免疫學(xué)技術(shù)與方法演示文稿1當(dāng)前第1頁(yè)\共有122頁(yè)\編于星期五\2點(diǎn)2優(yōu)選免疫學(xué)技術(shù)與方法當(dāng)前第2頁(yè)\共有122頁(yè)\編于星期五\2點(diǎn)指與細(xì)胞免疫有關(guān)的各種檢測(cè)技術(shù)，包括對(duì)免疫細(xì)胞、細(xì)胞因子的檢測(cè)及功能分析。細(xì)胞免疫技術(shù)淋巴細(xì)胞分離與檢測(cè)淋巴細(xì)胞功能測(cè)定細(xì)胞因子測(cè)定體內(nèi)細(xì)胞免疫試驗(yàn)玫瑰花環(huán)試驗(yàn)T細(xì)胞亞群檢測(cè)技術(shù)淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn)細(xì)胞毒性T細(xì)胞試驗(yàn)巨噬細(xì)胞移動(dòng)抑制試驗(yàn)白細(xì)胞介素測(cè)定干擾素測(cè)定皮膚試驗(yàn)當(dāng)前第3頁(yè)\共有122頁(yè)\編于星期五\2點(diǎn)免疫制備技術(shù)抗原制備抗體制備抗體和細(xì)胞因子純化淋巴細(xì)胞制備抗體標(biāo)記與致敏指制備與免疫檢測(cè)有關(guān)的各種試劑，包括抗原制備、抗體制備及抗體標(biāo)記等技術(shù)。當(dāng)前第4頁(yè)\共有122頁(yè)\編于星期五\2點(diǎn)體內(nèi)殺菌、溶菌、調(diào)理、中和毒素免疫病理?yè)p傷—超敏反應(yīng)、免疫性疾病等體外：凝集、沉淀、溶細(xì)胞、中和毒素、補(bǔ)體結(jié)合等又稱：serologicalreaction血清學(xué)實(shí)驗(yàn)第一節(jié)抗原抗體反應(yīng)原理及特點(diǎn)當(dāng)前第5頁(yè)\共有122頁(yè)\編于星期五\2點(diǎn)一、抗原抗體反應(yīng)的原理基本原理：特異性（epitopeHVR）可見性（凝集、沉淀、溶血等）結(jié)合力(4種)當(dāng)前第6頁(yè)\共有122頁(yè)\編于星期五\2點(diǎn)高度互補(bǔ)（epitope-HVR）緊密接觸結(jié)合力抗原

抗體帶電離子異性相吸靜電引力分子極化范德華引力形成氫鍵氫鍵引力形成疏水基團(tuán)

疏水作用力作用最小最具特異性作用最大抗原抗體結(jié)合可見反應(yīng)比例合適當(dāng)前第7頁(yè)\共有122頁(yè)\編于星期五\2點(diǎn)

結(jié)合力的大小

親和力（affinity）

親合力（avidity）當(dāng)前第8頁(yè)\共有122頁(yè)\編于星期五\2點(diǎn)一個(gè)抗體結(jié)合點(diǎn)與一個(gè)抗原表位間的結(jié)合強(qiáng)度。（singlepoint－single

point)親和力用平衡常數(shù)表示：K=K1/K2親和力（affinity）：即：結(jié)合常數(shù)/解離常數(shù)

K值越大，親和力越高，與抗原的結(jié)合越牢固當(dāng)前第9頁(yè)\共有122頁(yè)\編于星期五\2點(diǎn)親合力（avidity）

指整個(gè)抗體分子與抗原之間結(jié)合的強(qiáng)度

(allpointsallpoints)

與抗體的結(jié)合價(jià)直接相關(guān)。親合力高，與抗原結(jié)合牢固不易解離。當(dāng)前第10頁(yè)\共有122頁(yè)\編于星期五\2點(diǎn)二、抗原抗體反應(yīng)的特點(diǎn)（一）特異性（specificity）概念：一種抗原只能與其相應(yīng)的抗體結(jié)合起反應(yīng)Ag-epitopeHVR-Ab空間結(jié)構(gòu)高度互補(bǔ)意義檢測(cè)時(shí)常用已知Ag檢測(cè)未知Ab，或反之。相對(duì)性：當(dāng)抗原之間有相同或相似結(jié)構(gòu)的epitope時(shí)（共同抗原）交叉反應(yīng)（crossreaction）分子基礎(chǔ)：當(dāng)前第11頁(yè)\共有122頁(yè)\編于星期五\2點(diǎn)（二）比例性

(proportionality)指抗原抗體的量比關(guān)系，即只有當(dāng)抗原抗體的濃度比例適當(dāng)時(shí)，才出現(xiàn)可見反應(yīng)。1929年Heidelberger以固定Ab量逐漸增加Ag量的試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)帶現(xiàn)象。1977年Green把此現(xiàn)象稱為鉤狀效應(yīng)（hookeffect），包括前后帶現(xiàn)象。指免疫檢測(cè)中由于抗原、抗體濃度比例不合適而致檢測(cè)結(jié)果呈假陰性的現(xiàn)象。當(dāng)前第12頁(yè)\共有122頁(yè)\編于星期五\2點(diǎn)

