病毒學第七章病毒基因第一頁，共五十四頁，編輯于2023年，星期日本章重點1.幾種重要的基因工程載體2.噬菌體展示的原理第二頁，共五十四頁，編輯于2023年，星期日人們研究病毒，一方面是為了控制病毒性疾病，另一方面也是為了利用病毒服務人類。1953年Watson和Crick發(fā)現(xiàn)了DNA雙螺旋結構，開創(chuàng)了分子生物學的新時代。1970年H.M.Temin和D.Baltimore對RNA腫瘤病毒反轉錄酶的發(fā)現(xiàn)，不僅使DNA復制的中心法則得以完善和發(fā)展，同時使RNA反轉錄為cDNA成為實驗室常規(guī)手段，也使基因工程這門學科得到了飛速的發(fā)展。第三頁，共五十四頁，編輯于2023年，星期日病毒基因工程就是利用重組DNA技術，以病毒為載體，高效表達病毒基因及其它外源基因或者對病毒基因組進行改造，用于制備防治病毒性疾病的疫苗、殺蟲劑、進行基因治療及開展有關蛋白功能研究。第四頁，共五十四頁，編輯于2023年，星期日第一節(jié)病毒載體一、噬菌體載體1、λ噬菌體線狀dsDNA，總長度為48502bp，在DNA分子的兩端各有一條由12個核苷酸組成的彼此完全互補的5’單鏈突出序列，即黏性末端。λ噬菌體DNA進入寄主細胞后，通過兩個末端互補結合形成黏性末端位點，使DNA環(huán)化，開始復制。

第五頁，共五十四頁，編輯于2023年，星期日第六頁，共五十四頁，編輯于2023年，星期日λ噬菌體整個基因組可分為三個部分①左臂：從A到J長約20kb，其中的基因編碼構成頭部、尾部、尾絲對組裝完整噬菌體所需要的結構蛋白質。②中段：長約20kb，位于基因J和N之間，是λDNA整合和切出，溶原生長所需的序列。③右臂：長約10kb，是調控區(qū)，控制溶菌和溶原生長最重要的調控基因和序列、以及λDNA復制起始均在這區(qū)域內。

左右臂包含λDNA復制、噬菌體結構蛋白合成、組裝成熟噬菌體、溶菌生長所需全部序列；對溶菌生長來說，中段是非必需的。第七頁，共五十四頁，編輯于2023年，星期日λ噬菌體的改造2、λ噬菌體的缺陷與改造λ噬菌體的缺陷：⑴基因組太大（49kb）；⑵酶切點太多，它有5個BamH1位點（G↓GATCC），6個BgⅠ位點（A↓GATCT），5個EcoRⅠ位點（G↓AATTC）。⑶野生型只能接納一定長度的DNA。接納49kb×5%=2.45kb的DNA。λ噬菌體的改造⑴切去非必須區(qū)段，在切去的同時，加載目的基因（2.5kb或更大）；⑵去處太多的酶位點，每種酶只留1-2個切口；⑶增加標記基因（remarkergene）。

第八頁，共五十四頁，編輯于2023年，星期日（1）插入型載體：λ噬菌體載體相對于質粒載體來說，克隆片段較大，所以一般用于cDNA文庫或基因組文庫的構建，一般容許插入5-7kb外來DNA。cI基因插入失活：如λgt10、λNM1149等載體，在cI基因上有EcoRI及HindIII的酶切位點。外源基因插入后將導致cI基因的失活。cI基因失活后將導致噬菌體不能溶原化，產生清晰的噬菌斑。LacZ基因插入失活：如charon16A載體，在非必須區(qū)段引入lacZ基因，在lacZ基因上有EcoRI位點，插入失活后利用X-gal法篩選（蘭白篩選）。

