細胞凋亡與細胞衰老第一頁，共三十九頁，編輯于2023年，星期一第一節(jié)程序性細胞死亡單細胞生物而言，細胞死亡既是個體死亡。多細胞生物細胞死亡并非意味著個體死亡。相反在多細胞生物發(fā)育中，必須通過細胞死亡進行形態(tài)建成。正常的組織中也發(fā)生細胞死亡，它是維持組織機能和形態(tài)所必需的。第二頁，共三十九頁，編輯于2023年，星期一溫和式：細胞凋亡（apoptosis）、細胞自噬（autophagy）。激烈式：細胞壞死（necrosis）（一）細胞壞死概念——細胞受到環(huán)境因素的嚴重傷害，如極端的物理化學因素和眼中的病理性刺激引起細胞死亡的現(xiàn)象。壞死原因——蛋白變性，DNA嚴重損傷，ATP缺乏，溶酶體破裂等。細胞死亡的方式第三頁，共三十九頁，編輯于2023年，星期一細胞壞死初期，胞質內線粒體和內質網(wǎng)腫脹、崩解，結構脂滴游離、空泡化，蛋白質顆粒增多，核發(fā)生固縮或斷裂。隨壞死進程，細胞質呈強嗜酸性，蘇木精/伊紅染色呈均一紅色。細胞膜不完整，臺盼藍染色陽性(活細胞不著色)。DNA隨機降解，細胞內容物流出，引起炎癥。第四頁，共三十九頁，編輯于2023年，星期一通過形成自噬泡與胞內溶酶體融合，消化細胞自身結構，自噬一般是細胞維持存活的手段，但過多自噬導致細胞死亡。細胞自噬是正常的生理過程。也發(fā)生在細胞營養(yǎng)匱乏及個體發(fā)育過程中，如昆蟲變態(tài)。細胞自噬可能與細胞凋亡一樣在動物發(fā)育過程中形態(tài)建成中扮演重要角色。是由細胞自身基因控制的程序性死亡。（二）細胞自噬第五頁，共三十九頁，編輯于2023年，星期一（三）細胞凋亡細胞凋亡是多細胞生物正常的過程，是一種由基因控制的主動的細胞生理性自殺行為。第六頁，共三十九頁，編輯于2023年，星期一第一節(jié)程序性細胞死亡（programmedcelldeath,PCD）程序性細胞死亡(programmedcelldeath,PCD)——指在生長發(fā)育過程中細胞在基因調控下，按照一定時空順序發(fā)生的生理性死亡。細胞凋亡是形態(tài)學的概念，程序性細胞死亡是功能上的概念。第七頁，共三十九頁，編輯于2023年，星期一一、動物細胞的程序性細胞死亡（一）細胞凋亡（apoptosis）1動物細胞凋亡形態(tài)特征1)凋亡的起始細胞膜：完整，表面特化結構消失，細胞間接觸消失細胞質：線粒體形態(tài)變化不大，核糖體從內質網(wǎng)解離，內質網(wǎng)膨脹，溶酶體活性不增加。細胞核：染色質靠邊、固縮，細胞核變型突出，染色質斷裂。2）凋亡小體的形成整個細胞：通過出芽（發(fā)泡）的方式形成許多凋亡小體，凋亡小體內有結構完整的細胞器；3）凋亡小體被臨近細胞或體內吞噬細胞吞噬消化第八頁，共三十九頁，編輯于2023年，星期一2凋亡的生化特征①無細胞質外泄，不引起炎癥反應；②核酸內切酶活化，DNA有控降解，凝膠電泳圖呈梯狀；③tTG（組織轉谷氨酰胺酶）的積累并達到較高的水平；④質膜PS（磷酯酰絲氨酸，phosphatidylserine)外翻。