抗原抗體反應(yīng)比例性示意圖當(dāng)前第13頁(yè)\共有122頁(yè)\編于星期五\2點(diǎn)1、帶現(xiàn)象:在抗原抗體反應(yīng)等價(jià)帶前后,由于抗體或抗原過(guò)量,上清液中可測(cè)出游離的抗體或抗原,形成的沉淀物少,不出現(xiàn)可見反應(yīng),這種現(xiàn)象稱為帶現(xiàn)象2、等價(jià)帶:抗原抗體反應(yīng)曲線的高峰部分是抗原抗體分子比例合適的范圍,稱為抗原抗體反應(yīng)的等價(jià)帶。在此范圍內(nèi),抗原抗體充分結(jié)合,沉淀物形成快而多。3、前帶現(xiàn)象:抗體量過(guò)剩時(shí),不出現(xiàn)可見反應(yīng)。4、后帶現(xiàn)象:抗原量過(guò)剩時(shí),不出現(xiàn)可見反應(yīng)。當(dāng)前第14頁(yè)\共有122頁(yè)\編于星期五\2點(diǎn)抗體的兩個(gè)Fab段分別結(jié)合兩個(gè)epitope，相互交叉結(jié)合連接成巨大的網(wǎng)格狀立體聚合物（可見）。網(wǎng)格學(xué)說(shuō)當(dāng)前第15頁(yè)\共有122頁(yè)\編于星期五\2點(diǎn)Ab/Ag過(guò)剩過(guò)剩方的結(jié)合價(jià)得不到飽和，大多數(shù)游離存在，只形成小分子復(fù)合物（不可見）。當(dāng)前第16頁(yè)\共有122頁(yè)\編于星期五\2點(diǎn)（三）可逆性（reversibility）解離1.Ag+AbAg-Ab一定條件（動(dòng)態(tài)平衡）

動(dòng)態(tài)平衡公式:

[Ag]+[Ab][Ag-Ab]

K1:結(jié)合常數(shù)；K2：解離常數(shù)K1K2當(dāng)前第17頁(yè)\共有122頁(yè)\編于星期五\2點(diǎn)（四）階段性數(shù)秒～數(shù)分鐘，肉眼不可見數(shù)分～數(shù)小時(shí)肉眼可見兩個(gè)階段特異性結(jié)合可見反應(yīng)階段當(dāng)前第18頁(yè)\共有122頁(yè)\編于星期五\2點(diǎn)（一）電解質(zhì)作用：中和膠體表面電荷，破壞水化層，使Ag-Ab聚集。

常用：0.85%生理鹽水，PBS、Ca2+、Mg2+等。鹽析（salting）即電解質(zhì)濃度過(guò)高引起的非特異性蛋白質(zhì)沉淀。三、影響抗原抗體反應(yīng)的因素當(dāng)前第19頁(yè)\共有122頁(yè)\編于星期五\2點(diǎn)（二）酸堿度Ag、Ab多為蛋白質(zhì)，具兩性電離特性，有固定的等電點(diǎn)，pH過(guò)高或過(guò)低均可影響Ag、Ab反應(yīng)一般：pH6～8為宜。注意：自凝——即pH達(dá)到或接近抗原的pI時(shí)，引起的抗原非特異性自身凝集現(xiàn)象。酸凝——pH過(guò)低時(shí)造成的蛋白質(zhì)自凝現(xiàn)象。當(dāng)前第20頁(yè)\共有122頁(yè)\編于星期五\2點(diǎn)（三）溫度—影響反應(yīng)速度一般：15～40℃為宜，最適溫度：37℃,

過(guò)高（>56℃）:Ag-Ab解離，Ag、Ab變性。當(dāng)前第21頁(yè)\共有122頁(yè)\編于星期五\2點(diǎn)免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)的評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)Specificity（特異）：

檢測(cè)信號(hào)針對(duì)性和排他性Sensitivity（靈敏）：

可測(cè)出的最低含量Simplicity（簡(jiǎn)便）：

操作是否方便Safety（安全）：

是否有污染，對(duì)操作者的傷害Saving（節(jié)約）：

性能/價(jià)格比當(dāng)前第22頁(yè)\共有122頁(yè)\編于星期五\2點(diǎn)免疫檢驗(yàn)技術(shù)發(fā)展進(jìn)程的主要階段自然的肉眼觀察的抗原抗體反應(yīng)（沉淀反應(yīng)、凝集反應(yīng)）加速的肉眼觀察的抗原抗體反應(yīng)（電泳技術(shù)、分離技術(shù)）標(biāo)記性免疫技術(shù)提高抗原抗體反應(yīng)的特異性、敏感性半自動(dòng)、自動(dòng)化檢驗(yàn)儀器與免疫反應(yīng)原理結(jié)合，加快了反應(yīng)過(guò)程標(biāo)記技術(shù)、單克隆技術(shù)、高智能自動(dòng)化技術(shù)的最佳組合當(dāng)前第23頁(yè)\共有122頁(yè)\編于星期五\2點(diǎn)

抗原抗體反應(yīng)的基本類型表反應(yīng)類型實(shí)驗(yàn)技術(shù)檢測(cè)方法敏感度沉淀反應(yīng)液相沉淀試驗(yàn)觀察沉淀、檢測(cè)濁度+，++++

瓊脂凝膠擴(kuò)散觀察掃描沉淀線或環(huán)+

凝膠電泳技術(shù)或峰或弧++補(bǔ)體參與反應(yīng)補(bǔ)體溶血試驗(yàn)以裸眼或光電比色儀++

補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)觀察測(cè)定溶血現(xiàn)象+++免疫標(biāo)記技術(shù)熒光免疫技術(shù)檢測(cè)熒光現(xiàn)象++++

放射免疫技術(shù)檢測(cè)放射性++++

酶標(biāo)免疫技術(shù)檢測(cè)酶底物顯色++++

發(fā)光免疫技術(shù)測(cè)定發(fā)光強(qiáng)度++++

生物素-親合素技術(shù)結(jié)合其它標(biāo)記技術(shù)++++

金標(biāo)免疫技術(shù)檢測(cè)金顆粒沉淀++++凝集反應(yīng)

直接凝集試驗(yàn)用裸眼、放大鏡或顯+

間接凝集試驗(yàn)微鏡觀察紅細(xì)胞或膠++

凝集抑制試驗(yàn)乳等顆粒和各種凝集+++

協(xié)同凝集試驗(yàn)現(xiàn)象+++

抗球蛋白試驗(yàn)+++中和反應(yīng)病毒中和試驗(yàn)病毒感染性喪失+

毒素中和試驗(yàn)外毒素毒性丟失++當(dāng)前第24頁(yè)\共有122頁(yè)\編于星期五\2點(diǎn)