第九頁，共五十四頁，編輯于2023年，星期日

cIEcoRI

LA32.7RA10.6

λgt10

lacZLA19.9RA21.9EcoRI

Charon16A第十頁，共五十四頁，編輯于2023年，星期日

是重組子篩選的一種方法：是根據(jù)載體的遺傳特征篩選重組子，如α-互補、抗生素基因等?，F(xiàn)在使用的許多載體都帶有一個大腸桿菌的DNA的短區(qū)段，其中有β-半乳糖苷酶基因（lacZ）的調控序列和前146個氨基酸的編碼信息。在這個編碼區(qū)中插入了一個多克隆位點（MCS），它并不破壞讀框，但可使少數(shù)幾個氨基酸插入到β-半乳糖苷酶的氨基端而不影響功能，這種載體適用于可編碼β-半乳糖苷酶C端部分序列的宿主細胞。因此，宿主和質粒編碼的片段雖都沒有酶活性，但它們同時存在時，可形成具有酶學活性的蛋白質。這樣，lacZ基因在缺少近操縱基因區(qū)段的宿主細胞與帶有完整近操縱基因區(qū)段的質粒之間實現(xiàn)了互補，稱為α-互補。由α-互補而產生的LacZ+細菌在誘導劑IPTG的作用下，在生色底物X-Gal存在時產生藍色菌落，因而易于識別。然而，當外源DNA插入到質粒的多克隆位點后，幾乎不可避免地導致無α-互補能力的氨基端片段，使得帶有重組質粒的細菌形成白色菌落。這種重組子的篩選，又稱為藍白斑篩選。第十一頁，共五十四頁，編輯于2023年，星期日（2）替換型載體：只有DNA的長度大于野生型的75%而不超過105%，才能包裝成噬菌體。插入外源基因20kb。沒有外源基因插入的噬菌體不能包裝。（3）cos質粒：如果將左右臂和中段都去除，僅留下λDNA兩端包裝噬菌體所必需的cos序列，再加上質粒的復制序列、標志基因、多克隆位點等，就可構成cos質粒或稱為粘粒的載體。粘粒可插入45kb長的外源DNA，然后用λ噬菌體外殼蛋白包裝成噬菌體，感染大腸桿菌后，粘粒的DNA能以質粒的形式在細菌中繁殖而被克隆。所以粘粒主要用于DNA文庫的構建。第十二頁，共五十四頁，編輯于2023年，星期日第十三頁，共五十四頁，編輯于2023年，星期日第十四頁，共五十四頁，編輯于2023年，星期日2、絲狀噬菌體大腸桿菌的M13噬菌體為單鏈環(huán)狀DNAM13噬菌體的生物學特性：M13噬菌體的外型呈絲狀，由外殼包裝蛋白和正鏈DNA組成。DNA全長6407個核苷酸，基因組90%以上的序列可編碼蛋白質，DNA上有11個基因，基因之間的間隔區(qū)多為幾個堿基。較大的間隔位于基因Ⅷ和基因Ⅲ以及基因Ⅱ和基因Ⅳ之間，其間有調節(jié)基因表達和DNA合成的元件。成熟的噬菌體只感染雄性大腸桿菌，M13噬菌體不裂解宿主細胞，但抑制其生長。

2700個外殼蛋白分子第十五頁，共五十四頁，編輯于2023年，星期日M13噬菌體基因組可編碼3類蛋白質:復制蛋白(基因Ⅱ，Ⅴ和Ⅹ)形態(tài)發(fā)生蛋白(基因Ⅰ，Ⅳ和Ⅺ)結構蛋白(基因Ⅲ、Ⅵ、Ⅶ、Ⅷ和Ⅸ)。基因組DNA為正鏈，按基因Ⅱ至基因Ⅳ方向合成，與噬菌體的mRNA序列同義。

第十六頁，共五十四頁，編輯于2023年，星期日大腸桿菌的M13單鏈噬菌體DNAM13DNA載體的構建：IIIVIIIVIIXVVIIIXVIII野生型M13RF-DNAIIIVIIIVIIXVVIIIXVIIIM13mp系列載體lacZpolylinker第十七頁，共五十四頁，編輯于2023年，星期日第十八頁，共五十四頁，編輯于2023年，星期日大腸桿菌的M13單鏈噬菌體DNAM13噬菌體的生物學特性：

感染周期+DNA（+）DNARFDNARFDNARFDNA+DNAIIVθ復制滾環(huán)復制+DNAθ復制第十九頁，共五十四頁，編輯于2023年，星期日

在宿主細胞內，感染性的單鏈噬菌體DNA（正鏈）在宿主酶的作用下轉變成環(huán)狀雙鏈DNA，用于DNA的復制，因此這種雙鏈DNA稱為復制型DNA（replicativeformDNA），即RFDNA。通過θ復制方式，RFDNA進行擴增，基因的轉錄也隨即開始?；蚪M中的任意一個啟動子都可以啟動基因的轉錄，單方向地終止于下游的終止子。啟動子和終止子的位置關系使得靠近終止子的基因轉錄更頻繁。

