蛋白質(zhì)的分離與提純的新方法雜談：以蛋白質(zhì)和結(jié)構(gòu)與功能為基礎(chǔ)，從分子水平上認(rèn)識生命現(xiàn)象，已經(jīng)成為現(xiàn)代生物學(xué)發(fā)展的主要方向，研究蛋白質(zhì)，首先要得到高度純化并具有生物活性的目的物質(zhì)。蛋白質(zhì)的制備工作涉及物理、化學(xué)和生物等各方面知識，但基本原理不外乎兩方面。一是得用混合物中幾個(gè)組分分配率的差別，把它們分配到可用機(jī)械方法分離的兩個(gè)或幾個(gè)物相中，如鹽析，有機(jī)溶劑提取，層析和結(jié)品等；二是將混合物置于單一物相中，通過物理力場的作用使各組分分配于來同區(qū)域而達(dá)到分離目的，如電泳，超速離心，超濾等。在所有這些方法的應(yīng)用中必須注意保存生物大分子的完整性，防止酸、堿、高溫，劇烈機(jī)械作用而導(dǎo)致所提物質(zhì)生物活性的喪失。蛋白質(zhì)的制備一般分為以下四個(gè)階段：選擇材料和預(yù)處理，細(xì)胞的破碎及細(xì)胞器的分離，提取和純化，濃細(xì)、干燥和保存。微生物、植物和動(dòng)物都可做為制備蛋白質(zhì)的原材料，所選用的材料主要依據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康膩泶_定。對于微生物，應(yīng)注意它的生長期，在微生物的對數(shù)生長期，酶和核酸的含量較高，可以獲得高產(chǎn)量，以微生物為材料時(shí)有兩種情況：（1）得用微生物菌體分泌到培養(yǎng)基中的代謝產(chǎn)物和胞外酶等；（2）利用菌體含有的生化物質(zhì)，如蛋白質(zhì)、核酸和胞內(nèi)酶等。植物材料必須經(jīng)過去殼，脫脂并注意植物品種和生長發(fā)育狀況不同，其中所含生物大分子的量變化很大，另外與季節(jié)性關(guān)系密切。對動(dòng)物組織，必須選擇有效成份含量豐富的臟器組織為原材料，先進(jìn)行絞碎、脫脂等處理。另外，對預(yù)處理好的材料，若不立即進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，應(yīng)冷凍保存，對于易分解的生物大分子應(yīng)選用新鮮材料制備。蛋白質(zhì)的分離純化分離與提純的新方法：（一）根據(jù)蛋白質(zhì)溶解度不同的分離方法1、蛋白質(zhì)的鹽析中性鹽對蛋白質(zhì)的溶解度有顯著影響，一般在低鹽濃度下隨著鹽濃度升高，蛋白質(zhì)的溶解度增加，此稱鹽溶；當(dāng)鹽濃度繼續(xù)升高時(shí)，蛋白質(zhì)的溶解度不同程度下降并先后析出，這種現(xiàn)象稱鹽析，將大量鹽加到蛋白質(zhì)溶液中，高濃度的鹽離子（如硫酸銨的SO4和NH4）有很強(qiáng)的水化力，可奪取蛋白質(zhì)分子的水化層，使之“失水”，于是蛋白質(zhì)膠粒凝結(jié)并沉淀析出。鹽析時(shí)若溶液pH在蛋白質(zhì)等電點(diǎn)則效果更好。由于各種蛋白質(zhì)分子顆粒大小、親水程度不同，故鹽析所需的鹽濃度也不一樣，因此調(diào)節(jié)混合蛋白質(zhì)溶液中的中性鹽濃度可使各種蛋白質(zhì)分段沉淀。影響鹽析的因素有：（1）溫度：除對溫度敏感的蛋白質(zhì)在低溫（4度）操作外，一般可在室溫中進(jìn)行。一般溫度低蛋白質(zhì)溶介度降低。但有的蛋白質(zhì)（如血紅蛋白、肌紅蛋白、清蛋白）在較高的溫度（25度）比0度時(shí)溶解度低，更容易鹽析。