一、凝集反應(yīng)（Agglutination）

顆粒性抗原（如細(xì)菌、細(xì)胞）與相應(yīng)抗體，在適當(dāng)電解質(zhì)存在的條件下，經(jīng)過(guò)一定時(shí)間后出現(xiàn)肉眼可見凝集塊稱為凝集反應(yīng)。第二節(jié)基于Ag-Ab反應(yīng)的檢測(cè)方法當(dāng)前第25頁(yè)\共有122頁(yè)\編于星期五\2點(diǎn)當(dāng)前第26頁(yè)\共有122頁(yè)\編于星期五\2點(diǎn)2、凝集反應(yīng)的用途（1）定性檢測(cè)

即根據(jù)凝集現(xiàn)象的出現(xiàn)與否判定結(jié)果陽(yáng)性或陰性（2）定量檢測(cè)

即將標(biāo)本作一系列倍比稀釋后進(jìn)行反應(yīng)，以出現(xiàn)50%凝集的最高稀釋度作為滴度。凝集反應(yīng)方法簡(jiǎn)便，敏感性高，臨床應(yīng)用廣泛。當(dāng)前第27頁(yè)\共有122頁(yè)\編于星期五\2點(diǎn)3、凝集反應(yīng)的分類玻片凝集反應(yīng)試管凝集反應(yīng)當(dāng)前第28頁(yè)\共有122頁(yè)\編于星期五\2點(diǎn)（一）直接凝集試驗(yàn)（Directagglutination）當(dāng)前第29頁(yè)\共有122頁(yè)\編于星期五\2點(diǎn)1、玻片凝集試驗(yàn)當(dāng)前第30頁(yè)\共有122頁(yè)\編于星期五\2點(diǎn)2、試管凝集試驗(yàn)當(dāng)前第31頁(yè)\共有122頁(yè)\編于星期五\2點(diǎn)（二）間接凝集試驗(yàn)

indirectagglutination當(dāng)前第32頁(yè)\共有122頁(yè)\編于星期五\2點(diǎn)已知抗原檢測(cè)抗體已知抗體檢測(cè)抗原正向反向當(dāng)前第33頁(yè)\共有122頁(yè)\編于星期五\2點(diǎn)1、正向間接凝集反應(yīng)當(dāng)前第34頁(yè)\共有122頁(yè)\編于星期五\2點(diǎn)2、反向間接凝集反應(yīng)當(dāng)前第35頁(yè)\共有122頁(yè)\編于星期五\2點(diǎn)3、間接凝集抑制反應(yīng)當(dāng)前第36頁(yè)\共有122頁(yè)\編于星期五\2點(diǎn)4、協(xié)同凝集反應(yīng)（coaggoltination）當(dāng)前第37頁(yè)\共有122頁(yè)\編于星期五\2點(diǎn)可溶性抗原（血清蛋白、病毒抗原、細(xì)胞裂解液或組織液等）與相應(yīng)抗體結(jié)合，在一定條件下形成肉眼可見的沉淀物稱沉淀反應(yīng)。二、沉淀反應(yīng)當(dāng)前第38頁(yè)\共有122頁(yè)\編于星期五\2點(diǎn)

液相沉淀反應(yīng)凝膠擴(kuò)散沉淀凝膠免疫電泳絮狀沉淀環(huán)狀沉淀免疫濁度沉淀單向瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)雙向瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)血清免疫電泳火箭電泳對(duì)流免疫電泳免疫印跡等當(dāng)前第39頁(yè)\共有122頁(yè)\編于星期五\2點(diǎn)1、絮狀沉淀試驗(yàn)操作步驟：（1）將可溶性抗原作一系列倍比稀釋。（2）各管加入一定濃度的適量抗血清。（3）振搖使抗原、抗體充分混勻，置37℃孵育。（4）產(chǎn)生沉淀量隨抗原量而不同，以出現(xiàn)沉淀物最多的管為最適比例管。絮狀沉淀試驗(yàn)方法簡(jiǎn)單，設(shè)備要求低，敏感度較低，目前多用以測(cè)定抗原抗體反應(yīng)的最適比。（一）液相沉淀反應(yīng)當(dāng)前第40頁(yè)\共有122頁(yè)\編于星期五\2點(diǎn)2、環(huán)狀沉淀試驗(yàn)操作步驟：（1）用毛細(xì)滴管吸取抗血清加于沉淀管（5×50mm）底部，避免產(chǎn)生氣泡。（2）將抗原溶液沿管壁緩緩疊加于抗血清液面上，形成清晰的交界面。（3）置沉淀管于室溫下使其反應(yīng)，1~5min內(nèi)在兩界面間呈現(xiàn)乳白色沉淀環(huán)為陽(yáng)性。30min仍無(wú)沉淀環(huán)出現(xiàn)則為陰性。應(yīng)用：主要用于抗原的定性試驗(yàn)。用已知抗體來(lái)檢測(cè)未知抗原。

（診斷炭疽的Ascoli實(shí)驗(yàn)、細(xì)菌分型、血跡鑒定）。

當(dāng)前第41頁(yè)\共有122頁(yè)\編于星期五\2點(diǎn)3、凝膠擴(kuò)散沉淀凝膠擴(kuò)散沉淀是指抗原與抗體在凝膠介質(zhì)中自由擴(kuò)散形成濃度梯度，抗原與抗體在比例合適的擴(kuò)散部位相遇形成沉淀線的反應(yīng)。常用的凝膠有瓊脂、瓊脂糖、葡聚糖或聚丙稀酰胺凝膠等。最常用的方法為：①單向瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)②雙向瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)當(dāng)前第42頁(yè)\共有122頁(yè)\編于星期五\2點(diǎn)（1）單向瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)原理：1％～2%的瓊脂凝膠形成網(wǎng)狀構(gòu)架，空隙中是98％-99%的電解質(zhì)溶液。凝膠網(wǎng)孔較大，允許分子量在200kD以下甚至更大些的大分子物質(zhì)通過(guò)，絕大多數(shù)可溶性抗原和抗體的分子量在200kD以下，因此可以在瓊脂凝膠中自由擴(kuò)散，所受阻力甚小。二者在瓊脂凝膠中相遇，在最適比例處發(fā)生沉淀，此沉淀物因顆粒較大而不擴(kuò)散，故形成沉淀帶。

