蛋白質的分離與純化第一頁，共七十六頁，編輯于2023年，星期二1蛋白質的酸堿性質2蛋白質分子的大小與形狀3蛋白質的膠體性質與蛋白質沉淀4蛋白質分離純化的一般原則5*

蛋白質分離純化的方法6蛋白質含量的測定與純度鑒定第二頁，共七十六頁，編輯于2023年，星期二一、蛋白質的酸堿性質

蛋白質與氨基酸相似，也具有兩性電離的性質。蛋白質的多肽鏈含有末端氨基和羧基，一些側鏈上含有可解離的基團，有的可以接受氫離子，有的可以電離出氫離子，因此蛋白質具有酸堿兩性電離的性質。它的兩性電離比氨基酸復雜。第三頁，共七十六頁，編輯于2023年，星期二

對某一蛋白質而言，在某一pH下，當它所帶正負電荷相等的時候，該溶液的pH就稱為該蛋白質的等電點。蛋白質的等電點的大小與蛋白質的氨基酸組成有關。

第四頁，共七十六頁，編輯于2023年，星期二第五頁，共七十六頁，編輯于2023年，星期二二、蛋白質的大小與形狀第六頁，共七十六頁，編輯于2023年，星期二π:滲透壓R:氣體常數T：絕對溫度c:溶質的濃度（g/m3）π/c對c作圖，在c趨近于零時得出Mr第七頁，共七十六頁，編輯于2023年，星期二菲克第二定律擴散不僅與蛋白質的分子量有關，還與分子形狀有關由于濃度差異引起的溶質分子的凈遷移成為平衡遷移或者遷移。菲克第一定律第八頁，共七十六頁，編輯于2023年，星期二離心機類別低速離心機高速離心機超速離心機第九頁，共七十六頁，編輯于2023年，星期二①離心力“

F”

當一個粒子（生物大分子或細胞器）在高速旋轉下受到離心力作用時，此離心力“F”由下式定義，即：a-粒子旋轉的加速度，m-沉降粒子的有效質量，ω-粒子旋轉的角速度，r-粒子的旋轉半徑(cm)。第十頁，共七十六頁，編輯于2023年，星期二②相對離心力“RCF”

相對離心力是指在離心場中，作用于顆粒的離心力相當于地球重力的倍數，單位是重力加速度“g”（980cm/sec2）,“RCF”相對離心力可用下式計算：RCF=1.119×10－5×(rpm)2r(rpm—revolutionsperminute每分鐘轉數，r/min)第十一頁，共七十六頁，編輯于2023年，星期二③離心機轉速與離心力列線計算圖一般情況下，低速離心時常以轉速“rpm”來表示，高速離心時則以“g”表示。在報告超離心條件時，通常總是用地心引力的倍數“×g”代替每分鐘轉數“rpm”.轉速與離心力的換算:先在r標尺上取已知的半徑和在rpm標尺上取已知的離心機轉數，然后將這兩點間劃一條直線，與圖中RCF標尺上的交叉點即為相應的相對離心力數值。第十二頁，共七十六頁，編輯于2023年，星期二超離心法類別

1#密度梯度離心法（densitygradient）

2*

沉降速度法（sedimentationvelocity）

3*沉降平衡法（sedimentationeguilibrium）第十三頁，共七十六頁，編輯于2023年，星期二密度梯度離心法#

生物大分子及顆粒的沉降不僅決定于它的大小，而且也取決于它的密度。顆粒在具有密度梯度的介質中離心時，質量和密度大的顆粒沉降的快，并且每種蛋白質顆粒沉降到與自身密度相等的介質密度梯度時，即停止不前，最后各自在離心管中被分離成獨立的區(qū)帶。分成區(qū)帶的樣品可以在管底刺一個小孔逐滴放出，分步收集。常用的介質有蔗糖、氯化銫等。蔗糖密度梯度蔗糖濃度離心管第十四頁，共七十六頁，編輯于2023年，星期二顆粒物質或溶質在超速離心場中的沉降速率。用小寫斜體s表示。s=v/a，其中a為重力或離心加速度，v為沉降速度，即沉降系數為每單位離心力場的沉降速度。第十五頁，共七十六頁，編輯于2023年，星期二第十六頁，共七十六頁，編輯于2023年，星期二