凋亡通常是生理性變化，壞死是病理性變化。第九頁，共三十九頁，編輯于2023年，星期一壞死凋亡第十頁，共三十九頁，編輯于2023年，星期一第十一頁，共三十九頁，編輯于2023年，星期一第十二頁，共三十九頁，編輯于2023年，星期一第十三頁，共三十九頁，編輯于2023年，星期一1.形態(tài)學，電鏡，光鏡；2.DNA凝膠電泳——ladder；3.流式細胞計；4.核酸內切酶活力檢測；5.彗星電泳法；6.AnnexinV檢測細胞膜外表面PS；7.TUNEL技術（末端脫氧核苷酸轉移酶標記法）。3細胞凋亡的檢測方法第十四頁，共三十九頁，編輯于2023年，星期一常用檢測細胞凋亡的染料：二乙酸熒光素（FDA），綠色熒光，活細胞染色。Hoechst33342或33258，DAPI，吖啶橙（AO），半通透，凋亡和固定后的細胞熒光較強。溴化乙啶（EB）、碘化丙啶（PI）、放線菌素D（7‐AAD），不通透，正常和凋亡細胞拒染。各種堿性染料。固定后染細胞核?？捎貌煌再|的染料對凋亡細胞進行雙染色。第十五頁，共三十九頁，編輯于2023年，星期一A：人類白血病T細胞經(jīng)1微升喜樹堿處理，早期凋亡特異性的特征被熒光標記的Annexin－5(Ca2+依賴性磷脂結合蛋白)檢測到(產(chǎn)生凋亡小體的黃色綠色細胞)。晚期凋亡和壞死細胞被pi染色（橙紅色細胞核）。細胞凋亡的發(fā)生伴有細胞膜磷脂酰絲氨酸移位酶的激活，提示細胞膜膜脂雙層的某些成分由胞漿面向細胞質面外翻，可能是細胞凋亡的早期征象。B：人白血病細胞株HL-60cells（急性粒細胞白血病，p53缺陷）被喜樹堿誘導3小時。DNA段端被熒光標記的脫氧核苷酸末端轉移酶標記。

AB第十六頁，共三十九頁，編輯于2023年，星期一（1）生理學意義

①確保正常發(fā)育、生長：清除多余的、失去功能價值的細胞（指趾間組織細胞）；

②維持內環(huán)境穩(wěn)定：清除受損突變細胞，自身反應細胞，衰老細胞；

③發(fā)揮積極的防御功能：感染病毒細胞凋亡，阻止病毒復制。4細胞凋亡的生理和病理學意義第十七頁，共三十九頁，編輯于2023年，星期一發(fā)育中的小鼠趾間細胞凋亡第十八頁，共三十九頁，編輯于2023年，星期一神經(jīng)細胞與靶細胞聯(lián)系建立的過程中多余的神經(jīng)細胞凋亡第十九頁，共三十九頁，編輯于2023年，星期一（2）病理學意義①病原體侵染；

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誘導凋亡——HIV

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抑制凋亡——天花病毒②細胞凋亡不足

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腫瘤，自身免疫疾??；③細胞凋亡過度

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神經(jīng)退行性疾?。ˋD，帕金森癥）、心肌梗塞、再生障礙性貧血、骨組織壞死。第二十頁，共三十九頁，編輯于2023年，星期一（二）細胞凋亡的分子機制1誘發(fā)凋亡的因素細胞之所以凋亡是因為細胞受到溫和脅迫、衰老、其他細胞的刺激或者細胞接受不到外界生長存活信號。誘導凋亡的因素分兩大類：

物理因素：射線、溫和的熱激、冷激、滲透脅迫。

化學因素：活性氧、鈣離子、視黃醛、細胞毒素、凋亡細胞因子等。細胞接受死亡信號后主要通過兩種途徑實現(xiàn)細胞凋亡——蛋白酶Caspase依賴型細胞凋亡：激活的Caspase切割靶蛋白導致細胞凋亡；非Caspase依賴型細胞凋亡：可同時激活。第二十一頁，共三十九頁，編輯于2023年，星期一2Caspase依賴性細胞凋亡Caspase的發(fā)現(xiàn)和秀麗隱桿線蟲程序性細胞死亡研究有關。秀麗隱桿線蟲是研究PCD的理想材料（1mm長，透明，3.5天即可有合子發(fā)育成熟，細胞總共產(chǎn)生1090個細胞，其中131個凋亡）?？刂凭€蟲PCD的基因有：Ced-3、Ced-4和Ced-9等。哺乳動物中線蟲相關基因（蛋白）研究發(fā)現(xiàn)10多種Caspase。–Ced-3和Ced-4誘發(fā)凋亡；–Ced-9抑制Ced-3、Ced-4的作用。其中Caspase1與線蟲Ced-3同源。負責白介素活化，調節(jié)免疫，亦有促使細胞凋亡功能。第二十二頁，共三十九頁，編輯于2023年，星期一植物氣孔Caspase的性質Caspase（天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶）——是存在于細胞質中結構類似的一類蛋白酶，具有有限切割靶蛋白的功能，切割位點在靶蛋白天冬氨酸殘基后的肽鍵。Caspase激活——自身切割或其他Caspase切割，產(chǎn)生兩段肽段形成有蛋白酶活性的二聚體。Caspase家族——可分為起始Caspase、執(zhí)行Caspase和炎癥反應介導因子。結構：起始Caspase多含有死亡效應結構域（DED）或Caspase募集結構域（CARD)。

