牛羊養(yǎng)殖場氣溶膠布魯氏菌熒光定量PCR鑒別檢測技術(shù)規(guī)程范圍本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了牛羊養(yǎng)殖場環(huán)境氣溶膠樣本中布魯氏菌核酸熒光定量PCR鑒別診斷方法。本標(biāo)準(zhǔn)適用牛羊養(yǎng)殖場環(huán)境中氣溶膠布魯氏菌核酸的檢測以及牛種、羊種和豬種布魯氏菌核酸的鑒別檢測。規(guī)范性引用文件下列文件對于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅所注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法GB19489實(shí)驗(yàn)室生物安全通用要求術(shù)語與定義下列術(shù)語和定義適用于本文件。Ct值CycleThreshold熒光信號量達(dá)到設(shè)定的閾值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)?？s略語下列縮略語適用于本文件。AGI：全玻璃液體沖擊式采樣器（All-Glass-Impinger）原理本標(biāo)準(zhǔn)采用SYBRGreenI染料實(shí)時熒光定量PCR技術(shù)。布魯氏菌IS711（InsertionSequence711，IS711）插入序列在不同種的布魯氏菌基因組中高度保守，僅在拷貝數(shù)上存在差異。一條引物錨定在IS711上，另一條引物分別選在不同種布魯氏菌IS711插入序列鄰近的上下游單染色體DNA上，可以用來鑒別布魯氏菌種的特異性。材料及設(shè)備試劑試劑級別檢測中使用的試劑均為分析純，實(shí)驗(yàn)室用水應(yīng)符合GB/T6682的要求。引物序列通用型上游引物（Brucella-F）：5’-TCTTTGTCGTGGGCTTCATCG-3’。通用型下游引物（Brucella-R）：5’-TGGTCTGCACCATCGTCTTGTC-3’。牛種上游引物（Abortus-F）： 5’-ACCATTGAAGTCTGGCGAGCA-3’。羊種上游引物（Melitensis-F）： 5’-TCGCTGTCACTGTTGCAAGTATG-3’。豬種上游引物（Suis-F）： 5’-AAAGGGAGTGGGTTCTAGGGCG-3’。牛、羊和豬種下游共用IS711-R ：5’-GACCGCATTCATGGGTTTCG-3’。引物在使用時用滅菌雙蒸水稀釋成10μmol/L工作液，置于-20℃保存。主要組分SYBRGreenI熒光定量PCR反應(yīng)緩沖液，采用商品化試劑。對照設(shè)置陽性對照均為疫苗株滅活后提取的核酸樣本，有牛種布魯氏菌A19疫苗株基因組DNA、羊種布魯氏菌M5疫苗株基因組DNA和豬種布魯氏菌S2疫苗株基因組DNA，-20℃保存?zhèn)溆?。陰性對照為采集自無布魯氏菌污染的凈化健康牛場氣溶膠樣本提取的基因組DNA。儀器設(shè)備儀器設(shè)備及參數(shù)見附錄A。生物安全措施為了保護(hù)實(shí)驗(yàn)室人員的安全，應(yīng)由具備資格的工作人員檢測布魯氏菌核酸，所有檢測樣本應(yīng)嚴(yán)格在Ⅱ級生物安全柜內(nèi)操作。氣溶膠樣品的采集、保存及運(yùn)輸氣溶膠樣品的采集應(yīng)用空氣微生物采樣箱，使用國際標(biāo)準(zhǔn)的AGI采集樣本。采集方法與注意事項見附錄B。氣溶膠樣品的采集后的滅活處理樣品采集后立即用2%石碳酸溶液滅活處理。樣品的保存和運(yùn)輸待檢樣品在2℃～8℃保存不應(yīng)超過24h；-20℃保存不超過三個月；-80℃以下可長期保存。