第二十頁，共五十四頁，編輯于2023年，星期日

當基因Ⅱ蛋白在親代RFDNA的正鏈特定位點上產生一個切口時，便啟動噬菌體基因組進行滾環(huán)復制。此時，在大腸桿菌的DNA聚合酶Ⅰ的作用下，以負鏈為模板在切口的3'末端加入核苷酸，并持續(xù)DNA的合成，用新合成的DNA替換原有的正鏈。當復制叉環(huán)繞模板整整一周時，被取代的正鏈由基因Ⅱ產物切去，經環(huán)化后形成單位長度的噬菌體基因組DNA。在感染開始的15～20分鐘內，這些子代正鏈在宿主細胞酶的作用下，又轉變成RFDNA，然后以之為模板繼續(xù)轉錄并繼續(xù)合成子代正鏈DNA。第二十一頁，共五十四頁，編輯于2023年，星期日

當感染細胞內累計有100-200個RFDNA時，細胞內也產生了足夠的單鏈DNA結合蛋白，即基因Ⅴ蛋白。該蛋白可以抑制翻譯活性，特別是抑制基因ⅡmRNA的翻譯，并且強烈地結合在新合成的正鏈DNA上，阻止其轉化成RFDNA。此時，DNA的合成幾乎只產生子代正鏈DNA。另外，基因Ⅹ蛋白和基因Ⅴ蛋白也是噬菌體特異DNA合成的強力抑制子，從而限制感染細胞內RFDNA的數(shù)量。結果，感染細胞內RFDNA的數(shù)目和子代正鏈DNA的產生速率都能保持適度。

第二十二頁，共五十四頁，編輯于2023年，星期日單鏈DNA的酶切和連接是比較困難的，因此M13噬菌體在用作載體時是利用其雙鏈狀態(tài)的RFDNA。RFDNA很容易從感染細胞中純化出來，可以象質粒一樣進行操作，并可通過轉化方法再次導入細胞。成熟的噬菌體顆粒僅能感染E.coli的F+細胞，這是因為這種噬菌體的感染位點在性散毛上。但是無論是RFDNA或ssDNA都能轉染E.coli的F+或F-細胞。第二十三頁，共五十四頁，編輯于2023年，星期日M13噬菌體載體

6.4kb單鏈環(huán)狀正鏈DNA基因組。作載體的優(yōu)點：

(1)RFDNA和SSDNA都可轉染E.coli，產生噬菌斑；

(2)無包裝限制問題（可6倍于M13基因組）；

(3)復制以雙鏈環(huán)形DNA為中間媒介；

(4）易測出外源DNA的插入方向；

(5）可產生能直接測序的單鏈DNA分子。第二十四頁，共五十四頁，編輯于2023年，星期日二、典型的桿狀病毒表達系統(tǒng)

昆蟲桿狀病毒表達載體系統(tǒng)（bculovrirusexpressionvectorsystem，BEVS）于20世紀

80年代初期問世，已被公認為當今基因工程四大表達系統(tǒng)（即桿狀病毒、大腸桿菌、酵母、哺乳動物細胞表達系統(tǒng)）之一，應用最廣的是苜蓿丫紋夜蛾核型多角體病毒(AcMNPV)與S9細胞系。

第二十五頁，共五十四頁，編輯于2023年，星期日

AcMNPV是有囊膜的閉合環(huán)狀dsDNA病毒，的基因表達分為4個階段：立即早期基因表達、早期基因表達、晚期基因表達和極晚期基因表達。其中在極晚期基因表達過程中，有兩種高效表達的蛋白，它們是多角體蛋白和P10蛋白。多角體蛋白是形成包涵體的主要成分，感染后期在細胞中的積累可高達30％～50％，是病毒復制非必需成分，但對病毒粒子卻有保護作用，可使之保持穩(wěn)定和感染能力。另一類高效表達的極晚期蛋白為P10蛋白，也是一類病毒復制非必需成分，可在細胞中形成纖維狀物質，可能與細胞溶解有關。多角體基因和

P10基因現(xiàn)在都已被定位和克隆，這兩個基因的啟動子具有較強的啟動能力，因此這兩個基因位點成為桿狀病毒表達載體系統(tǒng)理想的外源基因插入位點。第二十六頁，共五十四頁，編輯于2023年，星期日

AcNPV病毒用作外源基因的表達載體，通常是通過體內同源重組的方法，用外源基因替代多角體蛋白基因而構建重組病毒。BEVS通常由轉移載體、親本病毒和重組介質三部分組成，其技術路線分以下幾步：①先將外源片段克隆到轉移載體質粒中，置于桿狀病毒啟動子控制之下，上下游各有一段與親本病毒DNA相匹配的側翼序列，構建成轉移載體；②然后把轉移載體和野生型病毒共轉染昆蟲細胞，通過同源重組將外源片段插入到病毒基因組；③再以特定的篩選標記和方法獲得重組病毒。第二十七頁，共五十四頁，編輯于2023年，星期日同源重組