當(dāng)前第43頁(yè)\共有122頁(yè)\編于星期五\2點(diǎn)

單向免疫擴(kuò)散試驗(yàn)示意圖環(huán)的直徑與抗原含量成正相關(guān)當(dāng)前第44頁(yè)\共有122頁(yè)\編于星期五\2點(diǎn)（2）雙向免疫擴(kuò)散試驗(yàn)

雙向免疫擴(kuò)散試驗(yàn)是在瓊脂板上按一定距離打數(shù)個(gè)小孔，在相鄰的兩孔內(nèi)分別放入抗原和抗體。當(dāng)抗原和抗體向四周凝膠中擴(kuò)散時(shí)，在兩孔間可出現(xiàn)沉淀線，本法常用于抗原或抗體的定性或定量檢測(cè)，或用于兩種抗原材料的抗原相關(guān)性分析。當(dāng)前第45頁(yè)\共有122頁(yè)\編于星期五\2點(diǎn)當(dāng)前第46頁(yè)\共有122頁(yè)\編于星期五\2點(diǎn)3、免疫電泳技術(shù)

免疫電泳技術(shù)是電泳分析與沉淀反應(yīng)的結(jié)合產(chǎn)物。兩大優(yōu)點(diǎn)：

一是加快了沉淀反應(yīng)的速度二是將某些蛋白組分利用其帶電荷的不同而將其分開，再分別與抗體反應(yīng)，以此作更細(xì)微的分析。免疫電泳包括:血清免疫電泳、對(duì)流免疫電泳、火箭電泳、免疫印跡等

當(dāng)前第47頁(yè)\共有122頁(yè)\編于星期五\2點(diǎn)（1）血清免疫電泳

將抗原混合物在凝膠中用電泳分離后，沿電泳方向挖一平行的小槽，加入抗血清，進(jìn)行雙向擴(kuò)散。沉淀線的特點(diǎn)顯示病人血清與正常人血清存在的差異，即血清蛋白組分的缺少或增加。當(dāng)前第48頁(yè)\共有122頁(yè)\編于星期五\2點(diǎn)當(dāng)前第49頁(yè)\共有122頁(yè)\編于星期五\2點(diǎn)(2)對(duì)流免疫電泳(counterimmunoelectrophoresis)是將雙向免疫擴(kuò)散與電泳相結(jié)合的一種技術(shù)當(dāng)前第50頁(yè)\共有122頁(yè)\編于星期五\2點(diǎn)（3）火箭免疫電泳火箭免疫電泳技術(shù)又稱作單向電泳擴(kuò)散免疫沉淀試驗(yàn)，它是由單向擴(kuò)散發(fā)展起來(lái)的一項(xiàng)定量技術(shù)，實(shí)質(zhì)上是加速度的單向擴(kuò)散。當(dāng)前第51頁(yè)\共有122頁(yè)\編于星期五\2點(diǎn)是一種將高分辨率凝膠電泳和免疫化學(xué)分析技術(shù)相結(jié)合的雜交技術(shù)。

經(jīng)過(guò)PAGE分離的蛋白質(zhì)樣品，轉(zhuǎn)移到固相載體（如NC膜）上，固相載體以非共價(jià)鍵形式吸附蛋白質(zhì)，且能保持電泳分離的多肽類型及其生物學(xué)活性不變。以固相載體上的蛋白質(zhì)或多肽作為抗原，與對(duì)應(yīng)的抗體起免疫反應(yīng)，再與酶或同位素標(biāo)記的第二抗體起反應(yīng)，經(jīng)過(guò)底物顯色或放射自顯影以檢測(cè)電泳分離的蛋白成分。廣泛應(yīng)用于檢測(cè)蛋白的表達(dá)。

（4）免疫印跡westernblot當(dāng)前第52頁(yè)\共有122頁(yè)\編于星期五\2點(diǎn)kDaM1234569075604025當(dāng)前第53頁(yè)\共有122頁(yè)\編于星期五\2點(diǎn)免疫標(biāo)記技術(shù)是采用酶、熒光素、放射性核素等標(biāo)記物標(biāo)記抗原或抗體所進(jìn)行的抗原抗體反應(yīng)。免疫標(biāo)記技術(shù)既可對(duì)樣品作定性、定量檢測(cè)，也可進(jìn)行定位分析，且大大提高了方法的靈敏度，是目前應(yīng)用最廣泛的免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)。四、免疫標(biāo)記技術(shù)當(dāng)前第54頁(yè)\共有122頁(yè)\編于星期五\2點(diǎn)常見標(biāo)記免疫技術(shù)放射免疫技術(shù)酶免疫技術(shù)熒光免疫技術(shù)化學(xué)發(fā)光免疫技術(shù)免疫膠體金技術(shù)免疫印跡技術(shù)蛋白質(zhì)芯片技術(shù)

當(dāng)前第55頁(yè)\共有122頁(yè)\編于星期五\2點(diǎn)抗體制備多克隆抗體單克隆抗體標(biāo)記物與標(biāo)記方法放射性同位素、酶、熒光分子、化學(xué)和生物發(fā)光系統(tǒng)免疫分析基本環(huán)節(jié)當(dāng)前第56頁(yè)\共有122頁(yè)\編于星期五\2點(diǎn)分析方式設(shè)計(jì)

非競(jìng)爭(zhēng)方式、競(jìng)爭(zhēng)方式；

直接法、間接法；

標(biāo)記抗原、標(biāo)記抗體；

均相、非均相信號(hào)檢測(cè)