（2）pH值：大多數(shù)蛋白質(zhì)在等電點(diǎn)時(shí)在濃鹽溶液中的溶介度最低。（3）蛋白質(zhì)濃度：蛋白質(zhì)濃度高時(shí)，欲分離的蛋白質(zhì)常常夾雜著其他蛋白質(zhì)地一起沉淀出來（共沉現(xiàn)象）。因此在鹽析前血清要加等量生理鹽水稀釋，使蛋白質(zhì)含量在2.5-3.0%。蛋白質(zhì)鹽析常用的中性鹽，主要有硫酸銨、硫酸鎂、硫酸鈉、氯化鈉、磷酸鈉等。其中應(yīng)用最多的硫酸銨，它的優(yōu)點(diǎn)是溫度系數(shù)小而溶解度大（25度時(shí)飽和溶液為4.1M，即767克/升；0度時(shí)飽和溶解度為3.9M，即676克/升），在這一溶解度范圍內(nèi)，許多蛋白質(zhì)和酶都可以鹽析出來；另外硫酸銨分段鹽析效果也比其他鹽好，不易引起蛋白質(zhì)變性。硫酸銨溶液的pH常在4.5-5.5之間，當(dāng)用其他pH值進(jìn)行鹽析時(shí)，需用硫酸或氨水調(diào)節(jié)。蛋白質(zhì)在用鹽析沉淀分離后，需要將蛋白質(zhì)中的鹽除去，常用的辦法是透析，即把蛋白質(zhì)溶液裝入秀析袋內(nèi)（常用的是玻璃紙），用緩沖液進(jìn)行透析，并不斷的更換緩沖液，因透析所需時(shí)間較長，所以最好在低溫中進(jìn)行。此外也可用葡萄糖凝膠G-25或G-50過柱的辦法除鹽，所用的時(shí)間就比較短。2、 等電點(diǎn)沉淀法蛋白質(zhì)在靜電狀態(tài)時(shí)顆粒之間的靜電斥力最小，因而溶解度也最小，各種蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)有差別，可利用調(diào)節(jié)溶液的pH達(dá)到某一蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)使之沉淀，但此法很少單獨(dú)使用，可與鹽析法結(jié)合用。3、 低溫有機(jī)溶劑沉淀法用與水可混溶的有機(jī)溶劑，甲醇，乙醇或丙酮，可使多數(shù)蛋白質(zhì)溶解度降低并析出，此法分辨力比鹽析高，但蛋白質(zhì)較易變性，應(yīng)在低溫下進(jìn)行。前處理把蛋白質(zhì)從原來的組織或溶解狀態(tài)釋放出來，保持原來的天然狀態(tài)，并不丟失生物活性。常用的方法：勻漿器破碎、超生波破碎、纖維素酶處理以及溶菌酶等。超聲波破碎法：當(dāng)聲波達(dá)到一定頻率時(shí)，使液體產(chǎn)生空穴效應(yīng)使細(xì)胞破碎的技術(shù)。超聲波引起的快速振動(dòng)使液體局部產(chǎn)生低氣壓，這個(gè)低氣壓使液體轉(zhuǎn)化為氣體，即形成很多小氣泡。由于局部壓力的轉(zhuǎn)換，壓力重新升高，氣泡崩潰。崩潰的氣泡產(chǎn)生一個(gè)振動(dòng)波并傳送到液體中，形成剪切力使細(xì)胞破碎。粗分級分離可用鹽析、等電點(diǎn)沉淀和有機(jī)溶劑分級分離等方法。這些方法的特點(diǎn)是簡便、處理量大，細(xì)分級樣品的進(jìn)一步純化。樣品經(jīng)粗分離以后，一般體積較小，雜蛋白大部分已被除去。進(jìn)一步純化，一般使用層析法包括凝膠過濾、離子交換層析、吸附層析以及親和層析等。必要時(shí)還可選擇電泳、等電聚焦等作為最后的純化步驟。結(jié)晶是最后的一步分離純化的方法：1.分子大小；2.溶解度；3.電荷；4.吸附性質(zhì)；5.