在較低速度（8,000-20,000r/min）的離心場中，離心開始時，分子顆粒發(fā)生沉降，由于沉降的結果造成濃度梯度。因而產生了擴散作用，擴散力的作用方向正與離心力相反，當凈離心力與擴散平衡時，在離心池內從液面到池低形成一個由低到高的恒定濃度梯度。如果測得相關參數即可算出生物分子的分子量。離心力x1軸心液面離心軸擴散力x2第十七頁，共七十六頁，編輯于2023年，星期二原理示意圖第十八頁，共七十六頁，編輯于2023年，星期二Vt

：柱床“總容積”，

Vo：即存在于柱床內凝膠顆粒外面空隙之間的水相容積

Vi：即凝膠顆粒內部所含水相的容積。

Vg：凝膠本身的容積；Vt＝Vo十Vi十Vg或Vt-Vo=Vi十Vg，凝膠床總體積

第十九頁，共七十六頁，編輯于2023年，星期二分配系數（Kd）

0＜Kd＜1，Ve在Vo與Vo十Vi之間變化Ve：為實際測得的洗脫容積，自樣品加入到組分最大濃度(峰)出現時所流出的容積Ve＝Vo十KdVi第二十頁，共七十六頁，編輯于2023年，星期二

Ve=K1-K2lgMK1、K2為常數，Ve可用如下表達式代替，Ve-Vo（分離體積），Ve/Vo（相對保留體積），Ve/Vt（簡化洗脫體積），Keff（相對洗脫體積）在不同型號凝膠上蛋白質的選擇曲線的差異Ve與相對分子量的關系第二十一頁，共七十六頁，編輯于2023年，星期二排阻范圍的選擇第二十二頁，共七十六頁，編輯于2023年，星期二第二十三頁，共七十六頁，編輯于2023年，星期二凝膠裝柱

①將層析柱垂直裝載支架上，將下端輸液管夾緊；②向柱中加入約1/3體積的0.9％NaCl溶液；③將一細玻棒伸入柱內，靠近管內壁，順著玻棒緩慢的向管內加入混勻的凝膠溶液；④凝膠加至層析柱頂端約3cm時，打開柱下端輸液開關，使流速控制在0.25-0.5ml/cm2·nim。④連續(xù)而緩慢的加凝膠直到穩(wěn)定在離管口約5cm處。（防止空氣進入凝膠床）

第二十四頁，共七十六頁，編輯于2023年，星期二柱層析系統(tǒng)的安裝第二十五頁，共七十六頁，編輯于2023年，星期二凝膠層析中的分離行為

藍葡聚糖（蘭色）、血紅蛋白（紅色）、鉻酸鉀(黃色)

第二十六頁，共七十六頁，編輯于2023年，星期二第二十七頁，共七十六頁，編輯于2023年，星期二第二十八頁，共七十六頁，編輯于2023年，星期二電泳第二十九頁，共七十六頁，編輯于2023年，星期二第三十頁，共七十六頁，編輯于2023年，星期二蛋白質的沉淀第三十一頁，共七十六頁，編輯于2023年，星期二

使蛋白質從溶液中析出的現象稱為沉淀，方法有：1.鹽析：在蛋白質的水溶液中，加入大量高濃度的強電解質鹽如硫酸胺、氯化鈉、硫酸鈉等，使蛋白質從溶液中析出，稱為蛋白質的鹽析。而低濃度的鹽溶液加入蛋白質溶液中，會導致蛋白質的溶解度增加，該現象稱為鹽溶。鹽析的機理：破壞蛋白質的水化膜，中和表面的凈電荷。鹽析法是最常用的蛋白質沉淀方法，該方法不會使蛋白質產生變性。第三十二頁，共七十六頁，編輯于2023年，星期二第三十三頁，共七十六頁，編輯于2023年，星期二2.有機溶劑沉淀法：在蛋白質溶液中，加入能與水互溶的有機溶劑如乙醇、丙酮等，蛋白質產生沉淀。有機溶劑沉淀法的機理：破壞蛋白質的水化膜。有機溶液沉淀蛋白質通常在低溫條件下進行，否則有機溶劑與水互溶產生的溶解熱會使蛋白質產生變性。第三十四頁，共七十六頁，編輯于2023年，星期二3.重金屬鹽沉淀（條件：pH稍大于pI為宜）：在蛋白質溶液中加入重金屬鹽溶液，會使蛋白質沉淀。重金屬沉淀法的機理：重金屬鹽加入之后，與帶負電的羧基結合。重金屬沉淀蛋白質會使蛋白質產生變性，長期從事重金屬作業(yè)的人應多吃高蛋白食品，以防止重金屬離子被機體吸收后造成對機體的損害。第三十五頁，共七十六頁，編輯于2023年，星期二4.生物堿試劑沉淀法（條件：pH稍小于pI）生物堿是植物組織中具有顯著生理作用的一類含氮的堿性物質。能夠沉淀生物堿的試劑稱為生物堿試劑。生物堿試劑一般為弱酸性物質，如單寧酸、苦味酸、三氯乙酸等。生物堿試劑沉淀蛋白質的機理：在酸性條件下，蛋白質帶正電，可以與生物堿試劑的酸根離子結合而產生沉淀。

