熒光分光光度法第一頁(yè)，共二十八頁(yè)，編輯于2023年，星期一基本要求：了解熒光光譜法的基本原理和應(yīng)用特點(diǎn)。了解熒光分光光度計(jì)的組成以及特點(diǎn)。掌握熒光光譜法的定量分析方法。了解影響熒光強(qiáng)度的因素。第二頁(yè)，共二十八頁(yè)，編輯于2023年，星期一第一節(jié)概論

回顧：四大類電化學(xué)分析法光學(xué)分析法色譜分析法其它分析方法原子光譜法分子光譜法X射線光譜法核磁波譜法紫外-可見(jiàn)光分光光度法熒光分光光度法紅外吸收光譜法拉曼光譜法第三頁(yè)，共二十八頁(yè)，編輯于2023年，星期一熒光粉(俗稱夜光粉)，通常分為光致儲(chǔ)能夜光粉和帶有放射性的夜光粉兩類?！盁晒夥壑饕性霭鬃饔?，在紙張、包裝袋、洗衣粉、塑料、紡織品等上常有應(yīng)用，這也難怪塑料袋上檢出熒光粉?！睙晒夥鄣姆N類很多，現(xiàn)在市場(chǎng)上常見(jiàn)的就有500多個(gè)品種，性狀各異，我們常用的Ａ4打印紙上就有熒光粉。第四頁(yè)，共二十八頁(yè)，編輯于2023年，星期一一、應(yīng)用：

1.定量分析能產(chǎn)生熒光或能形成熒光配合物的物質(zhì)。2.簡(jiǎn)單定性回答“是不是”。二、特點(diǎn)：

靈敏度高，比吸收光譜法高103~104倍。ppb選擇性比吸收光譜法好。第五頁(yè)，共二十八頁(yè)，編輯于2023年，星期一第二節(jié)

基本原理

一、分子熒光的產(chǎn)生物質(zhì)吸收光輻射價(jià)電子從基態(tài)躍到激發(fā)態(tài)，然后再回到基態(tài)釋放能量⒈以熱能的形式。⒉以光輻射的形式。以光輻射形式釋放能量時(shí)，發(fā)射熒光。這種現(xiàn)象稱為光致發(fā)光。熒光磷光無(wú)輻射躍遷激發(fā)態(tài)亞穩(wěn)態(tài)（三重態(tài)）基態(tài)第六頁(yè)，共二十八頁(yè)，編輯于2023年，星期一分子的去活化過(guò)程：第七頁(yè)，共二十八頁(yè)，編輯于2023年，星期一當(dāng)處于基態(tài)單重態(tài)（S0）的分子吸收波長(zhǎng)為λ1和λ2的輻射后,分別被激發(fā)到第一激發(fā)單重態(tài)（S1*）和第二激發(fā)單重態(tài)(S2*)的任意振動(dòng)能級(jí)上,而后發(fā)生以下過(guò)程：

振動(dòng)弛豫:

在溶液中，受激的溶質(zhì)分子與溶劑分子碰撞，而失去過(guò)剩的能量，以10-13~10-11s的極快速度，降至同一電子態(tài)的最低能級(jí)上，這一過(guò)程屬于無(wú)輻射躍遷。內(nèi)轉(zhuǎn)換:當(dāng)兩個(gè)電子能級(jí)非常靠近以致其振動(dòng)能級(jí)有重疊時(shí)，如第一激發(fā)單重態(tài)的較高振動(dòng)能級(jí)與第二激發(fā)單重態(tài)的某一較低振動(dòng)能級(jí)的位能相同，可發(fā)生電子由高電子能級(jí)以無(wú)輻射躍遷的方式躍遷至低能級(jí)上。此過(guò)程效率高，速度快，一般只需10-13~10-11s。

熒光發(fā)射:

處于激發(fā)單重態(tài)的最低振動(dòng)能級(jí)的分子，也存在幾種可能的去活化過(guò)程。若以10-9~10-7s左右的時(shí)間發(fā)射光量子回到基態(tài)的各振動(dòng)能級(jí)，這一過(guò)程就有熒光發(fā)生。第八頁(yè)，共二十八頁(yè)，編輯于2023年，星期一

最常見(jiàn)的光致發(fā)光：熒光和磷光。兩者發(fā)光機(jī)理不同，壽命不同。熒光壽命10-9～10-6秒，磷光壽命10-3～10秒。熒光可由激發(fā)態(tài)的分子產(chǎn)生，也可由激發(fā)態(tài)的原子產(chǎn)生，本章介紹分子熒光。由于熒光的產(chǎn)生由價(jià)電子引起，所以，熒光光譜屬于電子光譜，其波長(zhǎng)范圍位于：紫外光區(qū)和可見(jiàn)光區(qū)。第九頁(yè)，共二十八頁(yè)，編輯于2023年，星期一二、激發(fā)光譜和發(fā)射光譜

⒈激發(fā)光譜固定熒光波長(zhǎng)，以激發(fā)光波長(zhǎng)對(duì)熒光強(qiáng)度(F)所作的光譜曲線。300350400λ(nm)

