nirK基因文庫(kù)的構(gòu)建實(shí)驗(yàn)要求：實(shí)驗(yàn)操作中一定要戴手套，并使用70%的酒精消毒；并且每間隔一定時(shí)間（5-10min）再對(duì)手套進(jìn)行消毒。實(shí)驗(yàn)臺(tái)面用70%的酒精擦干凈。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中根據(jù)中間結(jié)果檢查實(shí)驗(yàn)的可靠性。提前做好實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備，滅好槍頭、離心管等實(shí)驗(yàn)耗材。在實(shí)驗(yàn)中所用冰凍試劑在冰上完全融化后再用。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中注意定量，如跑膠是上樣量為3卩1,Marker為3卩1。對(duì)公用試劑用完后請(qǐng)及時(shí)保存到-20度或4度冰箱，防止試劑變質(zhì)。該實(shí)驗(yàn)流程不準(zhǔn)隨便改動(dòng)，若有需改動(dòng)的請(qǐng)教黨老師。（一）宏基因組DNA的提取采用土壤DNA快速提取試劑盒（FastDNASpinkitforsoil）及FastPrep-24核酸提取儀進(jìn)行提取。DNA提取的質(zhì)量決定后續(xù)實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性和可靠性。每個(gè)站位均用0.3g（勿超0.3g，冰凍狀態(tài)）的沉積物樣品進(jìn)行DNA提取。具體操作過(guò)程如下：（1）向LysingMatrixZtube中加入0.3g沉積物樣品（勿超0.3g），1100^1裂解液溶解。裂解液組成為978山磷酸鈉緩沖液和122plMT緩沖液。（均質(zhì)化土樣，使提的DNA含RNA量最少）。注意：離心機(jī)提前預(yù)冷15min，至4T。（2）將上述離心管放入FastPrepInstrment中，設(shè)定速度5，離心時(shí)間40s。（3） 4°C離心機(jī)，將上述離心管以14000Xg離心lOmin。（4） 將上清移入新的1.5ml離心管中加入250plPPS，并輕柔顛倒10次將其混勻。（5） 將上述混合液以14000Xg4°C離心5min，將上清移入另兩個(gè)新的1.5ml離心管中（每管加500yl），將BindingMatrixSuspension搖勻，懸浮，向上述上清中加入500^l的BindingMatrixSuspension。（6） 用手輕柔顛倒混勻2min，將管放置于管架上靜置3min（4C冰箱）。（7） 每管吸出300山上清（即每個(gè)站點(diǎn)吸出300*2），將之丟棄（注意勿擾沉淀），使余下的上清與BindingMatrix混勻，將600卩l(xiāng)的混合液（任一管）移入純化柱（spinfillter）中14000Xg離心1min，倒掉收集管中的廢液，將剩余的（另一管）BindingMatrix全部移入純化柱中14000Xg離心1min，倒掉收集管中的廢液。（8） 向純化柱中加入500卩1已加入乙醇的SEWS-M,14000xg離心lmin,倒掉收集管中的廢液，重復(fù)三次后，以14000xg離心2min,以使SEWS-M洗脫液被全部除去。（9） 將純化柱移入新的收集管中，室溫下空氣中干燥純化柱5min。（10） 加入50卩1DES,并且用槍頭清攪濾膜或用手指輕彈使DNA溶解，靜置1min（55°C水浴5min），以14000Xg離心1min，使DNA轉(zhuǎn)移到收集管中。再加40卩1重復(fù)以上步驟，最后共得到80plDNA樣品。提取的DNA先分裝樣品（10卩1/管），-80C冰箱保存。取一管用1卩1在1%的瓊脂糖凝膠做電泳檢測(cè)，Marker用九DNA/HindIII，95V，45min。（二） nirK基因序列的PCR擴(kuò)增（梯度與平行同一天完成）1、 準(zhǔn)備工作：4C離心機(jī)、制冰機(jī)提前打開，滅菌黃色切頭槍頭-20C冰箱中預(yù)冷，滅菌ddH2O,大小離心管，大小槍頭超凈工作臺(tái)紫外滅菌15min。