“柿石癥”的產生就是由于空腹吃了大量的柿子，柿子中含有大量的單寧酸，使腸胃中的蛋白質凝固變性而成為不能被消化的“柿石”。第三十六頁，共七十六頁，編輯于2023年，星期二5.弱酸或弱堿沉淀法：用弱酸或弱堿調節(jié)蛋白質溶液的pH處于等電點處，使蛋白質沉淀。弱酸或弱堿沉淀法機理：破壞蛋白質表面凈電荷。第三十七頁，共七十六頁，編輯于2023年，星期二分離純化蛋白質的一般原則

研究蛋白質的結構與功能：要求純度高，不變性；提取活性的酶或蛋白質：必須保持天然活性狀態(tài)；作為藥物或食品添加劑：純度要求一般。蛋白質分離純化的一般步驟

材料的選擇→原料的預處理→蛋白質的抽提→從抽提液中沉淀蛋白質→純化→蛋白質的結晶第三十八頁，共七十六頁，編輯于2023年，星期二1.原料的選擇：要求含待分離的蛋白質豐富，廉價，易得，容易收集，新鮮無腐敗。2.原料的預處理：如果待分離蛋白質為胞外蛋白質，材料破碎后，用適當的溶劑直接抽提；若待分離蛋白質為胞內蛋白質，則需要破碎細胞膜，再用適當的溶劑抽提。3.從抽提液中沉淀蛋白質：常用鹽析法、低溫乙醇沉淀法、等電點沉淀法。第三十九頁，共七十六頁，編輯于2023年，星期二4.純化：將沉淀的蛋白質溶解，再選擇適當的純化方法，得到純度比較高的蛋白質溶液。純化方法：透析或超濾、電泳法、凝膠過濾法、離子交換層析、吸附層析法、超速離心法等。5.蛋白質的結晶：從溶液中重新沉淀蛋白質。第四十頁，共七十六頁，編輯于2023年，星期二五蛋白質分離純化的方法

（一）據分子量大小不同的方法

1透析與超濾第四十一頁，共七十六頁，編輯于2023年，星期二第四十二頁，共七十六頁，編輯于2023年，星期二第四十三頁，共七十六頁，編輯于2023年，星期二第四十四頁，共七十六頁，編輯于2023年，星期二第四十五頁，共七十六頁，編輯于2023年，星期二

利用壓力、抽濾（A）或離心力（B）等多種形式，強行使水和其它小分子溶質通過半透膜，而蛋白質被截留在膜上，以達到濃縮和脫鹽目的。濾膜有多種規(guī)格，可選擇性的截留相對分子量不同的蛋白質。為了避免被膜截留的蛋白質在膜表面上堆積，現常用截向流過濾的方法，即液體在泵驅動下沿著與膜表面相切方向流動，在膜上形成壓力，使部分液體透過膜，而另一部分液體切向地流過表面將被膜截留的蛋白質分子沖走。濾膜抽氣濾膜離心第四十六頁，共七十六頁，編輯于2023年，星期二2密度梯度離心3凝膠過濾以上兩種方法既可以用來測定蛋白質的分子量，又可以用來分離蛋白質第四十七頁，共七十六頁，編輯于2023年，星期二（二）利用溶解度的差別1等電點沉淀第四十八頁，共七十六頁，編輯于2023年，星期二2鹽溶與鹽析第四十九頁，共七十六頁，編輯于2023年，星期二蛋白質溶解度與離子強度的關系第五十頁，共七十六頁，編輯于2023年，星期二無機鹽的種類及選擇Ks取決于鹽的性質，與離子價數成正比，與離子半徑和溶液介電常數成反比。常見陰離子的鹽析作用順序：

