幾丁質(zhì)酶抑制化合物研究進展幾丁質(zhì)酶抑制化合物研究進展【摘要】幾丁質(zhì)酶抑制化合物作為一種可開發(fā)成具有新型作用靶標的生物農(nóng)藥早已引起國內(nèi)外生物學家地廣泛關(guān)注。近年發(fā)現(xiàn)幾丁質(zhì)酶抑制劑allosamidin對哮喘病具有一定療效，為幾丁質(zhì)酶抑制化合物在醫(yī)學領(lǐng)域的應(yīng)用奠定了一定的基礎(chǔ)。本文就幾丁質(zhì)酶抑制化合物的種類、抑制機制，幾丁質(zhì)酶抑制化合物活性測定方法以及相關(guān)研究領(lǐng)域的發(fā)展前景等做一綜述。

【關(guān)鍵詞】幾丁質(zhì)酶抑制化合物抑制機制

Advancesinchitinaseinhibitors

ABSTRACTAsakindofnovelpesticides,chitinaseinhibitorshaveattractedmanybiologists′interest.Itwasdiscoveredthatchitinaseinhibitor,allosamidin,hadcertaintherapeuticefficacytoasthma,whichlaidafoundationforchitnaseinhibitorapplicationinmedicaldomain.Thispaperintroducesseveralchitinaseinhibitorsandtheirrepressionmechanism,activitydeterminationmethodsandlooksforwardtothedevelopmentoftherelatedresearchterritory.

KEYWORDSChitinase;Inhibitor;Repressionmechanism

1幾丁質(zhì)酶抑制化合物研究概況

幾丁質(zhì)是N乙酰氨基葡萄糖以β1，4鍵連接起來的生物多聚物，是真菌細胞壁、細胞隔膜、昆蟲外骨骼的主要組成成分［1］。與幾丁質(zhì)代謝相關(guān)的酶主要有幾丁質(zhì)合成酶和幾丁質(zhì)酶兩類，幾丁質(zhì)合成酶負責幾丁質(zhì)的合成，幾丁質(zhì)酶負責幾丁質(zhì)的降解。昆蟲蛻皮過程中需要幾丁質(zhì)酶部分降解外骨骼中的幾丁質(zhì)以完成其變態(tài)發(fā)育過程［2］；真菌出芽生殖過程中也需要幾丁質(zhì)酶降解子母細胞之間的隔以完成其生殖過程［3］。由于幾丁質(zhì)酶在含幾丁質(zhì)生物的生長發(fā)育過程中發(fā)揮著不可缺少的重要作用，因此以幾丁質(zhì)酶作為靶目標的新型生物殺蟲、抗真菌劑(幾丁質(zhì)酶抑制劑)的開發(fā)成為關(guān)注的新熱點。因為這類物質(zhì)可以通過抑制幾丁質(zhì)酶的活性，阻止昆蟲幼蟲和蛹蛻皮以及真菌子母細胞的分離而起到殺蟲和抗真菌作用。同時由于哺乳動物機體的生命代謝不需要幾丁質(zhì)代謝系統(tǒng)［4］，故以幾丁質(zhì)酶作為靶目標的新型生物農(nóng)藥具有對人、畜無害的優(yōu)點。

迄今為止，幾丁質(zhì)酶抑制化合物的相關(guān)研究大致經(jīng)歷了三個發(fā)展階段：第一階段是從微生物代謝產(chǎn)物中篩選作為昆蟲生長調(diào)節(jié)劑和抗真菌劑的幾丁質(zhì)酶抑制化合物，并就其對昆蟲和真菌生命活動產(chǎn)生的影響進行了深入研究，這個階段以allosamidin［2］的發(fā)現(xiàn)和對其生物合成機制的探討［4～6］為標志；第二階段是對幾丁質(zhì)酶抑制劑與幾丁質(zhì)酶之間相互作用進行的結(jié)構(gòu)學研究，這為人工設(shè)計幾丁質(zhì)酶抑制劑奠定了堅實的基礎(chǔ)，這個階段對CI4［7］、argadin、argifin［8］與幾丁質(zhì)酶相互作用方式和空間結(jié)構(gòu)的闡明為標志；目前，該領(lǐng)域的研究已經(jīng)從篩選新的幾丁質(zhì)酶抑制劑發(fā)展到建立新的篩選模型和發(fā)現(xiàn)已知幾丁質(zhì)酶抑制劑的新功能。Zhu等［9］最近研究發(fā)現(xiàn)幾丁質(zhì)酶抑制化合物allosamidin對由IL13介導的Th2炎癥反應(yīng)引起的哮喘病具有明顯療效標志著第三個階段的到來。