頭一天預(yù)約PCR儀。冰盒（PCR體系準(zhǔn)備好），無(wú)水乙醇（-20C）。所有的酶、Buffer、引物等都進(jìn)行分裝，防止污染。2、 取出DNA，冰上解凍，用冷卻的無(wú)菌切頭黃色槍頭輕輕吹打DNA，4C，lOOOOrpm離心5min。取1.5卩1DNA稀釋20X（1卩1+19卩1水），取出10ul的原液。剩余DNA放回-80C冰箱。3、 梯度PCR實(shí)驗(yàn)，PCR體系12.5卩1，模板梯度分別為稀釋（1DNA+19ddH2O）的0.5，1，2，4，原液0.5，1.0卩1PCR體系（使用新的PCR體系）:ddH2OBuffer1.25卩1dNTP(2.5mM)1.00p!Mgcl2(25mM)0.75p!BSA(1yg/y1)1.00p!引物nirKF1(20yM)0.25p!引物nirKR1(20yM)0.25p!模板DNA0.5，1，2，4，原液0.5，1.0y1Taq酶（2.5U）（隨用隨拿）0.10p!同時(shí)做陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照。陰性對(duì)照：模板用無(wú)菌ddH2O；陽(yáng)性對(duì)照：模板用帶有該基因的質(zhì)粒。

廠94r預(yù)變性廠94r預(yù)變性5minPCR反應(yīng)程序丿、、94r變性1min、50r退火1min >35cycles72r延伸2min丿72r延伸10min4、 取3卩1PCR產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。選取特異性高的，非特異性擴(kuò)增少，條帶清晰的并且產(chǎn)量適宜（與DNAmarker對(duì)比）的濃度。5、 平行PCR根據(jù)梯度PCR結(jié)果選取最佳濃度模板進(jìn)行平行PCR實(shí)驗(yàn)。用12.5卩1體系，做20個(gè)平行，加陰性對(duì)照。ddH2OBuffer1.25卩1dNTP(2.5mM)1卩1MgCl2(25mM)0.75卩1BSA(200ng/|il)1.0卩1引物nirKFl(20yM)0.25^1引物nirKR1(20pM)0.25^1模板DNA梯度PCR后最好的濃度Taq酶（2.5U）（隨用隨拿）0.1^11.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。（三）PCR產(chǎn)物的乙醇沉淀（平行PCR瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后立即做，沉淀時(shí)間至少過(guò)夜）1） 將檢測(cè)后的平行PCR產(chǎn)物全部加在一起，估計(jì)體積。（在超凈臺(tái)內(nèi)做）2） 調(diào)整單價(jià)陽(yáng)離子濃度。若DNA溶液中含有高濃度的鹽，可用TE（pH8.0）稀釋，否則加入鹽。3） 充分混勻溶液，準(zhǔn)確加入2倍體積的冰冷乙醇（-20D（注意乙醇用量一定要足夠，否則DNA很難沉淀下來(lái)，這要求PCR產(chǎn)物的體積估計(jì)要準(zhǔn)確），再充分混勻（顛倒混勻）溶液。將此含乙醇的溶液置-20°C過(guò)夜使DNA沉淀形成。4） 在離心管底用記號(hào)筆標(biāo)出沉淀即將出現(xiàn)的位置，把離心管放入離心機(jī)時(shí)，注意標(biāo)記處朝上。于0C，13000rpm，離心20min回收DNA。（第二天早上）5） 小心移出上清液至另一滅菌離心管，注意不要攪動(dòng)沉淀（有時(shí)沉淀是看不見(jiàn)的），用吸頭吸盡附于管壁的所有液滴并移入另一滅菌離心管中。6） 加500^170%乙醇（先4°C保存），0C13000rpm離心4min。7） 重復(fù)步驟58） 離心管室溫下敞口放置在實(shí)驗(yàn)臺(tái)上，直至殘留的液體揮發(fā)干。9） 將DNA沉淀重新溶解于適當(dāng)體積（20吐左右）的緩沖液（一般為7.6?8.0TE）或無(wú)菌去離子水中，充分漂洗管壁。（四）PCR產(chǎn)物純化4.