樣品應(yīng)置于低溫（2℃～8℃）、密封的容器內(nèi)運(yùn)輸。操作方法氣溶膠樣本的前處理取30mL采集的氣溶膠樣本，12000r/min離心10min，棄上清，重懸沉淀物，繼續(xù)進(jìn)行核酸提取，或置-20℃?zhèn)溆?。核酸提取采用商品化?xì)菌基因組DNA提取試劑盒進(jìn)行核酸提取。熒光定量PCR檢測反應(yīng)液的配制采用20μL反應(yīng)體系，每個反應(yīng)管包含熒光定量PCR反應(yīng)液（2×）：10.0μL，上、下游引物各0.8μL，滅菌蒸餾水6.4μL，檢測模板與陰、陽性對照分別為2μL。需要配制的熒光定量PCR反應(yīng)液管數(shù)為樣品個數(shù)n+2（陽性對照）+2（陰性對照）+2（防止分裝時液體損失）。按照順序依次加入上述各熒光定量PCR反應(yīng)組份的預(yù)混液，然后在每個PCR反應(yīng)管中分裝18μL。加樣在已分裝有熒光PCR預(yù)混液的PCR反應(yīng)管中每管分別加入2μL待測樣品或?qū)φ漳０?，混勻，蓋上管蓋，放入熒光PCR儀，記錄樣品放置順序。熒光定量PCR擴(kuò)增選擇檢測模式：SYBRGreenI。反應(yīng)體系：20μL。反應(yīng)條件設(shè)定：預(yù)變性：95℃30s，1個循環(huán)；PCR擴(kuò)增：95℃5s，61℃30s，40個循環(huán)，61℃時采集熒光信號。熔解曲線：95℃15s，65℃1min，95℃，Continuous；40℃10s?？筛鶕?jù)不同品牌PCR儀器說明書等效設(shè)置參數(shù)。分析條件設(shè)定和結(jié)果判定閾值設(shè)定綜合分析儀器給出的各項結(jié)果，基線（Baseline）以儀器給出的默認(rèn)值作為參考，閾值（Threshold）設(shè)定原則以閾值線剛好超過陰性對照樣品擴(kuò)增曲線的最高點(diǎn)為準(zhǔn)，具體需根據(jù)儀器噪聲情況進(jìn)行調(diào)整，選擇PCR擴(kuò)增反應(yīng)所設(shè)定的熒光基團(tuán)對應(yīng)的通道進(jìn)行分析。質(zhì)控質(zhì)控有效的條件為：陰性對照和空白對照應(yīng)無Ct值或≥35，陽性對照的Ct值應(yīng)＜35，且呈現(xiàn)S型擴(kuò)增曲線。結(jié)果分析及判定布魯氏菌核酸陰性反應(yīng)結(jié)果判定：檢測結(jié)果呈現(xiàn)無Ct值、無擴(kuò)增曲線、擴(kuò)增反應(yīng)曲線無明顯對數(shù)增長期，判為熒光定量PCR陰性反應(yīng)，樣品判定為布魯氏菌核酸檢測陰性。布魯氏菌核酸陽性反應(yīng)結(jié)果判定：檢測結(jié)果呈現(xiàn)Ct值＜35、擴(kuò)增曲線有明顯的對數(shù)增長期，且熔解曲線的Tm值為（84.6±0.5）℃：判定為熒光定量PCR結(jié)果陽性反應(yīng)，樣品判為布魯氏菌核酸檢測陽性。牛種布魯氏菌核酸陽性反應(yīng)結(jié)果判定：牛種布魯氏菌檢測結(jié)果呈現(xiàn)Ct值＜35、且擴(kuò)增曲線有明顯的對數(shù)增長期，同時Tm值為：（87.8±0.5）℃。見附錄C。羊種布魯氏菌核酸陽性反應(yīng)結(jié)果判定：羊種布魯氏菌檢測結(jié)果呈現(xiàn)Ct值＜35、且擴(kuò)增曲線有明顯的對數(shù)增長期，同時Tm值為：（86.7±0.5）℃。見附錄C。豬種布魯氏菌核酸陽性反應(yīng)結(jié)果判定：豬種布魯氏菌檢測結(jié)果呈現(xiàn)Ct值＜35、且擴(kuò)增曲線有明顯的對數(shù)增長期，同時Tm值為：（84.5±0.5）℃。見附錄C。注意事項注意的事項見附錄D。