2幾丁質(zhì)酶抑制化合物的檢測方法

檢測幾丁質(zhì)酶抑制化合物的方法主要有平板透明圈法［10］和化學方法兩種，它們的基本原理都是以緩沖液或蒸餾水作為對照，檢測目的物是否能夠抑制幾丁質(zhì)酶的活性。

平板透明圈法是在膠體幾丁質(zhì)平板上打孔，然后將等量的幾丁質(zhì)酶分別與蒸餾水(或緩沖液)以及待檢測物質(zhì)水溶液混合，將混合液吸入孔中，觀察幾丁質(zhì)被分解的情況。由于幾丁質(zhì)酶能夠水解平板基質(zhì)中的膠體幾丁質(zhì)而產(chǎn)生透明圈，若存在幾丁質(zhì)酶抑制化合物，與對照相比透明圈可變小，甚至不產(chǎn)生透明圈。此法直觀、簡便，可用于幾丁質(zhì)酶抑制化合物的初篩。

化學方法是基于幾丁質(zhì)酶將幾丁質(zhì)降解后，生成單體或寡聚體的還原性末段能與特定的顯色劑發(fā)生顯色反應(yīng)，通過測定吸光值的變化計算出幾丁質(zhì)酶的活性。若存在幾丁質(zhì)酶抑制化合物，吸光值與對照相比有顯著降低。此法能定量地分析幾丁質(zhì)酶被抑制的狀況。常用的化學檢測方法有鐵氰化鉀法［11］、3，5二硝基水楊酸法［12］等。

3一些主要的幾丁質(zhì)酶抑制化合物及其抑制機制

糖類幾丁質(zhì)酶抑制化合物

(1)AllosamidinAllosamidin是Sakuda等在篩選新的昆蟲生長調(diào)節(jié)劑過程中，從鏈霉菌次生代謝產(chǎn)物中分離出的幾丁質(zhì)酶抑制化合物［1］，是由2分子N乙?；鵇氨基阿洛糖和1分子氨基環(huán)戊醇衍生物構(gòu)成的擬三糖化合物［13］(圖1)，能以競爭性抑制的方式抑制幾丁質(zhì)酶活性。Allosamidin對家蠶幾丁質(zhì)酶［14］、真菌幾丁質(zhì)酶［15］均具有較強的抑制活性，對Streptomycingriseus、Serratiamarcescens［13］及Candidaalbicans［16］幾丁質(zhì)酶的抑制作用均較微弱?；铙w實驗表明allosamidin能夠阻止家蠶和黏蟲的蛻皮，導致其死亡［14］，同時還能抑制真菌的裂殖［15］。Allosamidin是一種廣譜的幾丁質(zhì)酶抑制化合物，對多種不同來源的幾丁質(zhì)酶都具有一定的抑制活性，但由于allosamidin人工合成難度較大，大量生產(chǎn)成本很高，制約了它在生產(chǎn)上的廣泛

圖1Allosamidin(R=CH3)和DMA(R=H)結(jié)構(gòu)應(yīng)用，這刺激了人們繼續(xù)篩選更經(jīng)濟、實用的幾丁質(zhì)酶抑制化合物。

(2)Allosamidin的衍生物在對allosamidin進行深入研究的同時，有人又在allosamidin產(chǎn)生菌的菌絲體中篩選到了對酵母幾丁質(zhì)酶具有強烈抑制作用的化合物demethylallosamidin(DMA)，它能強烈地抑制酵母幾丁質(zhì)酶的活性，影響酵母細胞的分裂［3］。對產(chǎn)生菌代謝途徑進行深入研究時發(fā)現(xiàn)DMA是allosamidin生物合成中間體［5］。它們在結(jié)構(gòu)上的差別主要在于R基團的不同，allosamidin的R基團為CH3，DMA的R為H原子［3］(圖1)。DMA對酵母幾丁質(zhì)酶的抑制活性比allosamidin強，但它們對昆蟲幾丁質(zhì)酶幾乎具有相同的抑制活性［17］。

1991年Nishimoto等用白念珠菌幾丁質(zhì)酶作為靶標來篩選幾丁質(zhì)酶抑制劑時，在鏈霉菌SA684菌株的菌絲提取物中又篩選到另外兩種allosamidin的衍生物：glucoallosalosamidinA、B［18］，它們對多種來源的幾丁質(zhì)酶同樣具有抑制活性。這對設(shè)計新型結(jié)構(gòu)的幾丁質(zhì)酶抑制化合物提供了重要的參考。

