水質(zhì)磺胺類、喹諾酮類和大環(huán)內(nèi)酯類抗生素的測定固相萃取/液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜法警告：實驗中使用的溶劑和試劑均具有一定的毒性，對健康具有潛在的危害，應(yīng)盡量避免與這些化學(xué)品的直接接觸。樣品制備過程應(yīng)在通風(fēng)櫥中進行，操作時應(yīng)按規(guī)定要求佩戴防護器具，避免接觸皮膚和衣物。范圍本標準規(guī)定了測定水中磺胺類、喹諾酮類和大環(huán)內(nèi)酯類抗生素的固相萃取/液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜法。本標準適用于地表水、地下水、生活污水和工業(yè)廢水中磺胺間甲氧嘧啶、磺胺嘧啶、磺胺二甲氧嘧啶、磺胺甲惡唑、磺胺二甲嘧啶、諾氟沙星、環(huán)丙沙星、氧氟沙星、氟羅沙星、脫水紅霉素、羅紅霉素、螺旋霉素12種抗生素的測定。當取樣500ml，定容體積為1.0ml，進樣體積為20μl時，方法檢出限為0.001μg/L～0.007μg/L，測定下限為0.004μg/L～0.028μg/L，詳見附錄A。規(guī)范性引用文件下列文件對于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅所注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。HJ/T91地表水和污水監(jiān)測技術(shù)規(guī)范HJ/T164地下水環(huán)境監(jiān)測技術(shù)規(guī)范方法原理水樣中的抗生素類化合物經(jīng)固相萃取法富集、凈化后，用液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜法分離檢測。根據(jù)化合物的保留時間和特征離子峰定性，內(nèi)標法定量。干擾與消除金屬離子與抗生素能形成絡(luò)合物，使固相萃取效率降低，可向水樣中加入乙二胺四乙酸二鈉抑制絡(luò)合物的形成。水中余氯等其他具有氧化性的有機物會干擾磺胺類抗生素的測定，可向水中加入抗壞血酸消除干擾。試劑和材料除非另有說明，分析時均使用符合國家標準的分析純試劑，實驗用水為不含目標化合物的純水。鹽酸：ρ（HCl）=1.19g/ml。硫酸：ρ（H2SO4）=1.84g/ml。乙腈（CH3CN）：色譜純。甲醇（CH3OH）：色譜純。甲酸（HCOOH）：色譜純。乙二胺四乙酸二鈉（C10H14N2Na2O8?2H2O）?？箟难幔–6H8O6）。鹽酸溶液：1+1。硫酸溶液：c（H2SO4）=4.0mol/L。量取22ml硫酸（5.2），緩慢加入到水中，待溫度降至室溫后，用水定容至100ml。pH2.0去離子水：用鹽酸（5.8）溶液調(diào)節(jié)去離子水至pH為2.0。0.1%甲酸溶液：量取0.5ml甲酸（5.5），緩慢加入水中，用水定容到500ml。甲醇/乙腈混合溶液：1+1。0.1%甲酸甲醇/乙腈混合溶液：量取0.5ml甲酸（5.5），緩慢加入到甲醇/乙腈混合溶液（5.12）中，用甲醇/乙腈混合溶液（5.12）定容至500ml。稀釋溶劑：3+1。取75ml0.1%的甲酸溶液（5.11）和25ml0.1%甲酸甲醇/乙腈混合溶液（5.13）于玻璃容器中，混合均勻。標準貯備液：ρ=100mg/L。準確稱取10.0mg抗生素類化合物標準物質(zhì)，用甲醇溶解后，轉(zhuǎn)移到100ml棕色容量瓶中，定容至標線。此溶液在-10℃以下避光可保存1年。也可以直接購買有證標準溶液，參照制造商的產(chǎn)品說明保存。脫水紅霉素標準貯備液：ρ=2.00mg/L。脫水紅霉素可直接購買標準物質(zhì)（純度≥95%）或者由紅霉素制備。量取400μl100mg/L紅霉素貯備液于20ml棕色瓶中，加入19.6ml甲醇（5.4），然后加入約10μl硫酸溶液（5.9）調(diào)pH至3.0，室溫下震蕩4h，于-10℃以下避光可保存2個月。標準使用液：ρ=1.00μg/ml。將12種抗生素類化合物標準貯備液（5.15）用適量的甲醇（5.4）稀釋，臨用現(xiàn)配。內(nèi)標貯備液：ρ=200μg/ml。內(nèi)標物為阿特拉X-13C3?？捎脴藴饰镔|(zhì)配制，標準物質(zhì)純度大于99.0%，用適量的甲醇（5.4）溶解。