對配體分子的生物親和力等。（一）根據(jù)分子大小不同的純化方法透析利用蛋白質(zhì)分子不能通過半透膜，使蛋白質(zhì)和其它小分子物質(zhì)如無機(jī)鹽、單糖等分開。密度梯度離心。蛋白質(zhì)顆粒的沉降系數(shù)不僅決定于它的大小，而且也取決于它的密度。凝膠過濾利用蛋白質(zhì)分子大小，因?yàn)槟z過濾所用的介質(zhì)是凝膠珠，其內(nèi)部是多孔的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。當(dāng)不同的分子大小的蛋白質(zhì)分子流過凝膠層析柱時(shí)，比凝膠珠孔徑大的分子進(jìn)入珠內(nèi)的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，而被排阻在凝膠珠之外隨溶劑在凝膠珠之間的空隙向下移動(dòng)并最先流出柱外，比網(wǎng)孔小的分子能不同程度底自由出入凝膠珠的內(nèi)外，由于不同大小的分子所經(jīng)路徑不同而得到分離。大分子先被洗脫下來。小分子后被洗脫（二）利用溶解度差別的純化方法等電點(diǎn)沉淀和PH的控制蛋白質(zhì)處于等電點(diǎn)時(shí)，其凈電荷為零，由于相鄰蛋白質(zhì)分子之間沒有靜電斥力而聚集沉淀。因此在其他條件相同時(shí)，它的溶解度達(dá)到最底點(diǎn)，利用等電點(diǎn)分離蛋白質(zhì)是一種常用的方法。蛋白質(zhì)的鹽溶和鹽析中性鹽可以增加蛋白質(zhì)的溶解度，這種現(xiàn)象稱為鹽溶。鹽溶作用是由于蛋白質(zhì)分子吸附某種鹽類離子后，帶電層使蛋白質(zhì)分子彼此排斥，而蛋白質(zhì)分子與水相互作用加強(qiáng)了，因而溶解度增加當(dāng)溶液的離子強(qiáng)度增加到一定數(shù)值時(shí)，蛋白質(zhì)的溶解度開始下降。當(dāng)離子強(qiáng)度足夠高時(shí)，很多蛋白質(zhì)可以從水溶液中沉淀出來，這種現(xiàn)象稱為鹽析。鹽析作用的主要原因是大量中性鹽的加入使水的活性降低，原來溶液的大部分甚至全部的自由基水轉(zhuǎn)變成鹽離子的水化水展望：在實(shí)際工作中，很難用單一方法實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)的分離純化，往往要綜合幾種方法才能提純出一種蛋白質(zhì)。理想的蛋白質(zhì)分離提純方法，要求產(chǎn)品純度和總回收率越高越好，但實(shí)際上兩者難以兼顧，因此,考慮分離提純的條件和方法時(shí)，不得不在兩者之間作適當(dāng)?shù)倪x擇;一般情況下，科研上更多地選擇前者,工業(yè)生產(chǎn)上更多地選擇后者。因此，每當(dāng)需要提純某種蛋白質(zhì)時(shí),首先要明確分離純化的目的和蛋白質(zhì)的性質(zhì)，以便選擇最佳的分離純化方法,從而得到理想的效果。今后，蛋白質(zhì)提純技術(shù)的發(fā)展將不斷促進(jìn)對蛋白質(zhì)性質(zhì)的研究，同時(shí)對蛋白質(zhì)性質(zhì)的研究也將反過來提高蛋白質(zhì)分離純化技術(shù)，兩者的互相促進(jìn)終將會對生命科學(xué)的進(jìn)步作出重大貢獻(xiàn)參考文獻(xiàn)：李鳳英，崔蕊靜等蛋白質(zhì)的提取工節(jié)研究。中國油脂。郭榮榮，潘思軼，王可興。堿法與酶法從脫脂米糠中提取蛋白質(zhì)。糧油加工與