F【例】硫酸奎寧（0.1mol/L硫酸溶液）的激發(fā)光譜。第十頁(yè)，共二十八頁(yè)，編輯于2023年，星期一⒉

發(fā)射(熒光)光譜固定激發(fā)光波長(zhǎng)，以熒光波長(zhǎng)對(duì)熒光強(qiáng)度F所作的光譜曲線。300350400λ(nm)

F【例】蒽（乙醇溶液）的發(fā)射光譜。第十一頁(yè)，共二十八頁(yè)，編輯于2023年，星期一激發(fā)光譜和熒光光譜:

硫酸奎寧的激發(fā)光譜和熒光光譜

蒽的激發(fā)光譜和熒光光譜

熒光物質(zhì)的最大激發(fā)波長(zhǎng)和最大熒光波長(zhǎng)是鑒定物質(zhì)的根據(jù)，也是定量測(cè)定時(shí)最靈敏的條件。

第十二頁(yè)，共二十八頁(yè)，編輯于2023年，星期一三、分子熒光與分子結(jié)構(gòu)的關(guān)系

分子要產(chǎn)生熒光，首先要能吸收紫外光或可見(jiàn)光。能產(chǎn)生熒光的分子具有的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)：共軛雙鍵剛性平面多環(huán)結(jié)構(gòu)

【例】芴具有剛性平面，產(chǎn)生的熒光比聯(lián)二苯強(qiáng)。第十三頁(yè)，共二十八頁(yè)，編輯于2023年，星期一

1具有共軛雙鍵體系的分子：大多數(shù)熒光物質(zhì)都具有芳香環(huán)或雜環(huán)，因?yàn)檫@些化合物都具有易發(fā)生π→π*或n→π*躍遷的電子共軛結(jié)構(gòu)，π電子的非定域性越大，就越容易被激發(fā)，分子的熒光效率越大，因此凡能提高π電子共軛程度的結(jié)構(gòu)，如對(duì)-苯基化、間-苯基化、乙烯化的作用都會(huì)增大熒光的強(qiáng)度。

2苯環(huán)上取代基的類型：給電子基團(tuán)。如-OH、-NH2常使熒光增強(qiáng)。與π電子體系互相作用較小的取代基。如-SO3H對(duì)分子熒光影響不明顯。吸電子基團(tuán)如-COOH、-CO減弱甚至破壞熒光。

第十四頁(yè)，共二十八頁(yè)，編輯于2023年，星期一3具有剛性平面結(jié)構(gòu)的分子：剛性的不飽和的平面結(jié)構(gòu)具有較高的熒光效率，分子剛性及共平面性越大，熒光效率越高，酚酞和熒光素比較，熒光素中多一個(gè)氧橋，使分子的三個(gè)環(huán)成一個(gè)平面，其共平面性增加，使π電子的共軛度增加，因而熒光素有強(qiáng)烈熒光，而酚酞的熒光很弱。

酚酞

熒光素第十五頁(yè)，共二十八頁(yè)，編輯于2023年，星期一四、熒光強(qiáng)度與濃度的關(guān)系

Φ：量子效率，發(fā)射光量子與吸收光量子之比。I0：入射光強(qiáng)度ε：摩爾吸光系數(shù)b：光程c：濃度F=2.303ΦI0εbc公式成立前提條件：εbc=A<0.05

即：當(dāng)試樣濃度較低時(shí)（c<0.05/εb），C與F方成線性。（如果濃度過(guò)高，分子碰撞機(jī)會(huì)增大，而產(chǎn)生無(wú)輻射去激活，造成線性偏離。）第十六頁(yè)，共二十八頁(yè)，編輯于2023年，星期一第三節(jié)

熒光分光光度計(jì)

一、基本結(jié)構(gòu)示意圖

特點(diǎn)：1．光源方向與檢測(cè)方向成直角；2．二個(gè)單色器?！わ@示器檢測(cè)器熒光單色器樣品池激發(fā)光單色器光源第十七頁(yè)，共二十八頁(yè)，編輯于2023年，星期一二、主要部件及功能

1．光源高壓汞蒸氣燈，氙燈。能提供紫外光和可見(jiàn)光，光強(qiáng)度比紫外-可見(jiàn)光分光光度計(jì)光源大得多。2．激發(fā)光單色器作用：提供單波長(zhǎng)的激發(fā)光。色散元件：棱鏡或光柵。出射狹縫寬度可調(diào)。第十八頁(yè)，共二十八頁(yè)，編輯于2023年，星期一3．樣品池須用石英材料制成。4．熒光單色器將樣品池中的散射光、反射光、雜質(zhì)熒光等濾掉，只讓熒光通過(guò)。出射狹縫寬度可調(diào)。5．檢測(cè)器光電轉(zhuǎn)換元件，測(cè)定熒光的強(qiáng)度。檢測(cè)方向與激發(fā)光方向垂直：在垂直方向上沒(méi)有透過(guò)光的干擾。由于熒光的強(qiáng)度較弱，一般以光電倍增管作檢測(cè)器。第十九頁(yè)，共二十八頁(yè)，編輯于2023年，星期一第四節(jié)