發(fā)生在同源序列間的重組稱為同源重組(homologousrecombination)，又稱基本重組。是最基本的DNA重組方式，通過鏈的斷裂和再連接，在兩個DNA分子同源序列間進行單鏈或雙鏈片段的交換。第二十八頁，共五十四頁，編輯于2023年，星期日第二十九頁，共五十四頁，編輯于2023年，星期日桿狀病毒表達體系的優(yōu)點：桿狀病毒表達體系具有與高等真核細胞類似的蛋白修飾，加工和轉運體系，其表達的外源基因產物在抗原性、免疫原性和功能上均與天然蛋白相似。構建桿狀病毒載體的主要基因為多角體基因ph和p10，為病毒復制非必須基因。多角體基因ph和p10有非常強大的啟動子，可使目的基因大量表達，可達細胞總蛋白量的25%。桿狀病毒基因組較大（130Kb），適合克隆大片段外原基因，還可以同時表達幾個基因。桿狀病毒不感染脊椎動物，比較安全。第三十頁，共五十四頁，編輯于2023年，星期日第三十一頁，共五十四頁，編輯于2023年，星期日三、動物病毒載體

1、SV40（猴病毒40）病毒作為載體第三十二頁，共五十四頁，編輯于2023年，星期日（1）SV40基因組（多瘤病毒科）其基因組為共價閉合環(huán)狀雙鏈DNA，只有5243個堿基對。是第一個完成基因組DNA全序列分析的動物病毒。（2）SV40的復制和增殖SV40感染敏感的猿猴細胞后，經過8-12小時的潛伏期，脫去外殼，DNA進入細胞核。首先啟動早期轉錄，在細胞質中翻譯產生T和t抗原。當兩種抗原積累到足夠量時，DNA開始復制，同時啟動晚期轉錄，翻譯產生殼蛋白VP1、VP2、VP3，將DNA包裝成病毒顆粒。當細胞內病毒顆粒多達105時，細胞破裂，釋放出大量病毒顆粒。第三十三頁，共五十四頁，編輯于2023年，星期日

SV40病毒基因組早期基因編碼兩種腫瘤抗原(tumorantigen，T抗原)，其分子量分別為94000(大T抗原)和17000(小T抗原)。T抗原有以下的作用:通過抑制宿主細胞Rb和p53基因，促使細胞分裂；阻止細胞凋亡；結合在SV40的復制起點，起始病毒復制；關閉病毒早期轉錄；啟動病毒晚期轉錄；在病毒組裝中起作用；小T抗原對于細胞的轉化不是必需的，但可起加強作用。第三十四頁，共五十四頁，編輯于2023年，星期日SV40DNA中的非必須區(qū)很小，故在向SV40插入外源基因時，須除去某些區(qū)段，同時采取相應補救措施。早期基因被置換時，不能合成T抗原，一般采用cos細胞來解決。Cos細胞是已經被SV40DNA轉化了的猴傳代細胞，其染色體內的SV40DNA可編碼T抗原，但沒有復制起點，病毒不能復制。將重組DNA導入cos細胞，可形成含有重組DNA的病毒顆粒。（3）構建SV40克隆載體的基本策略和途徑第三十五頁，共五十四頁，編輯于2023年，星期日晚期基因被置換，則不能合成衣殼蛋白，形成缺損性病毒。需要另一個SV40的溫度敏感變異株作為輔助病毒，兩者同時感染相容性細胞，形成含外源基因的重組病毒顆粒。一般來說，在相容性細胞中，病毒晚期基因啟動子的轉錄水平高于早期啟動子。第三十六頁，共五十四頁，編輯于2023年，星期日（4）SV40作為克隆載體有其局限性：①病毒最終裂解細胞，不利于基因表達；②早期功能區(qū)與病毒的致癌性有關，使用時有顧慮；③重組DNA片段的大小受體限制。包裝嚴格，不能包裝大于SV40-DNA的分子。第三十七頁，共五十四頁，編輯于2023年，星期日