起始Caspase——負責接受死亡信號，激活執(zhí)行Caspase。同性活化。

執(zhí)行Caspase——激活后切割靶蛋白，引起凋亡效應。異性活化。第二十三頁，共三十九頁，編輯于2023年，星期一同性活化（homo‐activation)——即酶原分子聚集成復合物達到一定濃度時，就彼此切割或者構象改變產(chǎn)生有活性的二聚體形式。起始Caspase中，Caspase‐8和10具有死亡效應結構域，而Caspase‐2和9具有募集結構域，通過結構域之間的聚合，Caspase能夠彼此結合或與接頭蛋白（adaptor）結合，被招募到上游信號復合物中發(fā)生同性活化。異性活化（hetero‐activation）——即起始Caspase招募執(zhí)行Caspase酶原分子后，對其進行切割，產(chǎn)生具有活性的執(zhí)行Caspase，切割細胞內重要的結構和功能蛋白，導致細胞死亡。第二十四頁，共三十九頁，編輯于2023年，星期一Caspase家族第二十五頁，共三十九頁，編輯于2023年，星期一Caspase活化Caspase在正常的狀態(tài)下，它們以無活性的原酶（proenzymes）形式存在。Caspase被同一Caspase特異性的在兩個亞基連接處的天冬氨酸位點剪切，同時釋放N-端結構域后被激活。激活的上游的Caspase能依次地激活其它下游的Caspase，形成Caspase級聯(lián)反應，將凋亡信號一級級傳至凋亡底物。第二十六頁，共三十九頁，編輯于2023年，星期一死亡受體起始的外源途徑——死亡信號來自細胞外促調亡細胞因子如腫瘤壞死因子（TNF）等與細胞表面死亡受體（TNF-R、Fas）的結合。線粒體起始的內源途徑——細胞內部或外部死亡信號導致細胞色素c從線粒體游離出來進入細胞質，觸發(fā)內源凋亡途徑。3Caspas依賴性細胞凋亡的外源途徑和內源途徑第二十七頁，共三十九頁，編輯于2023年，星期一死亡受體介導的細胞凋亡起始于死亡配體與受體的結合。死亡配體主要是腫瘤壞死因子（TNF）家族成員。TNF是一種具有多種生物學效應的細胞因子，能夠使腫瘤組織出血壞死。死亡配體的生物學功能是通過與細胞表面的受體結合來實現(xiàn)的，TNFR1和Fas是死亡受體家族的典型代表。死亡受體起始的外源途徑Fas又稱作APO-1，屬TNF受體家族。?1993年人白細胞分型國際會議統(tǒng)一命名為CD95。?Fas基因編碼產(chǎn)物為分子量45KD的跨膜蛋白。?Fas蛋白與Fas配體組成Fas系統(tǒng)，二者的結合激活Caspase。第二十八頁，共三十九頁，編輯于2023年，星期一Fas誘導的細胞凋亡外源途徑（細胞表面死亡受體介導的細胞凋亡通路）①死亡信號（腫瘤壞死因子）與死亡受體結合（TNF的受體Fas）三聚化；②死亡受體結合胞內的DD區(qū)（Deathdomain）與接頭蛋白FADD的DD區(qū)結合③FADDN端通過DED區(qū)（deatheffectordomain）與原Caspase-8蛋白結合，促進Caspase-8聚集形成死亡信號誘導復合體。④Caspase-8自剪切活化，激活Caspase-3、Caspase-7；Caspase-3激活Caspase-6。⑤Caspase切割降解關鍵性蛋白，包括結構蛋白、蛋白激酶、轉錄調控蛋白和周期蛋白、核纖層蛋白等等）。Caspase還可降解Dnase的抑制蛋白，釋放Dnase，降解DNA。