定量分析

一、定量方法一般采用工作直線法。作C—F直線。FC第二十頁(yè)，共二十八頁(yè)，編輯于2023年，星期一⑴配制一系列待測(cè)成分的標(biāo)準(zhǔn)溶液C1C2C3C4C5⑵測(cè)出相應(yīng)的熒光強(qiáng)度F1F2F3F4F5⑶建立工作直線（F

→C）①作圖法②回歸法⑷測(cè)量待測(cè)樣品，得F樣①?gòu)墓ぷ髦本€上找到待測(cè)成分的濃度C樣②由回歸方程計(jì)算出C樣第二十一頁(yè)，共二十八頁(yè)，編輯于2023年，星期一定量分析方法校準(zhǔn)曲線法：以已知量的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，按試樣相同方法處理后，配成一系列不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，在儀器調(diào)零后再以濃度最大的標(biāo)準(zhǔn)溶液作基準(zhǔn)，調(diào)節(jié)熒光強(qiáng)度讀數(shù)為100；然后測(cè)出其他標(biāo)準(zhǔn)溶液的相對(duì)熒光強(qiáng)度和空白溶液的相對(duì)熒光強(qiáng)度；扣除空白值后，以熒光強(qiáng)度為縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線；然后將處理后的試樣配成一定濃度的溶液，在同一條件下測(cè)定其相對(duì)熒光強(qiáng)度，扣除空白值后，從校準(zhǔn)曲線上求出其含量。第二十二頁(yè)，共二十八頁(yè)，編輯于2023年，星期一分子熒光分析法在檢驗(yàn)中的應(yīng)用尿液中的色胺的測(cè)定尿中色胺的含量是色氨酸代謝的一個(gè)標(biāo)志。色胺有天然熒光，激發(fā)峰285nm，熒光峰360nm。把尿或組織液的色胺萃取出來(lái)，就可直接檢測(cè)。在0.1~8μg/15mL范圍內(nèi)，熒光強(qiáng)度與色胺濃度呈線性關(guān)系。

第二十三頁(yè)，共二十八頁(yè)，編輯于2023年，星期一食品中維生素B2的測(cè)定:

維生素B2（核黃素）在430~440nm藍(lán)光照射下會(huì)發(fā)出綠色熒光，λem為535nm。它在pH6~7的溶液中熒光強(qiáng)度最大，而在pH11時(shí)熒光消失；但在堿性溶液經(jīng)光線照射發(fā)生分解作用或在酸性KMnO4氧化下都會(huì)生成熒光強(qiáng)度比維生素B2強(qiáng)得多的黃光素，并可溶于氯仿。利用此性質(zhì)可提高測(cè)定的靈敏度和選擇性。

核黃素

黃光素

第二十四頁(yè)，共二十八頁(yè)，編輯于2023年，星期一數(shù)據(jù)處理先預(yù)掃描，可以發(fā)現(xiàn)這些面巾紙中所含熒光物質(zhì)一樣，都為波長(zhǎng)370的熒光物質(zhì)，然后用370的光來(lái)照射，產(chǎn)生熒光，根據(jù)拉伯比爾定律，物質(zhì)熒光物質(zhì)的強(qiáng)度應(yīng)該與濃度成線性關(guān)系。然后得到一系列的強(qiáng)度：下表是所測(cè)熒光物質(zhì)的含量排名情況

名稱強(qiáng)度排名欣卉159.14

1

舒潔（Disney）173.67

2

五月花195.89

3

清風(fēng)（抽式）216.49

4

舒潔（一般）234.54

5

心相印（抽式）243.35

6

潔云（雅致）257.19

7

妮飄（一般）272.15

8

心相?。ū『桑?98.89

9

純點(diǎn)300.9

10

妮飄（hellokitty）妮飄（hellokitty）11

妙芙（康師傅）1010.83

12

思蜜兒（抽式）1000以上13

黃色一般草稿紙999.99

14

A4紙比普通草稿紙多很多15

第二十五頁(yè)，共二十八頁(yè)，編輯于2023年，星期一二、影響熒光強(qiáng)度測(cè)定的因素

1．激發(fā)光照射有一些熒光物質(zhì)若受到強(qiáng)光照射，會(huì)發(fā)生分解而導(dǎo)致F↓。所以，熒光分光光度計(jì)通常在激發(fā)光單色器后裝配有光閘，在測(cè)定時(shí)才打開(kāi)光閘讓激發(fā)光照射樣品池。2．溫度溫度↑，熒光效率下降，F(xiàn)↓。（因?yàn)椋瑴囟取?，增加分子間碰撞機(jī)會(huì)而使能量消耗掉。）第二十六頁(yè)，共二十八頁(yè)，編輯于2023年，星期一4．溶劑有些溶劑會(huì)使熒光效率下降，也可能