肽類幾丁質(zhì)酶抑制化合物

(1)CI4CI4是Izumida等在海洋假單胞菌IZ208中分離出的一種由精氨酸和脯氨酸構(gòu)成的環(huán)二肽幾丁質(zhì)酶抑制化合物［19］(圖2)。CI4能夠抑制酵母子母細胞的分離，并能阻止人類病原真菌白念珠菌向能夠侵染人的形式的轉(zhuǎn)變［20］。與allosamidin相比，CI4對多數(shù)幾丁質(zhì)酶抑制作用較低，但由于CI4與幾丁質(zhì)酶相互作用的化學結(jié)構(gòu)比較容易弄清楚，所以CI4是進一步結(jié)構(gòu)優(yōu)化的非常有用的支架結(jié)構(gòu)［7］。

(2)Argifin和argadinArgifin是Omura等從真菌Gliocladium0688的培養(yǎng)液中分離出的幾丁質(zhì)酶抑制化合物，Nomega(Nmethylcarbamoyl)LarginylNmethylLphenyalanylβLaspartylβLaspartylDalanyl構(gòu)成的環(huán)五肽的幾丁質(zhì)酶抑制化合物［21］(圖3)。Argifin是首先從真菌的代謝產(chǎn)物中發(fā)現(xiàn)的幾丁質(zhì)酶抑制化合物，并以依賴劑量的方式抑制幾丁質(zhì)酶的活性，它能通過抑制蟑螂幾丁質(zhì)酶活性阻止蟑螂蛻皮［21］，對幾丁質(zhì)酶的抑制活性比allosamidin

圖2CI4結(jié)構(gòu)弱，但作為一種在結(jié)構(gòu)上與糖類化合物完全不同的幾丁質(zhì)酶抑制化合物，argifin對抑制機制的深入研究具有非常重要的價值。

Argadin是Arai等在真菌Clonostachyssp.FO7314菌株的代謝產(chǎn)物中分離到的一種新型幾丁質(zhì)酶抑制化合物［22］。Argadin的結(jié)構(gòu)與Argifin非常相似，為NomegaacetylLarginylDprolylhomoserylhistidylL2aminoadipyl構(gòu)成的環(huán)五肽化合物(圖4)。Argadin也能通過抑制蟑螂幾丁質(zhì)酶活性，阻止其幼蟲蛻皮［21］。結(jié)構(gòu)學研究發(fā)現(xiàn)argadin與argifin均與幾丁質(zhì)酶Asp142和Glu144相互作用，這兩個氨基酸是18家族幾丁質(zhì)酶催化活性中心非常保守的氨基酸序列。Argadin與酶活性中心的結(jié)合比argifin更加緊密，形成的復合物的構(gòu)象也更為穩(wěn)定，所以argadin對幾丁質(zhì)酶抑制活性比argifin更強，甚至比allosamidin具有更強的幾丁質(zhì)酶抑制活性［8］。

其它幾丁質(zhì)酶抑制化合物

在對allosamidin深入研究的同時，Nitoda在真菌中發(fā)現(xiàn)了一種水溶性大分子幾丁質(zhì)酶抑制化合物［23］；Tabudravu等在海綿中篩選出了psammaplinA［24］；GustavbaajeKolstad等人工設(shè)計合成了幾丁質(zhì)酶抑制化合物HM508，并對其與18家族幾丁質(zhì)酶相互作用的晶體結(jié)構(gòu)做了深入研究［25］。目前已篩選出近十種不同來源的幾丁質(zhì)酶抑制化合物，同時，研究人員對它們在生產(chǎn)和生活中的應(yīng)用也進行了積極的探索。

4幾丁質(zhì)酶抑制化合物的應(yīng)用前景

幾丁質(zhì)酶抑制化合物的研究始于日本，之后美、英等國的研究者也對幾丁質(zhì)酶抑制化合物的作用機制做了很多積極的探索，在我國相關(guān)領(lǐng)域的研究尚處于起步階段。由于幾丁質(zhì)酶在含幾丁質(zhì)生物的生長發(fā)育過程中發(fā)揮著不可缺少的重要作用，因此幾丁質(zhì)酶抑制化合物作為新型生物殺蟲、抗真菌劑具有較大的開發(fā)前景。最近的研究發(fā)現(xiàn)allosamidin對由IL13介導的Th2炎癥反應(yīng)引起的哮喘病具有明顯的治療作用，同時對其信號傳導途徑做了初步探索［1］。該研究將幾丁質(zhì)酶抑制化合物的研究推到了一個嶄新的階段，為幾丁質(zhì)酶抑制化合物在醫(yī)學領(lǐng)域的應(yīng)用打開了大門。隨著分子生物學技術(shù)的發(fā)展和現(xiàn)代醫(yī)學對某些生命過程的逐步揭示，并對其涉及的關(guān)鍵酶、受體、轉(zhuǎn)錄因子、趨化因子及信號傳導途徑的深入研究，幾丁質(zhì)酶抑制化合物必將在更廣泛的領(lǐng)域發(fā)揮作用，為人類做出更大的貢獻。

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