與相應(yīng)的標(biāo)記物對(duì)應(yīng)。主要為分光光度法、

熒光光度法、化學(xué)發(fā)光檢測(cè)法。當(dāng)前第57頁(yè)\共有122頁(yè)\編于星期五\2點(diǎn)是用放射性核素作為標(biāo)記物標(biāo)記抗原或抗體所進(jìn)行的抗原抗體反應(yīng)，盡管放射免疫技術(shù)需特殊儀器設(shè)備且有一定的放射性危害，但由于其具有高度的靈敏度（pg）和自動(dòng)化檢測(cè)等特點(diǎn)，因此在實(shí)驗(yàn)研究和臨床檢測(cè)中仍被廣泛應(yīng)用。主要用于激素、小分子藥物、腫瘤標(biāo)志物等小分子化合物的定量分析。1.放射免疫技術(shù)當(dāng)前第58頁(yè)\共有122頁(yè)\編于星期五\2點(diǎn)放射免疫分析－基本原理競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合反應(yīng)的經(jīng)典標(biāo)記抗原（Ag*）和非標(biāo)記抗原（Ag）與限量抗體(Ab)競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合Ag*和Ag具有等同的與Ab結(jié)合能力當(dāng)前第59頁(yè)\共有122頁(yè)\編于星期五\2點(diǎn)

Ag*AbAg

標(biāo)記抗原特異性抗體待測(cè)抗原(Ag*-Ab)+(Ag-Ab)抗原抗體復(fù)合物分離Ag*-Ab和游離Ag*從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀知含量

測(cè)定Ag*-Ab和游離Ag*放射性

放射免疫測(cè)定法(RIA)示意圖當(dāng)前第60頁(yè)\共有122頁(yè)\編于星期五\2點(diǎn)將熒光素（異硫氰酸熒光素或羅丹明等）標(biāo)記抗體，制成熒光抗體診斷試劑。用熒光顯微鏡觀察熒光的產(chǎn)生或熒光強(qiáng)度，以此判斷抗原的存在、定位和分布情況。免疫熒光技術(shù)有直接法和間接法等。2.免疫熒光技術(shù)當(dāng)前第61頁(yè)\共有122頁(yè)\編于星期五\2點(diǎn)免疫熒光技術(shù)——直接法AgY熒光素標(biāo)記的特異性抗體組織切片或細(xì)胞當(dāng)前第62頁(yè)\共有122頁(yè)\編于星期五\2點(diǎn)免疫熒光技術(shù)——間接法AgYY熒光素標(biāo)記的抗抗體組織切片或細(xì)胞待測(cè)抗體當(dāng)前第63頁(yè)\共有122頁(yè)\編于星期五\2點(diǎn)免疫熒光染色顯示細(xì)胞骨架

免疫熒光染色是利用抗原－抗體特異性結(jié)合的原理，用經(jīng)熒光染料標(biāo)記的抗體對(duì)細(xì)胞或組織內(nèi)的蛋白質(zhì)進(jìn)行定性或定量研究的方法。該技術(shù)與熒光顯微鏡觀察相結(jié)合，可對(duì)特定的蛋白質(zhì)進(jìn)行細(xì)胞或組織內(nèi)的精確定位。常用于抗原、抗體標(biāo)記的熒光染料有以下幾種：顯示綠色熒光：Fluoresceinisothocyancie(FITC),Alexa-488顯示紅色熒光：RhodamineB（羅丹明）,TexasRed,Alexa-546,568,594顯示藍(lán)色熒光：Alexa－350,DAPI

用Alexa488標(biāo)記的抗人α-tubulin抗體染色顯示微管(綠色);細(xì)胞核:紅色,人皮膚角化細(xì)胞免疫熒光染色當(dāng)前第64頁(yè)\共有122頁(yè)\編于星期五\2點(diǎn)3、免疫酶技術(shù)概念：是用酶標(biāo)記的抗體進(jìn)行的抗原抗體反應(yīng)。將抗原-抗體反應(yīng)的特異性與酶催化作用的高效性相結(jié)合，借助酶作用于底物的顯色反應(yīng)判定結(jié)果。當(dāng)前第65頁(yè)\共有122頁(yè)\編于星期五\2點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)：⑴靈敏度高，可與放射免疫相比，檢測(cè)能力可達(dá)ng水平。⑵應(yīng)用范圍廣，既能檢測(cè)抗體又能檢測(cè)抗原，既能定性又能定量、定位。⑶不需要特殊設(shè)備，放射免疫需要特殊的實(shí)驗(yàn)室條件，免疫熒光法需要熒光顯微鏡。⑷酶標(biāo)記物有效時(shí)間較長(zhǎng)，一般低溫保存可達(dá)一年以上。當(dāng)前第66頁(yè)\共有122頁(yè)\編于星期五\2點(diǎn)⑴活性高，分解底物的能力強(qiáng)。⑵特異性強(qiáng)，即作用于底物的專一性強(qiáng)。⑶與抗原抗體結(jié)合后仍保持酶的活性。⑷與底物作用可以顯色。⑸純度高、易純化。⑹可溶性(水溶性)好，在溶液中穩(wěn)定。⑺測(cè)定方法簡(jiǎn)單。⑻來(lái)源廣、價(jià)格低。標(biāo)記酶的選擇條件：

當(dāng)前第67頁(yè)\共有122頁(yè)\編于星期五\2點(diǎn)酶底物顯色反應(yīng)測(cè)定波長(zhǎng)辣根過(guò)氧化物酶（HRP）鄰苯二胺（OPD）

3、3‘二氨基聯(lián)苯胺（DAB）

氨基水楊酸

鄰聯(lián)苯甲胺

2,2‘-連胺基-2(3-乙基-并噻唑啉磺酸-6)銨鹽橘紅色

黃色

棕色

蘭色

藍(lán)綠色492460449

425

642

堿性磷酸酯酶4-硝基酚磷酸鹽(PNP)