也可直接購買有證標準溶液。貯備液應(yīng)在-10℃以下避光保存或參照制造商的產(chǎn)品說明。替代物貯備液：ρ=200μg/ml。喹諾酮類替代物為環(huán)丙沙星-D8，磺胺類替代物為磺胺二甲氧嘧啶-D6、大環(huán)內(nèi)酯類替代物為脫水紅霉素-D6?？捎脴藴饰镔|(zhì)配制，標準物質(zhì)純度大于99.0%，用適量的甲醇（5.4）溶解。也可直接購買有證標準溶液。貯備液應(yīng)在-10℃以下避光保存或參照制造商的產(chǎn)品說明。內(nèi)標使用液：2.00μg/ml。將內(nèi)標貯備液（5.18）用適量的甲醇（5.4）稀釋。內(nèi)標使用液于-10℃以下避光保存，保質(zhì)期1個月。替代物使用液：2.00μg/ml。將替代物貯備液（5.19）用適量的甲醇（5.4）稀釋。替代物使用液于-10℃以下避光保存，保質(zhì)期1個月。固相萃取柱：填料為二乙烯苯和N-乙烯基吡咯烷酮共聚物（HLB）或同等柱效的萃取柱，規(guī)格為6ml/500mg。濾膜：0.7μm玻璃纖維或其他材質(zhì)等效濾膜。濾膜：0.22μm聚四氟乙烯或其它等效濾膜。氮氣：純度≥99.99%。儀器和設(shè)備液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜儀：配有電噴霧離子化源（ESI）。固相萃取裝置：自動或手動，流速可調(diào)節(jié)。濃縮裝置：自動氮吹濃縮儀或K-D濃縮器等性能相當?shù)脑O(shè)備。色譜柱：填料粒徑為1.8μm，柱長50mm，內(nèi)徑4.6mm的C18反相色譜柱，或其他等效色譜柱。樣品瓶：1000ml帶聚四氟乙烯內(nèi)襯墊瓶蓋的棕色玻璃瓶。微量注射器：10μl、20μl、50μl、100μl、250μl。一般實驗室常用儀器和設(shè)備。樣品樣品采集與保存按照HJ/T91和HJ/T164的相關(guān)規(guī)定采集樣品。樣品采集前，應(yīng)向樣品瓶（6.5）中加入150mg抗壞血酸（5.7）及0.25g乙二胺四乙酸二鈉（5.6），采樣時應(yīng)使樣品充滿樣品瓶（6.5），不留液上空間。樣品采集后于現(xiàn)場立即加鹽酸溶液（5.8）調(diào)節(jié)樣品pH至2。樣品采集后應(yīng)盡快進行分析。如暫不能分析，需在0℃～4℃冷藏避光保存，3d內(nèi)分析完畢。試樣制備樣品預(yù)處理樣品采用固相萃取法富集前，先用孔徑為0.7μm的玻璃纖維膜（5.23）過濾。固相萃取法將固相萃取柱（5.22）固定在固相萃取裝置（6.3）上。分別用5ml甲醇（5.4）、5ml去離子水、5mlpH2.0去離子水（5.10）活化萃取柱，待萃取柱上pH2.0去離子水剩約2ml左右時，量取500ml水樣，加入25.0μl替代物使用液（5.21），用鹽酸溶液（5.8）調(diào)節(jié)水樣pH為2～4，水樣以10～15ml/min的流速全部通過萃取柱后，用5ml去離子水淋洗小柱，再用氮氣（5.25）吹掃20min，使萃取柱干燥。然后加入10ml甲醇（5.4）以5ml/min的流速洗脫，收集洗脫液。洗脫液經(jīng)氮吹儀濃縮至近干，加入內(nèi)標使用液（5.20）25.0μl，用稀釋溶劑（5.14）定容到1.0ml，過0.22μm（5.24）有機濾膜后待測?？瞻自嚇又苽湟詫嶒炗盟鏄悠罚凑张c試樣的制備（7.2）相同步驟進行實驗室空白試樣的制備。分析步驟儀器參考條件液相色譜參考條件流動相：A相：0.1%甲酸甲醇/乙腈混合溶液（5.13）。B相：0.1%甲酸溶液（5.11）。流速：0.3ml/min。柱溫：40℃。進樣體積：20μl。梯度洗脫程序時間（min）流動相A（%）流動相B（%）0257522575186040206040212575252575質(zhì)譜參考條件離子源：電噴霧離子源（ESI），正離子模式。毛細管電壓：4000V，干燥氣體溫度：350℃，霧化器壓力：35psi。干燥氣體流速：10L/min。多離子反應(yīng)監(jiān)測方式（MRM），具體條件參見附錄B。對于不同質(zhì)譜儀器，參數(shù)可能存在差異，測定前應(yīng)將質(zhì)譜參數(shù)優(yōu)化到最佳。