切膠純化4.1制膠：使用Genefinder專用三角瓶，膠濃度1.5%，體積30ml，3ulGenefinder染色，避光條件下凝固（因?yàn)镚enefinder見(jiàn)光極易分解）。樣品預(yù)染：計(jì)算樣品需要的預(yù)染液量:每20ulDNA溶液需6ul預(yù)染液。Genefinder：6XLoadingBuffer=1：9比例配置預(yù)染液，將樣品與預(yù)染液混勻，冰上預(yù)染3min。D2000Marker與Genefinder的預(yù)染：5plD2000Marker加入1plGenefinder，與樣品一起冰上預(yù)染3min。點(diǎn)樣：電泳槽要事先清洗干凈，用新緩沖液配膠，新緩沖液90V電壓，電泳45-50min。時(shí)間視目標(biāo)基因片段大小及PCR質(zhì)量而定（避光）。藍(lán)盾切膠玻璃板和新手術(shù)刀片用70%酒精噴過(guò)，吸水紙擦凈，將目的DNA條帶從瓊脂糖凝膠中切下（盡可能切得干凈）。切完一個(gè)樣品之后，用噴過(guò)70%酒精的吸水紙將刀片和玻璃板仔細(xì)擦過(guò)，防止樣品之間的交叉污染。4.5PCR產(chǎn)物純化：利用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒進(jìn)行切膠純化，具體操作步驟見(jiàn)說(shuō)明書。注：最后DNA溶解體積20”。瓊脂糖凝膠回收試劑盒E.Z.N.AGelExtractionKit說(shuō)明書準(zhǔn)備工作濃縮的SPWBuffer需用乙醇按如下稀釋：D2500-00&D2501-00&D2502-00加入20ml100%的乙醇;D2500-01/02&D2501-01/02&D2502-01/02每瓶加入100ml100%的乙醇;注意:稀釋后的DNAWashBuffer需室溫保存;所有步驟必須在室溫下進(jìn)行.操作方案配制瓊脂糖EB凝膠，電泳以分離DNA片段?任何類型或等級(jí)的瓊脂糖都可以使用.我們強(qiáng)烈的推薦使用新鮮的TAE電泳緩沖液.不要重復(fù)使用電泳緩沖液，舊的電泳緩沖液PH會(huì)增加而降低DNA的回收產(chǎn)量；2．1．稱取空離心管的重量，2.電泳足夠時(shí)間后，在藍(lán)盾切膠機(jī)下小心地把所需的DNA片段切下來(lái)?并盡量去除多余的凝膠.注意:DNA在紫外燈下的曝光的時(shí)間不要超過(guò)30秒，藍(lán)盾配合Genefinder可在白光下顯色切膠.切下帶目的片段的凝膠（注意切膠要位置準(zhǔn)確，不要把過(guò)長(zhǎng)或過(guò)短的DNA片段切下來(lái)），裝在1.5ml離心管中并稱其重量，求出凝膠塊的重量，近似地確定其體積.一般情況下，凝膠的密度為lg/ml,于是凝膠的體積與重量的關(guān)系可按下面換算：凝膠薄片的重量為0.2g則其體積為0.2ml;加入等倍凝膠體積的BindingBuffer,把混合物置于60°C水浴中溫浴7min至凝膠完全融化（注意觀察一定要完全融化），其間每隔2-3分鐘混勻一次；重要提醒:在凝膠完全溶解之后，注意凝膠-BindingBuffer混合物的pH值.如果其pH值大于8的話,DNA的產(chǎn)量將大大減少?觀察混合物的顏色，如果是橙色或紅色，則要加入5“l(fā)濃度為5M,pH5.2的醋酸鈉，以調(diào)低其pH值?經(jīng)過(guò)這一調(diào)節(jié)，該混合物的顏色將恢復(fù)為正常的淺黃色.一般情況下，使用新鮮的電泳緩沖液，凝膠-Bindingbuffer混合物的PH值的不會(huì)升高；轉(zhuǎn)移700》l的DNA-瓊脂糖溶液到一個(gè)HiBindTMDNA柱子，并把柱子裝在一個(gè)干凈的2ml收集管內(nèi),室溫下,10,000Xg離心lmin,棄去液體.（一個(gè)HiBindDNA柱子最多可容納700》l的溶液，如果DNA-瓊脂糖混合物的體積大于700》1,可先轉(zhuǎn)移700》l溶液至柱子,離心完后,將余下的溶液繼續(xù)加上柱子上.但是每一個(gè)HiBindTM柱子最多可以結(jié)合25?30》gDNA?如果預(yù)期產(chǎn)量較大，則把樣品分別加到合適數(shù)目的柱中?）