萘酚-AS-Mx磷酸鹽+重氮鹽黃色

紅色400

500葡萄糖氧化酶ABTS+HRP+葡萄糖

葡萄糖+甲硫酚嗪+噻唑蘭黃色

深藍(lán)色405420β-Ｄ-半乳糖苷酶甲基傘酮基半乳糖苷(4MuG)

硝基酚半乳糖苷(ONPG)熒光

黃色360,450

420以HRP最為常用，具有活力高、穩(wěn)定、分子量小、易提純等優(yōu)點(diǎn)。當(dāng)前第68頁(yè)\共有122頁(yè)\編于星期五\2點(diǎn)當(dāng)前第69頁(yè)\共有122頁(yè)\編于星期五\2點(diǎn)

酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)Enzymelinkedimmunosorbentassay簡(jiǎn)稱：ELISA1971年Engvall和Perlmann發(fā)表是一類在固相載體上進(jìn)行免疫酶染色的免疫酶標(biāo)記技術(shù)當(dāng)前第70頁(yè)\共有122頁(yè)\編于星期五\2點(diǎn)1）基本原理與類型

一種固相免疫測(cè)定技術(shù)，先將抗體或抗原包被到某種固相載體表面，并保持其免疫活性。測(cè)定時(shí)，將待檢樣本和酶標(biāo)抗原或抗體按不同步驟與固相載體表面吸附的抗體或抗原發(fā)生反應(yīng)，后加入酶標(biāo)抗體與免疫復(fù)合物結(jié)合，用洗滌的方法分離抗原抗體復(fù)合物和游離的未結(jié)合成分，最后加入酶反應(yīng)底物，根據(jù)底物被酶催化產(chǎn)生的顏色及其吸光度(A)值的大小進(jìn)行定性或定量分析的方法。當(dāng)前第71頁(yè)\共有122頁(yè)\編于星期五\2點(diǎn)

ELISA可用于測(cè)定抗原，也可用于測(cè)定抗體。有三個(gè)必要的試劑：（1）固相的抗原或抗體，即"免疫吸附劑"（immunosorbent）；（2）酶標(biāo)記的抗原或抗體，稱為"結(jié)合物"（conjugate）；（3）酶反應(yīng)的底物?？稍O(shè)計(jì)出各種不同類型的檢測(cè)方法。當(dāng)前第72頁(yè)\共有122頁(yè)\編于星期五\2點(diǎn)①

雙抗體夾心法測(cè)抗原檢測(cè)抗原最常用的方法此法適用于檢驗(yàn)各種蛋白質(zhì)等大分子抗原，例如HBsAg、HBeAg、AFP等。只要獲得針對(duì)受檢抗原的特異性抗體，就可用于包被固相載體和制備酶結(jié)合物而建立此法。用抗體包被固相載體加入抗原Sample(二價(jià)以上)，溫育加入酶標(biāo)抗體，溫育加入底物，顯色當(dāng)前第73頁(yè)\共有122頁(yè)\編于星期五\2點(diǎn)②

雙抗原夾心法測(cè)抗體

用特異性抗原進(jìn)行包被和制備酶結(jié)合物。此法中受檢標(biāo)本不需稀釋，可直接用于測(cè)定。乙肝標(biāo)志物中抗HBsAg的檢測(cè)常采用本法。本法關(guān)鍵在于酶標(biāo)抗原的制備，應(yīng)根據(jù)抗原結(jié)構(gòu)的不同，尋找合適的標(biāo)記方法。Ag固相載體酶標(biāo)抗原當(dāng)前第74頁(yè)\共有122頁(yè)\編于星期五\2點(diǎn)③

間接法測(cè)抗體

檢測(cè)抗體最常用的方法間接法的優(yōu)點(diǎn)是只要變換包被抗原就可利用同一酶標(biāo)二抗建立檢測(cè)相應(yīng)抗體的方法。當(dāng)前第75頁(yè)\共有122頁(yè)\編于星期五\2點(diǎn)用已知特異性抗體包被固相載體測(cè)定孔加待測(cè)抗原和一定量的酶標(biāo)抗原使二者與固相抗體競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合對(duì)照孔只加一定量酶標(biāo)抗原與固相抗體直接結(jié)合分別洗滌除去未結(jié)合的成分加底物顯色分別測(cè)定兩管的吸光度值，根據(jù)對(duì)照管與測(cè)定管吸光度值之比，計(jì)算標(biāo)本中待測(cè)抗原含量④競(jìng)爭(zhēng)法當(dāng)前第76頁(yè)\共有122頁(yè)\編于星期五\2點(diǎn)⑤捕獲包被法測(cè)IgM抗體IgM的檢測(cè)常用于傳染病的診斷，尤其用于病毒性感染的早期診斷。抗人IgM抗體連接在固相載體形成固相抗人IgM加底物顯色：如有顏色顯示，則表示血清標(biāo)本中的特異性IgM抗體存在（陽(yáng)性反應(yīng)）當(dāng)前第77頁(yè)\共有122頁(yè)\編于星期五\2點(diǎn)⑥

