實(shí)驗(yàn)血紅蛋白及其衍生物的吸收光譜及第一頁，共十六頁，編輯于2023年，星期二目的要求掌握722型分光光度計(jì)的使用了解血紅蛋白及其衍生物的吸收光譜的測定掌握血紅蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

第二頁，共十六頁，編輯于2023年，星期二實(shí)驗(yàn)原理溶液中的物質(zhì)在光的照射激發(fā)下，產(chǎn)生了對光吸收的效應(yīng)，物質(zhì)對光的吸收是具有選擇性的，各種不同的物質(zhì)都具有其各自的吸收光譜，因此當(dāng)某單色光通過溶液時，其能量就會被吸收而減弱，光能量減弱的程度和物質(zhì)的濃度有一定的比例關(guān)系，也即符合于比色原理---朗伯-比耳定律

分光光度計(jì)的使用第三頁，共十六頁，編輯于2023年，星期二

朗伯比爾定律：A=εlcε：摩爾吸光系數(shù)

c：溶液的濃度

l：液層的厚度

A：物質(zhì)的吸光度

第四頁，共十六頁，編輯于2023年，星期二比色皿的使用手持毛玻璃面，不可觸碰光滑面使用前要再用少量（大約1-2ml）待測溶液潤洗1次使用時比色皿光滑面對準(zhǔn)光路使用后及時清洗（用海綿刷沾取肥皂液清洗比色皿，并用自來水沖洗干凈，隨后用蒸餾水潤洗1-2次）第五頁，共十六頁，編輯于2023年，星期二血紅蛋白及其衍生物的吸收光譜測定

血紅蛋白(Hb)與O2結(jié)合生成氧合血紅蛋白(HbO2)，與CO結(jié)合生成碳氧血紅蛋白(HbCO)。因其血紅蛋白分子結(jié)構(gòu)不同，當(dāng)光線分別透過各種Hb溶液時，所吸收的光波也各異，可顯出特有的吸收光譜。這些吸收光譜可作為它們定性和定量分析的基礎(chǔ)。第六頁，共十六頁，編輯于2023年，星期二如HbO2在可見光波長400~600nm范圍內(nèi)有3個特征的吸收峰，其峰值分別在415、541和576nm處，當(dāng)氧合血紅蛋白轉(zhuǎn)為碳氧血紅蛋白（HbCO），此時光譜發(fā)生改變，在波長419、540和569nm處出現(xiàn)三個特征的吸收峰，其中在500~600nm范圍內(nèi)2個特征的吸收峰如下圖。第七頁，共十六頁，編輯于2023年，星期二項(xiàng)目吸收峰數(shù)吸收光譜（nm）HbO22541577HbCO2540569第八頁，共十六頁，編輯于2023年，星期二第九頁，共十六頁，編輯于2023年，星期二儀器和試劑

1．儀器：試管；吸量管；量筒；722型分光光度計(jì)；CO發(fā)生器。

2．試劑：

（1）濃H2SO4；（2）甲酸；（3）蒸餾水；

（4）血紅蛋白溶液。（5）NaOH；第十頁，共十六頁，編輯于2023年，星期二實(shí)驗(yàn)操作

預(yù)熱儀器

選定波長

調(diào)節(jié)T=100％

調(diào)節(jié)“0”點(diǎn)

測定

關(guān)機(jī)分光光度計(jì)的使用第十一頁，共十六頁，編輯于2023年，星期二用草酸鉀抗凝，取靜脈血，邊取邊輕輕搖動，即制得全血。

（1）氧合血紅蛋白（HbO2）液：加蒸餾水20ml，取全血0.1ml（3滴）盛于小燒杯中，混勻，此即HbO2液，呈鮮紅色。

（2）碳氧血紅蛋白（HbCO)液：

取上述HbO2液約5ml于試管中，通CO氣體（濃硫酸與甲酸在CO發(fā)生器中反應(yīng)發(fā)生）約10秒鐘，HbO2即變成櫻桃紅色的HbCO溶液。1．樣品的制備：第十二頁，共十六頁，編輯于2023年，星期二2．吸光度測定：

（1）將如上制備的2種血紅蛋白液分別盛于比色杯內(nèi)，在722型分光光度計(jì)上以蒸餾水為空白調(diào)節(jié)吸光度零點(diǎn)和100%（每一次讀數(shù)均應(yīng)用空白管調(diào)節(jié)零點(diǎn)和100%）。（2）先從波長500~600nm分別測定HbO2，碳氧血紅蛋白的吸光度（在相應(yīng)峰值的10nm范圍內(nèi)每隔2nm記錄一次吸光度讀數(shù)，其余均每隔10nm記錄一次吸光度讀數(shù)）。第十三頁，共十六頁，編輯于2023年，星期二3.吸收光譜曲線的繪制以吸光度為縱坐標(biāo)，波長為橫坐標(biāo)描點(diǎn)，并將各點(diǎn)連接成曲線，即為血紅蛋白及其衍生物的吸收光譜，但由于使用儀器不同，繪制出的血紅蛋白及其衍生物的吸收光譜必有一些差異，對722型分光光度計(jì)來說，峰值誤差在±3nm~5nm波長內(nèi)是允許的。第十四頁，共十六頁，編輯于2023年，星期二注意事項(xiàng)

分光光度計(jì)應(yīng)放在干燥處，使用溫度為5~35℃。遠(yuǎn)離強(qiáng)電場、磁場

每次做完實(shí)驗(yàn)時，應(yīng)立即洗凈比色皿

為了防止光電管疲勞。不測定時必須將比色皿暗箱蓋打開，使光路切斷，以延長光電管使用壽命

當(dāng)儀器停止工作時，切斷電源，電源開關(guān)同時切斷。并且用套子蓋住儀器，做好使用登記

第十五頁，共十六