儀器調(diào)諧按照儀器使用說明書的要求在規(guī)定時間和頻次內(nèi)對液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜儀進行儀器質(zhì)量軸和分辨率調(diào)諧，使儀器處于最佳測試狀態(tài)。在儀器使用過程中，如發(fā)現(xiàn)儀器質(zhì)量數(shù)出現(xiàn)明顯偏差或靈敏度明顯下降時，應(yīng)立即重新對儀器進行質(zhì)量軸和分辨率調(diào)諧。校準曲線的建立取一定量抗生素類化合物標準使用液（5.17）、內(nèi)標使用液（5.20）及替代物使用液（5.21）于2ml樣品瓶中，制備至少5個濃度點標準系列，抗生素類化合物和替代物在各點的質(zhì)量濃度分別為2.00μg/L、5.00μg/L、10.0μg/L、20.0μg/L、50.0μg/L、100μg/L和200μg/L（參考濃度），內(nèi)標的質(zhì)量濃度均為50.0μg/L。由低濃度到高濃度依次對標準系列溶液進樣，以標準系列溶液中目標組分的質(zhì)量濃度為橫坐標，其對應(yīng)的峰面積（或峰高）與內(nèi)標物峰面積（或峰高）的比值乘以內(nèi)標物濃度的乘積為縱坐標，建立校準曲線。試樣測定按照與校準曲線的建立（8.2）相同的條件進行試樣（7.2）測定?？瞻自囼灠凑张c試樣測定相同的條件（8.3）進行空白試樣（7.3）的測定。結(jié)果計算與表示定性分析每種被測組分選擇1個母離子和2個子離子進行監(jiān)測。在相同的實驗條件下，某待測組分在樣品中的保留時間與標準溶液中的保留時間的相對標準偏差小于2.5%，且在試樣譜圖中的定性離子的相對豐度（Ksam）與濃度相近的標準溶液譜圖中對應(yīng)的定性離子相對豐度（Kstd）偏差不超過表2的范圍，則可判定樣品中存在該待測物。12種抗生素類化合物、3種替代物及1種內(nèi)標物的總離子流色譜圖見圖1，MRM譜圖見附錄C。 （SEQ標準自動公式\*ARABIC1）式中：Ksam——樣品中某組分定性離子的相對豐度，%；A2——樣品中某組分定性離子對的峰面積（或峰高）；A1——樣品中某組分定量離子對的峰面積（或峰高）。 （SEQ標準自動公式\*ARABIC2）式中：Kstd——標準溶液中某組分定性離子的相對豐度，%；Astd2——標準溶液中某組分定性離子對的峰面積（或峰高）；Astd1——標準溶液中某組分定量離子對的峰面積（或峰高）。定性確認時相對離子豐度的最大允許偏差單位：%標準溶液中某組分的定性離子的相對離子豐度（Kstd）Kstd＞5020＜Kstd≤5010＜Kstd≤20Kstd≤10樣品中某組分的定性離子的相對離子豐度（Ksam）的最大允許偏差±20±25±30±50說明：1——磺胺嘧啶；2——氟羅沙星；3——氧氟沙星；4——諾氟沙星；5——環(huán)丙沙星-D8；6——環(huán)丙沙星；7——磺胺二甲嘧啶；8——磺胺間甲氧嘧啶；9——磺胺甲惡唑；10——螺旋霉素；11——磺胺二甲氧嘧啶；12——磺胺二甲氧嘧啶-D6；13——阿特拉X-13C3；14——脫水紅霉素；15——脫水紅霉素-D6；16——羅紅霉素。目標物、替代物及內(nèi)標物的總離子流色譜圖（ρ=100μg/L，內(nèi)標50μg/L）定量分析樣品中各抗生素組分的質(zhì)量濃度ρi（μg/L）按照公式（3）進行計算。 （SEQ標準自動公式\*ARABIC3）式中：ρi——樣品中目標化合物i的質(zhì)量濃度，μg/L；Ai——樣品中目標化合物i的峰面積（或峰高）；Ais——樣品中內(nèi)標物的峰面積（或峰高）；ρis——樣品中內(nèi)標物的質(zhì)量濃度，μg/L；a——校準曲線的斜率；b——校準曲線的截距；Vi——定容體積，ml；V——水樣體積，ml。結(jié)果表示測XX果的小數(shù)點位數(shù)與方法檢出限一致，最多保留三位有效數(shù)字。精密度和準確度精密度6家實驗室對抗生素濃度為0.040μg/L、0.200μg/L、0.400μg/L統(tǒng)一加標樣進行了6次重復(fù)測定：實驗室內(nèi)相對標準偏差分別為0.8%～17%、1.4%～17%、1.3%～17%；實驗室間相對標準偏差分別為9.7%～18%、11%～17%、11%～16%；重復(fù)性限范圍為0.009～0.012μg/L、0.032～0.052μg/L、0.052～0.092μg/L；再現(xiàn)性限范圍為0.013～0.021μg/L、0.060～0.102μg/L、0.096～0.160μg/L。