ABS-ELISA法（親和素-生物素系統(tǒng)-酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)）ABS：親和素(avidin)生物素(biotin)系統(tǒng)(system）①：固相支持物；②：樣品；③：特異性IgG；④：生物素化抗小鼠IgG抗體（Biotin）；⑤：HRP酶標(biāo)鏈親和素（Avidin）；⑥：DAB顯色液；⑦：顯色；當(dāng)前第78頁(yè)\共有122頁(yè)\編于星期五\2點(diǎn)親和素是一種糖蛋白，分子量60000，每個(gè)分子由4個(gè)能和生物素結(jié)合的亞基組成。生物素為小分子化合物，分子量244。生物素與親和素的結(jié)合具有很強(qiáng)的特異性，其親和力較抗原抗體反應(yīng)大得多，兩者一經(jīng)結(jié)合就極為穩(wěn)定。由于一個(gè)親和素可與4個(gè)生物素分子結(jié)合，因此如把ABS與ELISA法結(jié)合起來(lái)可分為酶標(biāo)記親和素-生物素（LAB）法和橋聯(lián)親和素-生物素（ABC）法兩種類型。兩者均以生物素標(biāo)記的抗體（或抗原）代替原ELISA系統(tǒng)中的酶標(biāo)抗體（抗原）。由于ABS-ELISA較普通ELISA多用了兩種試劑，增加了操作步驟，在臨床檢驗(yàn)中ABS-ELISA應(yīng)用不多?？蒲许?xiàng)目中檢測(cè)微量的成分如細(xì)胞因子常用本法。當(dāng)前第79頁(yè)\共有122頁(yè)\編于星期五\2點(diǎn)2）ELISA的一般操作方法當(dāng)前第80頁(yè)\共有122頁(yè)\編于星期五\2點(diǎn)ELISA試劑盒當(dāng)前第81頁(yè)\共有122頁(yè)\編于星期五\2點(diǎn)當(dāng)前第82頁(yè)\共有122頁(yè)\編于星期五\2點(diǎn)當(dāng)前第83頁(yè)\共有122頁(yè)\編于星期五\2點(diǎn)當(dāng)前第84頁(yè)\共有122頁(yè)\編于星期五\2點(diǎn)當(dāng)前第85頁(yè)\共有122頁(yè)\編于星期五\2點(diǎn)共同特點(diǎn)：象搭積木一樣在固相載體上一層一層疊加當(dāng)前第86頁(yè)\共有122頁(yè)\編于星期五\2點(diǎn)當(dāng)前第87頁(yè)\共有122頁(yè)\編于星期五\2點(diǎn)當(dāng)前第88頁(yè)\共有122頁(yè)\編于星期五\2點(diǎn)當(dāng)前第89頁(yè)\共有122頁(yè)\編于星期五\2點(diǎn)當(dāng)前第90頁(yè)\共有122頁(yè)\編于星期五\2點(diǎn)4、免疫膠體金標(biāo)記技術(shù)是以膠體金作為示蹤標(biāo)記物，應(yīng)用于抗原抗體反應(yīng)的一種免疫標(biāo)記技術(shù)；膠體金是由氯金酸在還原劑(如白磷、抗壞血酸、枸櫞酸鈉和鞣酸等)作用下，聚合成特定大小的金顆粒，并由于靜電作用成為一種穩(wěn)定的膠體狀態(tài)，故稱為膠體金。膠體金的光散射性與溶膠顆粒的大小密切相關(guān)，顆粒大小發(fā)生變化，光散射也隨之發(fā)生變異，產(chǎn)生肉眼可見的顯著的顏色變化。當(dāng)前第91頁(yè)\共有122頁(yè)\編于星期五\2點(diǎn)膠體金是氯金酸(HAuCl4)的水溶膠顆粒，具有高電子密度，在電鏡中顆粒致密，易于辨認(rèn)，定位比酶反應(yīng)物精確。當(dāng)前第92頁(yè)\共有122頁(yè)\編于星期五\2點(diǎn)早孕試紙條：兩條杠，檢測(cè)迅速，靈敏度高當(dāng)前第93頁(yè)\共有122頁(yè)\編于星期五\2點(diǎn)膠體金快速診斷技術(shù)的特點(diǎn)

簡(jiǎn)捷快速：操作簡(jiǎn)單，一般只要5-10min就會(huì)出結(jié)果，而其它方法如ELISA需要1-2h，PCR需要時(shí)間更長(zhǎng)。結(jié)果易于判定：陰、陽(yáng)性呈色很明顯，肉眼很容易判斷。特異性好：用單克隆抗體標(biāo)記，具有很好的特異性。當(dāng)前第94頁(yè)\共有122頁(yè)\編于星期五\2點(diǎn)單個(gè)核細(xì)胞的分離淋巴細(xì)胞亞群的分離T細(xì)胞功能檢測(cè)B細(xì)胞功能檢測(cè)種類免疫細(xì)胞及其亞類分離、鑒定和檢測(cè)淋巴細(xì)胞功能測(cè)定T細(xì)胞的鑒定和檢測(cè)B細(xì)胞的鑒定和檢測(cè)第三節(jié)

檢測(cè)淋巴細(xì)胞及其功能的體外試驗(yàn)當(dāng)前第95頁(yè)\共有122頁(yè)\編于星期五\2點(diǎn)一、細(xì)胞分離原理1、基于細(xì)胞的物理特性

1）細(xì)胞比重差異

2）細(xì)胞的粘附性

3）細(xì)胞對(duì)滲透壓改變的敏感性2、基于細(xì)胞表面的特異性標(biāo)志物

1）免疫磁珠分離法

2）流式細(xì)胞術(shù)當(dāng)前第96頁(yè)\共有122頁(yè)\編于星期五\2點(diǎn)3、血液細(xì)胞的組成及比重外周血紅細(xì)胞粒細(xì)胞單個(gè)核細(xì)胞血小板淋巴細(xì)胞單核細(xì)胞1.0931.030~1.0351.075~1.0901.092當(dāng)前第97頁(yè)\共有122頁(yè)\編于星期五\2點(diǎn)