PO43-＞SO42-＞CHCOO-＞Cl-＞N03-＞Cl04-＞I-＞SCN-

陽離子的鹽析作用順序為

NH4+＞K+＞Na+＞Mg2+鹽類必須溶解度大、受溫度影響小，而且鹽溶液密度不高。第五十一頁，共七十六頁，編輯于2023年，星期二第五十二頁，共七十六頁，編輯于2023年，星期二飽和溶液調整的計算V:需要加入飽和硫酸銨溶液的體積V0:原溶液的體積S1,S2:分別為原溶液和所需達到的硫酸銨飽和度第五十三頁，共七十六頁，編輯于2023年，星期二固體直接加入的計算W：將一升S1提高到S2時需加入的硫酸銨克數G和A為常數，受溫度影響第五十四頁，共七十六頁，編輯于2023年，星期二有機溶劑用量的計算

V=V0(S2-S1)/(100-S2)

V＝需加入有機溶劑的體積；V0＝蛋白溶液的原始體積；Sl＝蛋白溶液中有機溶劑的濃度；S2＝蛋白溶液中欲達到的有機溶劑濃度。

第五十五頁，共七十六頁，編輯于2023年，星期二3、溫度和pH對有機溶劑沉淀的影響第五十六頁，共七十六頁，編輯于2023年，星期二有機溶劑沉淀時應注意的問題低溫下操作中性鹽的鹽溶作用可減少變性多價陽離子可降低蛋白質的溶解度防止過量有機溶劑引起共沉淀沉淀應盡快分離，并溶于緩沖液中第五十七頁，共七十六頁，編輯于2023年，星期二熱沉淀根據蛋白質間的熱穩(wěn)定性的差別進行蛋白質的熱沉淀，分離純化熱穩(wěn)定性高的目標產物。熱沉淀是一種變性分離法，帶有一定的冒險性，使用時需對目標產物和共存雜蛋白的熱穩(wěn)定性有充分的了解。

第五十八頁，共七十六頁，編輯于2023年，星期二（三）根據電荷不同的純化方法

1電泳電泳分離蛋白質是根據蛋白質在電場中的遷移的差別達到分離目的的。蛋白質樣品加到一塊預先制好的凝膠介質上，只要在凝膠的兩端加上電場，就可以達到分離蛋白質的目的，這樣的電泳稱之凝膠電泳（gelelectrophoresis）。凝膠可以是淀粉凝膠（starchgel）、瓊脂糖凝膠（agarosegel）和聚丙烯酰胺凝膠（polyacrylamidegel）。一般凝膠介質中的pH被維持在堿性區(qū)，目的是使大多數蛋白質都帶有負電荷，這樣它們可以向陽極遷移。蛋白質的遷移與蛋白質的質量和帶電荷的多少有關。第五十九頁，共七十六頁，編輯于2023年，星期二電泳技術分類毛細管電泳電泳支持物濾紙凝膠薄膜第六十頁，共七十六頁，編輯于2023年，星期二

2.聚丙烯酰胺凝膠電泳

聚丙烯酰胺凝膠電泳（polyacrylamidegelelectrophoresis,簡稱PAGE)，也稱圓盤凝膠電泳或圓盤電泳(discgelelectrophoresis)，它是在區(qū)帶電泳的基礎上發(fā)展起來的。它以聚丙烯Ift胺凝膠為支持物，一般制成凝膠柱或凝膠板，凝膠是由相連的二部分組成（小的部分是濃縮膠，大的部分是分離膠），這二部分凝膠的濃度（孔徑大?。⒕彌_液組分和離子強度,pH以及電場強度都是不同的，即不連續(xù)的。這樣,電泳時樣品首先在不連續(xù)的兩相間積聚濃縮而成很薄的起始區(qū)帶（厚度約為0.1mm），然后再進行電泳分離。第六十一頁，共七十六頁，編輯于2023年，星期二

