果最好真空干燥法培養(yǎng)材料由褐藻酸鹽包埋成球狀顆粒，在含高濃度的蔗糖溶液（0.75

mol/L）中預培養(yǎng)一段時間經無菌空氣或硅膠部分脫水后進行慢速或快速冷凍用高濃度的蔗糖預處理材料，可避免DMSO和甘油的化學毒性，目的在于提高胞質濃度，增加抗凍力和抗脫水力適合對低溫保護劑敏感的植物4.5包埋脫水法培養(yǎng)材料包埋后，避免了其裸露時可能受到的損傷，使材料所處的環(huán)境更為恒定優(yōu)點1易于操作2避免使用DMSO3免去了程序降溫儀的使用，降溫過程比較隨意4可用較大的培養(yǎng)材料玻璃化是將某種物質轉變成玻璃樣無定形體（玻璃態(tài)）的過程，是一種介于液態(tài)與固態(tài)之間的狀態(tài)，在此形態(tài)中沒有任何的晶體結構存在玻璃化是冷凍生物學中一項簡單、快速而有效的保存有生命的細胞、組織和器官的方法通過玻璃化法降溫保存細胞時，細胞內外的水都不形成結晶，細胞結構不會受到破壞從而細胞得以存活4.6玻璃化法(超臨界狀態(tài))任何液體只要有足夠的降溫速度都可以進入玻璃態(tài)純水玻璃化：需要的降溫速度是1010

℃/min兩種方法可顯著降低形成玻璃化所需的降溫速度1.使用高濃度的保護劑，即玻璃化溶液（VS)2.增加靜水壓力隨著保護劑濃度提高或靜水壓力提高，均一晶核形成溫度下降，玻璃化形成溫度上升貯存期間關鍵要把冷凍溫度持續(xù)維持在-196

℃條件下，不發(fā)生溫度的上下波動一般認為：在-196

℃液氮溫度下，冰晶不會增長及重新形成冰晶在以大豆莖尖為材料做超低溫冷凍實驗時發(fā)現(xiàn)：貯存在-86

℃時，隨著時間的延長材料的活力逐漸喪失，而在-196

℃時材料活力幾乎不損失5.貯存快速解凍法將材料直接放入35-40℃的水浴中解凍，一般約需1～2min的時間可防止組織和細胞脫水死亡，也使冷凍材料快速通過使細胞和組織形成冰晶及冰晶增長的危險溫度區(qū)域，從而避免冰晶對細胞和組織的傷害一旦冰完全融化，應迅速移開材料，防止熱傷害及高溫下保護劑的毒害6.解凍慢速解凍法在0℃、2～3℃或室溫下進行解凍，這種方法易使細胞內重新形成冰晶，故應用較少若冷凍前把細胞的含水量降到一個適當?shù)乃?，則可減低慢速解凍的不利影響，所以該方法多用于脫水處理材料的解凍由于冷凍保護劑對植物細胞有毒害作用，故在培養(yǎng)冷凍材料前，需對冷凍保護劑進行數(shù)次洗脫，一般用液體培養(yǎng)液進行清洗對于冷凍前進行脫水處理的材料，為了避免質壁分離的細胞復原時產生傷害，一般對冷凍防護劑逐漸進行稀釋7.再培養(yǎng)冷凍后復原的材料進行重新培養(yǎng)時，培養(yǎng)條件有可能和冷凍前有一定的變化如：經超低溫冷凍的番茄幼苗莖尖必須在培養(yǎng)基中加入GA3才能使材料直接發(fā)育成小苗，否則形成愈傷組織較常用，適于保存中短期種質定義：將種質用離體培養(yǎng)的方式貯存在非凍結程度的低溫下（1-9℃），但熱帶亞熱帶植物在10-20℃之間也能延緩生長，也稱中低溫調控生長保存在1-9℃溫度下，植物材料的生長速度減緩，但不會完全停止，因此仍須對材料進行繼代，只是間隔時間可以延長至幾個月到幾年二、低溫保存技術低溫保存種質不僅方法簡單，而且存活率也很高一旦需要利用這些材料，只需在常溫下繼代培養(yǎng)便可迅速恢復生長到目前為止，該方法已在眾多的果樹和草本植物中得到應用，如葡萄、草莓、柑橘、蘋果、馬鈴薯等1969年，Galzy最早利用葡萄分生組織培養(yǎng)的小植株，在9℃條件下進行保存，每年繼代一次，保存長達15年之久用此法保存800個葡萄品種資源，每個樣品重復6個，用地面積僅占2

m2；但若在田間保存同樣數(shù)量的種質，則需占地1萬m2在4

℃條件下保存無病毒的草莓植株，每3個月加幾滴新鮮的培養(yǎng)液，可保存6年之久將四季橘試管苗培養(yǎng)在20℃左右、12h光照條件下，不轉換新鮮培養(yǎng)基，可保存達8年之久化學方法加入生長抑制劑（脫落酸、多效唑、二甲銨基琥珀酸酰胺）提高培養(yǎng)基滲透壓（高濃度蔗糖），使材料的生長受到抑制，從而延長繼代培養(yǎng)間隔時間物理方法低氣壓和低氧壓都可抑制植物生長并保持培養(yǎng)物表型一致通過降低大氣壓或加入惰性氣體減少氧分壓低光照也能抑制植物的新陳代謝，特別對海藻種質保存有效低溫保存結合理化方法在常溫（20±5℃）條件下，應用化學或物理方法，改變培養(yǎng)基的成分或環(huán)境條件，延緩培養(yǎng)物生長，達到保存種質的目的1培養(yǎng)基中添加生長抑制劑2提高培養(yǎng)基滲透壓3降低培養(yǎng)瓶內的氧分壓4培養(yǎng)物干燥保存三、常溫保存技術脫落酸：具有抗赤霉素的作用，抑制DNA合成、抑制外植體生長活動在每升培養(yǎng)基中加入5-10mg的ABA，可使外植體繼代培養(yǎng)間隔期延長至一年以上，還可使試管苗葉色濃綠、矮壯、易生根3.

1培養(yǎng)基中添加生長抑制劑一般使用蔗糖，濃度為10

%也可使用甘露醇，因為其為惰性物質，不易被外植體吸收，其抑制時間更長在木薯培養(yǎng)中，把蔗糖濃度提高到4

%，溫度降至20℃，繼代培養(yǎng)間隔期可延長至15個月3.2提高培養(yǎng)基滲透壓在對煙草的莖尖和愈傷組織離體保存時，把可利用的氧降到60%，在6周內，培養(yǎng)物生長量減少60-80%但如果氧的含量降