準確度6家實驗室對地下水、地表水、生活污水和工業(yè)廢水進行加標回收實驗，加標濃度分別為0.040μg/L、0.200μg/L、0.200μg/L、0.400μg/L。加標回收率范圍分別為75.5%～102%、76.3%～88.5%、72.3%～97.8%，77.6%～90.3%；加標回收率最終值為77.8%±30.8%～102%±31.2%、77.5%±30.6%～85.5%±31.6%、77.5%±25.8%～97.8%±32.0%、77.6%±27.2%～90.3%±29.4%。精密度和準確度結(jié)果統(tǒng)計見附錄C。質(zhì)量保證和質(zhì)量控制空白實驗每次分析至少做一個實驗室空白，實驗室空白中目標化合物的濃度應(yīng)低于方法檢出限。校準校準曲線的相關(guān)系數(shù)應(yīng)≥0.990；每20個樣品或每批次（少于20個樣品/批）應(yīng)分析測定1個校準曲線中間濃度點的標準溶液，測XX果與曲線該點濃度的相對誤差應(yīng)在±20%以內(nèi)，否則需重新建立校準曲線。平行樣的測定每20個樣品或每批次（少于20個樣品/批）需分析一個平行樣。平行樣的相對標準偏差應(yīng)控制在25%以內(nèi)。基體加標每20個樣品或每批次（少于20個樣品/批）需做一個基體加標樣，加標回收率應(yīng)在60%～130%之間。替代物加標每個樣品均需要加入替代物，替代物回收率應(yīng)控制在60%～130%之間。廢物處理實驗操作過程產(chǎn)生的有機溶劑廢液應(yīng)集中保管，委托有資質(zhì)的單位進行處理。

（規(guī)范性附錄）

方法的檢出限和測定下限表A.1給出了本方法中目標化合物的檢出限和測定下限。方法的檢出限和測定下限序號化合物CAS所屬類別方法檢出限（μg/L）測定下限（μg/L）1磺胺嘧啶68-35-9磺胺類0.0010.0042磺胺二甲嘧啶57-68-1磺胺類0.0010.0043磺胺間甲氧嘧啶1220-83-3磺胺類0.0010.0044磺胺甲惡唑723-46-6磺胺類0.0010.0045磺胺二甲氧嘧啶122-11-2磺胺類0.0010.0046氟羅沙星79660-72-3喹諾酮類0.0020.0087氧氟沙星82419-36-1喹諾酮類0.0030.0128諾氟沙星70458-96-7喹諾酮類0.0030.0129環(huán)丙沙星85721-33-1喹諾酮類0.0030.01210螺旋霉素8025-81-8大環(huán)內(nèi)酯類0.0070.02811脫水紅霉素23893-13-2大環(huán)內(nèi)酯類0.0020.00812羅紅霉素80214-83-1大環(huán)內(nèi)酯類0.0020.008

（資料性附錄）

質(zhì)譜參考條件目標化合物、替代物及內(nèi)標物的多離子反應(yīng)監(jiān)測條件見表B.1。目標化合物、替代物及內(nèi)標物的多離子反應(yīng)監(jiān)測條件種類名稱母離子（m/z）定量、定性離子（m/z）定量、定性碰撞電壓（V）毛細管出口電壓（V）內(nèi)標阿特拉X-13C3218.6177.2*，106.215，20110磺胺類磺胺間甲氧嘧啶281.1156.1*，108.115，26100磺胺嘧啶251.1156.0*，108.010，22100磺胺二甲氧嘧311.0156.0*，108.020，26130磺胺二甲氧嘧啶-D6316.4162.0*，108.021，29110磺胺甲惡唑254.1156.0*，108.010，25100磺胺二甲嘧啶279.1186.1*，156.115，16120喹諾酮類諾氟沙星320.0302.1*，276.120，15130環(huán)丙沙星332.1314.1*，231.020，42135環(huán)丙沙星-D8340.1322.1*，296.020，9125氧氟沙星362.0318.1*，261.115，26130氟羅沙星370.1326.0*，269.015，25130大環(huán)內(nèi)酯類脫水紅霉素716.5158.1*，558.025，14170脫水紅霉素-D6722.0164.1*，564.029，14158螺旋霉素422.2174.0*，101.021，23100羅紅霉素837.5158.0*，679.438，18170帶*的為定量離子

（資料性附錄）