原理：外周血各種血細(xì)胞的比重不同，利用淋巴細(xì)胞分層液作密度梯度離心，使一定比重的細(xì)胞群按相應(yīng)密度梯度分布，從而將各種血細(xì)胞加以分離。常用的分層液有Ficoll和Percoll兩種。一）單個(gè)核細(xì)胞分離密度梯度離心法二、細(xì)胞分離方法當(dāng)前第98頁(yè)\共有122頁(yè)\編于星期五\2點(diǎn)離心后PBMC紅細(xì)胞粒細(xì)胞Ficoll/60%Percoll稀釋外周血稀釋的血漿、血小板Ficoll/60%Percoll當(dāng)前第99頁(yè)\共有122頁(yè)\編于星期五\2點(diǎn)二）淋巴細(xì)胞亞群的分離尼龍棉分離法E花環(huán)分離法洗淘法流式細(xì)胞術(shù)混合單個(gè)核細(xì)胞懸液在通過(guò)尼龍毛柱時(shí)，B細(xì)胞、漿細(xì)胞、單核細(xì)胞被選擇性粘附于尼龍毛上，多數(shù)T細(xì)胞則通過(guò)尼龍毛柱人T細(xì)胞與SRBC結(jié)合形成E花結(jié)，經(jīng)密度梯度離心，花結(jié)形成細(xì)胞沉于管底；用低滲裂解花結(jié)中的SRBC即獲得T細(xì)胞。將已知抗特定標(biāo)志的抗體包被培養(yǎng)板，加入淋巴細(xì)胞懸液，相應(yīng)的細(xì)胞即結(jié)合于培養(yǎng)板表面，與懸液中的其他細(xì)胞分離。借助流式細(xì)胞儀對(duì)細(xì)胞快速鑒定和分類、并進(jìn)行多參數(shù)定量測(cè)定和綜合分析的技術(shù)。磁珠分離將特異性抗體與磁性微粒交聯(lián)，與表達(dá)相應(yīng)膜抗原的細(xì)胞結(jié)合，應(yīng)用強(qiáng)磁場(chǎng)分離所吸附的細(xì)胞，從而對(duì)特定的細(xì)胞進(jìn)行分選當(dāng)前第100頁(yè)\共有122頁(yè)\編于星期五\2點(diǎn)流式細(xì)胞術(shù)概念:流式細(xì)胞儀

(flowcytometer,FCM)：是集光電子物理，光電測(cè)量，計(jì)算機(jī)，細(xì)胞熒光化學(xué)，單抗技術(shù)為一體的高科技細(xì)胞分析儀。流式細(xì)胞術(shù)

(flowcytometry)：利用流式細(xì)胞儀對(duì)處于快速流動(dòng)的細(xì)胞或生物顆粒進(jìn)行多參數(shù)、快速的定量分析和分選的技術(shù)。又稱熒光激活細(xì)胞分選儀分離法（FACS）當(dāng)前第101頁(yè)\共有122頁(yè)\編于星期五\2點(diǎn)機(jī)型1.分析型流式細(xì)胞儀：檢測(cè)標(biāo)記細(xì)胞的百分比含量。同時(shí)檢測(cè)四色不同染色的細(xì)胞。2.分選型流式細(xì)胞儀：無(wú)菌獲取陽(yáng)性細(xì)胞，以進(jìn)一步培養(yǎng)。同時(shí)獲取四色不同染色的細(xì)胞。流式細(xì)胞術(shù)可以同時(shí)鑒別單個(gè)細(xì)胞上的多種抗原，而且可以在極短時(shí)間內(nèi)分析大量細(xì)胞。當(dāng)前第102頁(yè)\共有122頁(yè)\編于星期五\2點(diǎn)流式細(xì)胞儀的工作原理光學(xué)系統(tǒng)

激光光源 光收集系統(tǒng)液流系統(tǒng)

流動(dòng)室液流驅(qū)動(dòng)系統(tǒng)電子系統(tǒng)

光電轉(zhuǎn)換 數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)細(xì)胞分選系統(tǒng)當(dāng)前第103頁(yè)\共有122頁(yè)\編于星期五\2點(diǎn)特點(diǎn)

1、各種組織細(xì)胞均可用于分析，如血液、骨髓、體液中的細(xì)胞、培養(yǎng)細(xì)胞等，實(shí)體組織經(jīng)處理后制成單細(xì)胞懸液均能分析。2、測(cè)量速度快，每分鐘能測(cè)量數(shù)千至數(shù)萬(wàn)個(gè)細(xì)胞。3、可進(jìn)行多參數(shù)的分析，可同時(shí)檢測(cè)四種不同熒光染色的細(xì)胞。新一代的流式可同時(shí)檢測(cè)十多色的細(xì)胞。4、可將目的細(xì)胞無(wú)菌分選出來(lái)做進(jìn)一步的培養(yǎng)。當(dāng)前第104頁(yè)\共有122頁(yè)\編于星期五\2點(diǎn)三、淋巴細(xì)胞的功能檢測(cè)

淋巴細(xì)胞功能測(cè)定可分為體內(nèi)實(shí)驗(yàn)和體外實(shí)驗(yàn)。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)主要是間接了解淋巴細(xì)胞對(duì)抗原、半抗原或有絲分裂原的應(yīng)答反應(yīng)；體外實(shí)驗(yàn)主要包括淋巴細(xì)胞對(duì)抗原或有絲分裂原刺激后的增殖反應(yīng)、細(xì)胞毒性試驗(yàn)及淋巴細(xì)胞分泌產(chǎn)物的測(cè)定。

當(dāng)前第105頁(yè)\共有122頁(yè)\編于星期五\2點(diǎn)(一)T細(xì)胞功能的檢測(cè)T細(xì)胞增殖試驗(yàn)T細(xì)胞分泌功能測(cè)定T細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒試驗(yàn)體內(nèi)試驗(yàn)當(dāng)前第106頁(yè)\共有122頁(yè)\編于星期五\2點(diǎn)1、T淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn)1）原理：T淋巴細(xì)胞DNA合成分化母細(xì)胞刺激物細(xì)胞變大細(xì)胞漿擴(kuò)大空泡核仁明顯核染色質(zhì)疏松當(dāng)前第107頁(yè)\共有122頁(yè)\編于星期五\2點(diǎn)2）淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化的刺激物非特異性刺激物：

PHAT細(xì)胞

ConAT細(xì)胞

PWMT、B細(xì)胞

LPSB細(xì)胞特異性刺激物：異種抗原