⑥細胞凋亡第二十九頁，共三十九頁，編輯于2023年，星期一①信號激發(fā)活化了Bax凋亡基因，凋亡基因與抗凋亡基因BCL-2結合抑制了抗凋亡基因的作用，引起線粒體電壓依賴性陰離子通道（VDAC）打開，細胞色素C被釋放到胞質中；②釋放的細胞色素C與Apaf-1（凋亡蛋白酶激活因子,是線蟲Ced-4基因哺乳細胞中的同源物）結合激活Caspase-9，后者再激活Caspase-3、6等，引起細胞凋亡。線粒體起始的內源途徑：（線粒體為核心的細胞凋亡通路）第三十頁，共三十九頁，編輯于2023年，星期一第三十一頁，共三十九頁，編輯于2023年，星期一含有1-4個Bcl-2同源結構域（Bcl-2homology）（BH1-4）。分兩類：抗凋亡蛋白（anti-apoptoticprotein)和促凋亡蛋白（pro-apoptoticprotein)。?促凋亡蛋白能引起線粒體外膜通透性改變，導致cytc釋放，引起凋亡。?Bcl-2相當于線蟲的ced9。主要定位于線粒體膜、也存在于ER和外核膜，拮抗促凋亡蛋白的功能。Bcl-2基因家族（B-celllymphomagene2family)第三十二頁，共三十九頁，編輯于2023年，星期一凋亡蛋白酶激活因子-1（apoptoticproteaseactivatingfactor-1，Apaf-1）：線蟲的同源物為ced-4。?作用：參與線粒體凋亡途徑，該基因敲除后，小鼠神經(jīng)細胞過多，腦畸形發(fā)育。?Apaf-1與cytc、ATP/dATP結合后，召集caspase-9，形成凋亡復合體（apoptosome），激活caspase-3，啟動caspase級聯(lián)反應。第三十三頁，共三十九頁，編輯于2023年，星期一途徑：（1）細胞接受調亡信號后，Bax,Bak形成二聚體從細胞質移到線粒體外膜，打開一種陰離子通道，細胞色素C從線粒體進入細胞質。（2）細胞色素C與Apaf-1結合，使Apaf-1聚合并通過其N端CARD結構域募集Caspase9形成凋亡復合體，Caspase9同性活化。（3）活化的Caspase9進一步活化執(zhí)行Caspase引起細胞凋亡。第三十四頁，共三十九頁，編輯于2023年，星期一4Caspase非依賴型細胞凋亡細胞剔除Caspase基因仍能凋亡，推測細胞內存在不依賴于Caspase的凋亡途徑，但機制尚不清楚。線粒體在Caspase非依賴型細胞凋亡中可能也發(fā)揮關鍵性作用，除CytC，線粒體能夠向細胞質內釋放多個凋亡相關因子，引發(fā)Caspase非依賴的細胞凋亡。凋亡誘導因子（AIF）：位于線粒體外膜。凋亡時移到核中，激活某種核酸內切酶引起染色質凝集斷裂。限制性核酸內切酶G（EndoG）：位于線粒體內，修復線粒體DNA。凋亡時進入核中剪切DNA產(chǎn)生200bp單位片段。第三十五頁，共三十九頁，編輯于2023年，星期一凋亡誘導因子（apoptosis-inducingfactor，AIF）是一類存在于線粒體內外膜間隙的保守的黃素蛋白，具有雙重功能。在細胞正常的生理狀態(tài)下，AIF作為線粒體氧化還原酶，能催化細胞色素c（Cyt-c）和NAD之間的電子傳遞，當細胞受到凋亡的刺激時，線粒體膜通透性改變，AIF從線粒體轉位到核內，引起細胞染色體的凝聚和DNA50kb的片段化。核酸內切酶G(endoG)是一種線粒體特異的核酸酶，負責線粒體DNA的修復與復制，在細胞凋亡時轉位到細胞核。核酸內切酶G能不依賴于將DNA切割成核小體片段。第三十六頁，共三十九頁，編輯于2023年，星期一5細胞凋亡調控凋亡相關的基因和蛋白——Caspase抑制因子：抑制凋亡。IAP家族（inhibitorofapoptosis,凋亡抑制子）：有BIR結構域，可直接與Caspase結合，抑制其活性。有7個成員，如：c-IAP1等。c-FLIP(FADD樣Caspase抑制蛋白）、BAR、ARC（含CARD結構域的