（資料性附錄）

主要儀器設(shè)備A.1熒光定量PCR儀（全波長）。A.2臺式離心機(jī)（轉(zhuǎn)子容積2mL，50mL；最高離心力15000×g）。A.3電熱恒溫水槽（室溫至100℃）。A.4渦旋振蕩器。A.5天平（精密度千分之一以上）。A.6冰箱（2℃～8℃，-20℃，-80℃）。A.7微量可調(diào)移液器（0.25μL，10μL，100μL，200μL，1000μL）。A.8微量帶濾芯吸頭（10μL，100μL，1000μL）。A.9Ⅱ級生物安全柜A型。A.101.5mLEppendorf管。A.110.2mL8聯(lián)排PCR反應(yīng)管。A.12一次性手套。A.13一次性口罩。A.14醫(yī)用廢棄物容器。

（規(guī)范性附錄）

牛羊養(yǎng)殖場環(huán)境氣溶膠樣本的采集方法和注意事項采樣環(huán)境環(huán)境溫度≥5℃。試劑0.9%滅菌生理鹽水和橄欖油。儀器與耗材空氣微生物采樣箱，Porton空氣微生物采樣器，三角支架，滅菌注射器（10mL），一次性口罩，一次性手套，一次性無菌隔離服。采樣人員要求現(xiàn)場采樣的工作人員要穿工作服和膠鞋、戴上口罩、防風(fēng)眼鏡和一次性乳膠手套，做好個人安全防護(hù)。采樣工具采集氣溶膠用的氣溶膠采樣器、生理鹽水分別包裝并提前121℃高壓滅菌消毒，滅菌的離心管，滅菌的塑料袋，一次性注射器，膠布，保溫箱，記號筆。使用前要仔細(xì)檢查塑料管、消毒的塑料袋，有破損者不得使用。氣溶膠樣品采樣設(shè)備安裝：首先安裝三腳架，空氣微生物采樣器放置高度為距地面1.5m，將30mL滅菌生理鹽水注入，同時滴加一滴橄欖油，放入三腳固定支架內(nèi)固定。橡膠連接管的一端接到空氣微生物采樣箱主機(jī)入氣口上，另一端連接到Porton空氣微生物采樣器的出氣口上。收集參數(shù)：采用液體沖擊式采樣方式，采樣流量為12.5L/min，采樣時間為30min。收集標(biāo)準(zhǔn)：每個牛羊養(yǎng)殖場一般在產(chǎn)房、動物房、運(yùn)動場和奶廳4個位置分別采集2份樣本。樣品的滅活處理與分裝：氣溶膠采樣器采集結(jié)束后，直接將30mL樣本收集到采集50mL離心管，采樣器立即用2%石碳酸溶液滅活處理，放入塑料袋封口。氣溶膠采集液立即用2%石碳酸溶液滅活處理，蓋好離心管蓋，膠布封口，在塑料管壁記錄采樣牛場、位置、采樣時間、采樣人，然后裝入塑料袋封口，在塑料袋上同樣記錄采樣牛場、位置、采樣時間、采樣人。將裝有氣溶膠樣本的塑料管豎直口朝上和冰袋一塊放入保溫箱，蓋好蓋子，膠帶封口。派車專程送往有條件的實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行布魯氏菌熒光定量PCR鑒別檢測，采集的兩份樣品，一份用于直接檢測，另一份-20℃保存用于復(fù)檢。樣品運(yùn)送：在樣品運(yùn)送過程中，裝樣品的保溫箱不得傾倒，以防液體外溢。到達(dá)目的地后，對車體應(yīng)全面消毒。采樣現(xiàn)場用具處理現(xiàn)場采集完氣溶膠，立即對空氣微生物采樣箱、三角支架用1%來蘇爾溶液消毒。

（資料性附錄）

氣溶膠布魯氏菌核酸熒光定量PCR鑒別診斷結(jié)果圖說明：1～8代表1×108～1×101拷貝數(shù)/反應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)品的擴(kuò)增曲線，曲線9為陰性對照。布魯氏菌通用型實(shí)時定量PCR靈敏度擴(kuò)增曲線說明：1～3模板分別為牛種布魯氏菌A19株核酸、羊種布魯氏菌M5株核酸、豬種布魯氏菌S2株核酸。4～11分別為大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、沙門氏桿菌、溶血性鏈球菌、嗜肺巴氏桿菌、結(jié)核桿菌、螺旋桿菌、綠膿桿菌的核酸。12為陰性對照。布魯氏菌通用型實(shí)時定量PCR特異性擴(kuò)增曲線說明：A——1×108～1×101拷貝數(shù)/反應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)品的擴(kuò)增曲線。B——牛種布魯氏菌核酸陽性的熔解曲線Tm值為：（87.8±0.5）℃牛種布魯氏菌靈敏度擴(kuò)增曲線和陽性結(jié)果熔解曲線說明：A——1×108～1×101拷貝數(shù)/反應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)品的擴(kuò)增曲線。B——羊種布魯氏菌核酸陽性的熔解曲線Tm值為：（86.7±0.5）℃。羊種布魯氏菌核酸陽性結(jié)果熔解曲線說明：A——1×108～1×101拷貝數(shù)/反應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)品的擴(kuò)增曲線。B——豬種布魯氏菌核酸陽性的熔解曲線Tm值為：（84.5±0.5）℃。豬種布魯氏菌核酸陽性結(jié)果熔解曲線說明：A——牛種、羊種和豬種布魯氏菌分型的熔解曲線。B——SYBRGreenⅠ實(shí)時定量PCR鑒別牛、羊和豬種布魯氏菌氣溶膠樣本陽性結(jié)果熔解曲線。牛種、羊種和豬種布魯氏菌鑒別檢測熔解曲線結(jié)果

（規(guī)范性附錄）

檢測過程防止交叉污染的措施樣品采集與運(yùn)輸采樣采集：采集樣本使用獨(dú)立的氣溶膠采樣器和收集管。一個氣溶膠采樣器限于采集一份樣本，收集管使用一次性滅菌離心管。防止不同樣品之間通過采樣器、收集管交叉污染。樣本運(yùn)輸與貯存：防止樣品在運(yùn)輸與貯存過程中包裝損壞造成交叉污染。檢測過程PCR反應(yīng)試劑應(yīng)按檢測需求分裝貯存，避免同一管試劑多次開啟使用。裝有核酸模板、PCR試劑和引物的離心管在打開之前，應(yīng)短暫離心，所有操作盡量避免產(chǎn)生氣溶膠。上機(jī)運(yùn)行前，應(yīng)檢查并蓋緊各PCR管。人員要求采樣人員穿一次性無菌隔離服，戴一次性手套和口罩。實(shí)驗(yàn)室檢測人員應(yīng)由具備資格的工作人員操作。用具滅菌氣溶膠采樣器清洗干凈后121℃高壓滅菌處理20min。儀器設(shè)備與耗材使用帶濾芯