將柱子重新套回收集管中,加300》lBindingBuffer至HiBindDNA柱子中;室溫下,10000Xg離心1分鐘,去棄濾出液;這一步相當(dāng)關(guān)鍵，不要忽略此步.將柱子重新套回收集管中，加入700》1SPWWashbuffer至HiBindDNA柱子中，室溫下,10,000Xg離心1分鐘,去棄濾出液;注:SPWWashbuffer在使用前必須按瓶子標(biāo)鑒要求用無(wú)水乙醇進(jìn)行稀釋.將柱子重新套回收集管中，重復(fù)加入700》1SPWWashbuffer至HiBindDNA柱子中,室溫下,10,000Xg離心1分鐘，棄去濾出液;，將空柱子重新套回收集管中,10,000Xg離心1min以甩干柱基質(zhì)殘余的液體.這步可以去除柱子基質(zhì)上殘余的乙醇,不要省略此步 對(duì)得到好的DNA產(chǎn)量是十分重要的.把柱子裝在一個(gè)干凈的1.5ml離心管上，加入20》1洗脫液（elutionbuffer）柱子膜上,10,000Xg離心1分鐘,離心管中的溶液就是純化的DNA產(chǎn)物,保存于-20度.（五）純化PCR產(chǎn)物的連接（連接可以隨時(shí)做，連接反應(yīng)時(shí)間越長(zhǎng)越好，至少要過(guò)夜）將目的基因連接到質(zhì)粒載體pMD19-TSimpleVector（Takara,大連寶生物）上。連接體系（總體積5gl）（注意先閱讀試劑盒說(shuō)明書）：PCR產(chǎn)物2plpMD19-TSimpleVector0.5ylSolution2.5yl于16°C連接2h后，4°C連接至少過(guò)夜。該試劑為公用試，劑用完后請(qǐng)及時(shí)放回-20度冰箱，否則會(huì)影響試劑在以后使用中的連接效率。（六）感受態(tài)細(xì)胞的制備（提前做好）1） 從新鮮的大腸桿菌DH5a培養(yǎng)平板上接種一環(huán)菌落于5mlLB液體培養(yǎng)基，37C培養(yǎng)過(guò)夜。2） 按0.5%?1%的比例轉(zhuǎn)接于100mlLB液體培養(yǎng)基，37C培養(yǎng)2?4h，當(dāng)菌液0D600約為0.3。3） 將菌液轉(zhuǎn)移到預(yù)冷的50ml離心管中，冰浴30min，4000rpm離心10min。4）去上清，沉淀懸浮于5ml預(yù)冷的0.1M的CaCl2溶液中，冰浴15min,4000rpm離心10min。5）去上清，沉淀懸浮于2ml預(yù)冷的0.1M的CaCl2溶液中，冰浴10min,4000rpm離心10min。6） 去上清，沉淀懸浮于1ml預(yù)冷的0.1M的CaCl2溶液中，加入高壓滅菌的甘油至終濃度15%。7） 取200“分裝于1.5ml的tip管中，于-8O°C保存，備用。8） 制備后的感受態(tài)細(xì)胞需立即進(jìn)行驗(yàn)證轉(zhuǎn)化效率，（沒(méi)有驗(yàn)證過(guò)的或驗(yàn)證轉(zhuǎn)化效率達(dá)不到要求的感受態(tài)細(xì)胞不要用！）做好下一天轉(zhuǎn)化準(zhǔn)備準(zhǔn)備轉(zhuǎn)化用的液體SOC（4°C）、固體LB/Amp/X-Gal/LPTG培養(yǎng)基和LB/Amp培養(yǎng)基（需要1OOmg/ml的AMP（氨芐青霉素），1000x實(shí)際工作濃度；IPTG和X-Gal母液分別為240mg/ml和50mg/ml）。見(jiàn)附錄《培養(yǎng)基的配方》（七）轉(zhuǎn)化（第三天下午，培養(yǎng)14~16小時(shí)）1） 打開循環(huán)水浴，并使溫度恒定在42°C（注意用溫度計(jì)檢測(cè)實(shí)際溫度）。2） 從-8O°C冰箱取感受態(tài)細(xì)胞，放在冰上緩慢融化；用冷卻的無(wú)菌吸頭將重組載體加入200pl用CaCl2溶液制備的感受態(tài)細(xì)胞懸液中（重組DNA體積不超過(guò)10pl，DNA小于10ng），輕輕旋轉(zhuǎn)以混勻內(nèi)容物，在冰中放置30min。3） 將離心管放入恒溫至42°C的循環(huán)水浴中，放置90s，不要搖動(dòng)管。熱激是一個(gè)關(guān)鍵步驟，準(zhǔn)確達(dá)到熱激溫度非常重要。