方法的精密度和準確度表C.1和C.2分別給出了方法的精密度和準確度。方法的精密度化合物名稱加標濃度（μg/L）平均值（μg/L）實驗室內(nèi)相對標準偏差（%）實驗室間相對標準偏差（%）重復(fù)性限r(nóng)（μg/L）再現(xiàn)性限R（μg/L）磺胺嘧啶0.0400.03012.00.0090.0130.2000.16013.30.0330.0600.4000.33315.60.0520.130磺胺二甲嘧啶0.0400.03117.50.0100.0170.2000.16611.80.0400.0700.4000.33715.20.0660.150磺胺間甲氧嘧啶0.0400.03117.10.0090.0200.2000.15612.70.0420.0710.4000.32119.50.0580.150磺胺甲惡唑0.0400.03317.30.0110.0110.2000.16415.50.0460.0830.4000.31112.80.0680.140磺胺二甲氧嘧啶0.0400.0359.70.0110.0160.2000.17412.80.0430.0690.4000.33811.60.0670.096氟羅沙星0.0400.0387.00.0100.0130.2000.17616.40.0520.1000.4000.33015.50.0810.140氧氟沙星0.0400.03810.20.0110.0150.2000.18915.60.0400.0850.4000.33414.00.0810.160諾氟沙星0.0400.03913.40.0100.0180.2000.17413.30.0460.0830.4000.31713.60.0860.150環(huán)丙沙星0.0400.03916.90.0110.0210.2000.17111.00.0460.0830.4000.32214.60.0920.160表C.1方法的精密度（續(xù)）化合物名稱加標濃度（μg/L）平均值（μg/L）實驗室內(nèi)相對標準偏差（%）實驗室間相對標準偏差（%）重復(fù)性限r(nóng)（μg/L）再現(xiàn)性限R（μg/L）螺旋霉素0.0400.032312.00.0100.0160.2000.16516.70.0320.0830.4000.34313.50.0920.140脫水紅霉素0.0400.04115.20.0110.0200.2000.17114.50.0420.0930.4000.35212.70.0820.110羅紅霉素0.0400.03915.40.0120.0200.2000.16416.90.0350.0870.4000.34811.40.0770.126方法的準確度化合物名稱樣品類型實際樣品濃度（μg/L）加標濃度（μg/L）回收率范圍（%）（%）磺胺嘧啶地下水0.0000.04066.4～91.175.5±17.2地表水0.0000.20062.8～85.778.5±16.4生活污水0.0000.20060.6～97.077.2±22.4工業(yè)廢水0.0000.40063.3～10288.0±29.2磺胺二甲嘧啶地下水0.0000.04064.5～10176.4±27.4地表水0.0000.20064.1～86.976.3±19.4生活污水0.0000.20070.5～99.882.4±19.4工業(yè)廢水0.0000.40077.6～93.487.0±13.2磺胺間甲氧嘧啶地下水0.0000.04066.8～10277.8±30.8地表水0.0000.20063.0～96.480.0±30.2生活污水0.0000.20063.2～92.376.3±19.2工業(yè)廢水0.0000.40070.4～11385.5±34.6磺胺甲惡唑地下水0.0000.04066.3～97.281.5±29.8地表水0.0000.20063.2～10381.8±29.6生活污水0.0190.20066.6～10083.1±27.0工業(yè)廢水0.0000.40071.1～92.177.9±16.0磺胺二甲氧嘧啶地下水0.0000.04078.3～98.788.0±18.6地表水0.0000.20067.1～89.880.2±18.4生活污水0.0000.20082.2～11793.8±25.0工業(yè)廢水0.0000.40080.2～10690.2±18.6表C.2方法的準確度