PAG是用丙烯酰胺(acrylamide，Acr)和交聯(lián)劑亞甲基雙丙烯酰胺(N，N-methylen。bisacrylamide，Bis)在催化劑的作用下聚合而成，聚合反應的催化系統(tǒng)有兩種?；瘜W聚合:催化劑過硫酸銨(AP)，加速劑TEMED

光聚合:催化劑核黃素，加速劑TEMED不連續(xù)PAGE三種效應：電荷效應、分子篩效應和濃縮效應第六十二頁，共七十六頁，編輯于2023年，星期二3毛細管電泳毛細管電泳又稱毛細管區(qū)帶電泳，它是在毛細管（2-75μm）中裝入緩沖液，從其一端注入樣品，在毛細管兩端加高壓直流電實現對樣品的分離，分離后的樣品依次通過設在毛細管一端的檢測器檢出。該法克服了傳統(tǒng)區(qū)帶電泳的熱擴散和樣品擴散的問題，實現了快速和高效分離。毛細管電泳是近年來發(fā)展起來的一項新技術，被認為是90年代最有影響的分離手段之一。目前已廣泛用于氨基酸分析、蛋白質高效分離、指紋圖譜研究、分離合成的寡核苷酸、DNA序列測定及PCR產物的分析鑒定等。第六十三頁，共七十六頁，編輯于2023年，星期二4.等電聚焦（isoelectricfocusing）

原理:在一定抗對流介質（如凝膠）中加入兩性電解質載體(Ampholyte,是一種多氨基多羧基的混合物，由異構物和同系物組成，其pK和pI值各自相異卻又相近），當直流電通過時，便形成一個由陽極到陰極pH值逐步上升的梯度。兩性化合物在此電泳過程中，就被濃集在與其pI相等的pH區(qū)域，從而使不同化合物能按其各自等電點得到分離。應用：分離純化蛋白質測定蛋白質等電點pI1=pH8pI2=pH7pI3=pH5-pH10pH3+線性梯度第六十四頁，共七十六頁，編輯于2023年，星期二5離子交換層析通過改變離子強度和pH來完成低第六十五頁，共七十六頁，編輯于2023年，星期二陽離子交換層析，洗脫液pH應該從低到高，陰離子交換層析，pH應該從高到低。蛋白質濃度洗脫體積帶正電荷的蛋白質帶負電荷的蛋白質收集樣品的管收集樣品的管帶負電荷的蛋白質蛋白質混合物玻璃柱帶正電荷的蛋白質帶負電荷的蛋白質帶正電荷的蛋白質收集樣品的管NaCl第六十六頁，共七十六頁，編輯于2023年，星期二C=CB-（CB-CA）（1-V2/V1）B1/A1

CA、CB＝梯度混合器A瓶、B瓶的濃度；

A1、B1＝A瓶、B瓶的橫切面積；

V2＝流經層析柱的體積，V1＝梯度洗脫液的總體積。第六十七頁，共七十六頁，編輯于2023年，星期二第六十八頁，共七十六頁，編輯于2023年，星期二6層析聚焦法是在等電點聚焦方法基礎上發(fā)展起來的，其分離純化蛋白質的依據是等電點的差異和離子交換行為。蛋白質按其等電點在pH梯度環(huán)境中進行排列的過程叫做聚焦效應。pH梯度的形成(由多緩沖劑和多緩沖交換劑形成)是聚焦效應的先決條件，如果一種蛋白質加到已形成pH梯度的層析柱上時，由于洗脫液的連續(xù)流動，蛋白質將迅速地遷移到與它等電點相同的pH處。從此位置開始，該蛋白質將以緩慢的速度進行吸附、解吸附，直到在等電點pH時被洗出。在聚焦層析過程中，一種樣品分次加入時，只要先加入者尚未洗出，并且有一定的時間進行聚焦，剩余樣品還可以加到柱上，其聚焦過程都能順利完成。第六十九頁，共七十六頁，編輯于2023年，星期二pH梯度溶液的形成示意圖蛋白質1（pI=7）蛋白質2（pI=8）層析時的聚焦效應示意圖第七十頁，共七十六頁，編輯于2023年，星期二（四）利用選擇性吸附的純化方法

1.羥磷灰石層析

2.疏水作用層析

某些稱為吸附劑的固體物質具有吸附能力，能夠將其他種類的分子吸附