4） 快速將離心管轉(zhuǎn)移到冰浴中，使細(xì)胞冷卻1-2min。5） 每管加入800plSOC培養(yǎng)基（提前備好，放于4°C待用），用水浴將培養(yǎng)基加溫至37°C,然后將離心管轉(zhuǎn)移到37°C搖床上，溫育45min，使細(xì)菌復(fù)蘇并表達(dá)質(zhì)粒編碼的抗生素標(biāo)記基因。（用低于50r/min的轉(zhuǎn)速的搖床）。5） 將適當(dāng)體積已轉(zhuǎn)化的感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)移到LB/Amp/X-Gal/LPTG平板培養(yǎng)基上，進(jìn)行梯度涂布，作50pl、100pl、100pl、200pl、200pl、300pl六個(gè)板。6） 將平板置于室溫直至液體被吸收。7） 倒置平板，于37°C培養(yǎng)，12-16h后可出現(xiàn)菌落。8） 取出培養(yǎng)板于4°C放置數(shù)小時(shí)使之顯色。

9）從克隆數(shù)約200個(gè)的同一個(gè)平板上用平頭牙簽隨機(jī)挑選約200個(gè)白色菌斑，將挑選出的陽(yáng)性克隆在含1OOpg/m1氨芐青霉素的LB-AMP固體平板上用平頭牙簽劃菌落，一個(gè)板20-30個(gè)左右劃格標(biāo)號(hào)，防止交叉污染，于37°C培養(yǎng)過(guò)夜。（第五天挑克隆，隨時(shí)注意生長(zhǎng)狀況，不要長(zhǎng)過(guò)）10）第五天挑菌進(jìn)行菌落PCR，并用封口膜封好平板倒置保存于4°C,并保持15天轉(zhuǎn)接一次?；蛱糁猎嚬埽M(jìn)行保種。（八）克隆的PCR擴(kuò)增（每個(gè)庫(kù)挑150個(gè)，兩天做完）用水煮法快速提取細(xì)胞中的質(zhì)粒DNA,將菌加入200卩1滅菌的去離子水中,沸水煮5min,冰上放置5min,然后4C,12000rpm,離心5min,取20卩1上清到新的離心管中做PCR的模板。PCR反應(yīng)體系：25p1（同時(shí)做陰性對(duì)照）ddH2O14.6p1Buffer2.5p1dNTP2.0p1MgC122.0p1M13-D1.5p1RV-M1.5p1模板DNA0.8p1Taq酶0.1p194C預(yù)變性3min廠94廠94C變性反應(yīng)程序Y 58C退火72C延伸72C延伸45s 、lmin卜30cycles1.5min（視基因片段長(zhǎng)度而定）10minPCR產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，Marker用D2000。（九）限制性酶切分析（做完P(guān)CR后，馬上酶切，晚上酶切過(guò)夜，三種酶耗時(shí)間較長(zhǎng)第二天跑電泳）（一個(gè)庫(kù)大約需要一周）選用能蓋嚴(yán)的滅菌PCR管，做好標(biāo)記。片段大小正確的nirK基因PCR產(chǎn)物分別用MspI、HhaI和TaqI限制性酶進(jìn)行酶切，酶切反應(yīng)于37°C過(guò)夜。PCR反應(yīng)可能強(qiáng)弱不一（應(yīng)盡量爭(zhēng)取一致），做酶切時(shí)注意用量調(diào)節(jié)，PCR產(chǎn)物過(guò)弱的要重新做PCR，不要直接做酶切。三個(gè)酶切體系如下表，MspI，HhaI為6卩1體系37°C培養(yǎng)箱酶切14-16小時(shí)，TaqI酶65C烘箱酶切14-16小時(shí)（寫好酶切紙條）。由于溫度高可能導(dǎo)致?lián)]發(fā)，PCR管放入烘箱和培養(yǎng)箱之前一定要蓋嚴(yán)。酶切反應(yīng)一定要完全。MspI和HhaI酶切體系6pl酶切緩沖液0.6yl限制性內(nèi)切酶（MspI/HhaI）0.3ylPCR產(chǎn)物DNA2.7卩1（個(gè)別根據(jù)PCR產(chǎn)物強(qiáng)弱調(diào)節(jié)）無(wú)菌超純水2.4卩1TaqI酶切體系9卩1酶切緩沖液0.6卩1限制性內(nèi)切酶（TaqI）0.45^lPCR產(chǎn)物DNA2.7卩1（個(gè)別根據(jù)PCR產(chǎn)物強(qiáng)弱調(diào)節(jié)）無(wú)菌超純水5.25卩1酶切產(chǎn)物用3%的瓊脂糖凝膠電泳分析，電壓65V，40min，60min，80min,120min分別拍一次照（nirKA基因）。