第二節(jié)：病毒基因工程應用舉例一、噬菌體展示噬菌體展示技術（phage

display

techniques，PDT）是以改造的噬菌體為載體，把待選基因片段定向插入噬菌體外殼蛋白質區(qū)，使外源多肽或蛋白質表達并展示于噬菌體表面，進而通過親和富集法篩選表達有特異肽或蛋白質的噬菌體，最終獲得具有特異結合性質的多肽/蛋白質，并實現(xiàn)基因克隆化的一種重要的分子生物學技術。第三十八頁，共五十四頁，編輯于2023年，星期日1985年，SmithGP第一次將外源基因插入絲狀噬菌體f1的基因Ⅲ，使目的基因編碼的多肽以融合蛋白的形式展示在噬菌體表面，從而創(chuàng)建了噬菌體展示技術。該技術的主要特點：

1、將特定分子的基因型和表型統(tǒng)一在同一病毒顆粒內，即在噬菌體表面展示特定蛋白質，而在噬菌體核心DNA中則含有該蛋白的結構基因。2、這項技術把基因表達產物與親和篩選結合起來，可以利用適當?shù)陌械鞍讓⒛康牡鞍谆蚨嚯奶暨x出來。第三十九頁，共五十四頁，編輯于2023年，星期日1、噬菌體展示技術的原理融合蛋白PIII基因型表達型第四十頁，共五十四頁，編輯于2023年，星期日以改造的噬菌體為載體，cDNA基因片段定向插入噬菌體外殼蛋白基因區(qū)，使外源蛋白表達并展示于噬菌體表面，通過親和富集法篩選表達有特異蛋白質的噬菌體。

第四十一頁，共五十四頁，編輯于2023年，星期日2、噬菌體展示系統(tǒng)⑴單鏈絲狀噬菌體展示系統(tǒng)①PⅢ展示系統(tǒng)。絲狀噬菌體是單鏈DNA病毒，PⅢ是病毒的次要外殼蛋白，位于病毒顆粒的尾端，是噬菌體感染大腸埃希菌所必須的。每個病毒顆粒都有3個～5個拷貝PⅢ蛋白，其在結構上可分為N1、N2和CT3個功能區(qū)域，這3個功能區(qū)域由兩段富含甘氨酸的連接肽G1和G2連接。

SgⅢN1G1N2G2CT第四十二頁，共五十四頁，編輯于2023年，星期日其中，N1和N2與噬菌體吸附大腸埃希菌菌毛及穿透細胞膜有關，而CT構成噬菌體外殼蛋白結構的一部分，并將整個PⅢ蛋白的C端結構域錨定于噬菌體的一端。PⅢ有2個位點可供外源序列插入，當外源的多肽或蛋白質融合于PⅢ蛋白的信號肽(SgⅢ)和N1之間時，該系統(tǒng)保留了完整的PⅢ蛋白，噬菌體仍有感染性；但若外源多肽或蛋白直接與PⅢ蛋白的CT結構域相連，則噬菌體喪失感染性，這時重組噬菌體的感染性由輔助噬菌體表達的完整PⅢ蛋白來提供。PⅢ蛋白很容易被蛋白水解酶水解，所以有輔助噬菌體超感染（共同感染）時，可以使每個噬菌體平均展示不到一個融合蛋白，即所謂“單價”噬菌體。第四十三頁，共五十四頁，編輯于2023年，星期日PIII展示系統(tǒng)的主要用途是制備噬茵體抗體—單鏈抗體，它的突出優(yōu)點是模擬了自然免疫選擇系統(tǒng)。用PIII系統(tǒng)制備抗體的基本程序是：從經免疫或未免疫者獲取淋巴細胞(外周血淋巴細胞，或脾、淋巴結、骨髓等的淋巴細肥)，提取細胞mRNA(或細胞基因組DNA)，逆轉錄成cDNA，用PCR方法擴增抗體重鏈和輕鏈基因。第四十四頁，共五十四頁，編輯于2023年，星期日VHVLCLCH1CH2CH3Hinge(Fab’)2FabFcAntibodyIgGstructure第四十五頁，共五十四頁，編輯于2023年，星期日VHVLCLCH1CH2CH3AntibodyIgGstructure第四十六頁，共五十四頁，編輯于2023年，星期日VHVLCLCH1CH2CH3Fv第四十七頁，共五十四頁，編輯于2023年，星期日FvVHVLscFvVHVLSingleChainFragmentvariable第四十八頁，共五十四頁，編輯于2023年，星期日總mRNA反轉錄cDNAPCRVHVLlinkerPCRVH—Linker—VL接入噬菌體第四十九頁，共五十四頁，編輯于2023年，星