將得到的所有的酶切電泳圖進(jìn)行比對(duì)，酶切產(chǎn)物條帶長(zhǎng)度之和大于預(yù)期（產(chǎn)物長(zhǎng)度+載體）的片段認(rèn)為是假陽(yáng)性，需劃線純化后再作酶切。根據(jù)凝膠圖像的酶切帶型劃分分類操作單元（OTUs）（對(duì)于相似酶切帶型，如果難以辨別是否相同，則暫時(shí)劃為不同的OTU,待進(jìn)一步測(cè)序后再合理準(zhǔn)確判斷）。對(duì)于同一文庫(kù)中的所有不同OTUs，找到相應(yīng)的克隆菌株保種（每種OUT至少保3個(gè)不同序號(hào)的克隆，對(duì)于只有1~2個(gè)克隆的OUT，對(duì)所有克隆進(jìn)行保種）（十）序列測(cè)定將基因文庫(kù)中所有的分類操作單元（OTUs）進(jìn)行測(cè)序。將需要測(cè)序的陽(yáng)性克隆接種于LB-AMP（含120pg/mlAMP）液體培養(yǎng)基，37°C搖床培養(yǎng)過(guò)夜（12?14h）,將菌液送至上海生工測(cè)序。OTUs保種：凍存管用油性記號(hào)筆做好標(biāo)記（檢查記號(hào)筆是否好用，是否防水）；每管滅菌凍存管加入560卩1菌液、240卩150%滅菌甘油，漩渦振蕩混勻5min,靜置2min后再振蕩混勻5min,-80C保存。文庫(kù)中一個(gè)0TU只有1或2個(gè)克隆的，保存所有克隆，一個(gè)0TU有三個(gè)或三個(gè)以上克隆的，保存三個(gè)克隆。若測(cè)序結(jié)果不好，將不好的菌株進(jìn)行劃線，挑單克隆，轉(zhuǎn)板，再煮菌PCR,酶切，與之前0TUs進(jìn)行比對(duì)，送測(cè)序，整理。測(cè)序得到好的結(jié)果后及時(shí)保種，并整理菌種盒把沒(méi)用的菌株扔掉，換成新的。附錄：SOC培養(yǎng)基配方（100ml）：2.0g胰蛋白胨，0.5g酵母膏，1ml1MNaCl,0.25ml1MKC1,1m12M的葡萄糖（過(guò)濾除菌）。Ampicillin（氨卡青霉素）（100mg/ml）組份濃度100mg/mlAmpicillin配制量50ml配制方法1.稱量5gAmpicillin置于50ml離心管中。加入40ml滅菌水，充分混合溶解后，定容至50ml。用0.22pm過(guò)濾膜過(guò)濾除菌。4?小份分裝（1ml/份）后，-20C保存。IPTG（異丙基-B-D-硫代半乳糖苷）（24mg/ml）組份濃度240mg/mLIPTG配制量50mL配制方法1.稱12gIPTG置于50ml離心管中。加入40ml滅菌水，充分混合溶解后，定容至50ml。用0.22pm過(guò)濾膜過(guò)濾除菌。4小份分裝（1ml，份）后，-20C保存。X-Gal（50mg/ml）組份濃度50mg/mlX-Gal配制量50ml配制方法1.稱量50mgX-Gal置于1.5ml離心管中。2.加入1mlDMF（二甲基甲酰胺），充分混合溶解

LB培養(yǎng)基組份濃度 l%(W/V)Tryptone(胰蛋白胨),0.5%(W/V)YeastExtract(酵母提取物),1%(W/V)NaCl配制量lL配制方法1.稱取下列試劑，置于lL燒杯中。Tryptone10gYeastExtract5gNaCl10g加入約800ml的去離子水，充分?jǐn)嚢枞芙狻５渭覰aOH調(diào)節(jié)pH值至7.0。加去離子水將培養(yǎng)基定容至1L。5高溫高壓滅菌LB/Amp平板培養(yǎng)基組份濃度1%(W/V)Tryptone0.5%(W/V)YeastExtract1%(W/V)NaCl0.1mg/mlAmpicillin1.5%(W/V)Agar配制量1L配制方法1.稱取下列試劑，置于1L燒杯中。Tryptone10gYeastExtract5gNaCl10g加入約800ml的去離子水，充分?jǐn)嚢枞芙?。滴加NaOH調(diào)節(jié)pH值至7.0。4