毛細(xì)管電泳法依據(jù)樣品中各組分之間淌度和分配行為上的差異而實(shí)現(xiàn)分離的電泳分離分析方法01基本介紹儀器要求分離系統(tǒng)分離模式檢測(cè)方法基本操作目錄0305020406基本信息毛細(xì)管電泳：是以彈性石英毛細(xì)管為分離通道，以高壓直流電場(chǎng)為驅(qū)動(dòng)力，依據(jù)樣品中各組分之間淌度和分配行為上的差異而實(shí)現(xiàn)分離的電泳分離分析方法。基本介紹基本介紹所用設(shè)備主要部件有0～30kV可調(diào)穩(wěn)壓穩(wěn)流電源，內(nèi)徑小于100μm(常用50～75μm)、長(zhǎng)度一般為30～100cm的石英毛細(xì)管、電極槽、檢測(cè)器和進(jìn)樣裝置。檢測(cè)器有紫外/可見(jiàn)分光檢測(cè)器、激光誘導(dǎo)熒光檢測(cè)器和電化學(xué)檢測(cè)器，前者最為常用。進(jìn)樣方法有電動(dòng)法(電遷移)、壓力法(正壓力、負(fù)壓力)和虹吸法。成套儀器還配有自動(dòng)沖洗、自動(dòng)進(jìn)樣、溫度控制、數(shù)據(jù)采集和處理等部件。毛細(xì)管電泳所用的石英毛細(xì)管柱，在pH值>3的情況下，其內(nèi)表面帶負(fù)電，與緩沖液接觸時(shí)形成雙電層，在高壓電場(chǎng)作用下，形成雙電層一側(cè)的緩沖液由于帶正電而向負(fù)極方向移動(dòng)，從而形成電滲流。同時(shí)，在緩沖溶液中，帶電粒子在電場(chǎng)作用下，以各自不同速度向其所帶電荷極性相反方向移動(dòng)，形成電泳。帶電粒子在毛細(xì)管緩沖液中的遷移速度等于電泳和電滲流的矢量和。各種粒子由于所帶電荷多少、質(zhì)量、體積以及形狀不同等因素引起遷移速度不同而實(shí)現(xiàn)分離。分離模式分離模式毛細(xì)管區(qū)帶電泳（CapillaryZoneElectrophoresis，CZE）最常見(jiàn)的模式，用以分析帶電溶質(zhì)。樣品中各個(gè)組分因?yàn)檫w移率不同而分成不同的區(qū)帶。為了降低電滲流和吸附現(xiàn)象，可將毛細(xì)管內(nèi)壁做化學(xué)修飾。毛細(xì)管凝膠電泳（CapillaryGelElectrophoresis，CGE）毛細(xì)管凝膠電泳，在毛細(xì)管中裝入單體，引發(fā)聚合形成凝膠，主要用于測(cè)定蛋白質(zhì)、DNA等大分子化合物。另有將聚合物溶液等具有篩分作用的物質(zhì)，如葡聚糖、聚環(huán)氧乙烷，裝入毛細(xì)管中進(jìn)行分析，稱毛細(xì)管無(wú)膠篩分電泳，故有時(shí)將此種模式總稱為毛細(xì)管篩分電泳，下分為凝膠和無(wú)膠篩分兩類。膠束電動(dòng)毛細(xì)管色譜（MicellarElectrokineticCapillaryElectrophoresis，MECE）膠束電動(dòng)毛細(xì)管色譜，在緩沖液中加入離子型表面活性劑如十二烷基硫酸鈉，形成膠束，被分離物質(zhì)在水相和膠束相(準(zhǔn)固定相)之間發(fā)生分配并隨電滲流在毛細(xì)管內(nèi)遷移，達(dá)到分離。本模式能用于中性物質(zhì)的分離。親和毛細(xì)管電泳（AffinityCapillaryElectrophoresis，ACE）親和毛細(xì)管電泳，在毛細(xì)管內(nèi)壁涂布或在凝膠中加入親和配基，以親和力的不同達(dá)到分離目的。儀器要求儀器要求所用的儀器為毛細(xì)管電泳儀。正文中凡采用毛細(xì)管電泳法測(cè)定的品種，其所規(guī)定的測(cè)定參數(shù)，除分析模式、檢測(cè)方法(如紫外光吸收或熒光檢測(cè)器的波長(zhǎng)、電化學(xué)檢測(cè)器的外加電位等)應(yīng)按照該品種項(xiàng)下的規(guī)定外，其他參數(shù)如毛細(xì)管內(nèi)徑、長(zhǎng)度、緩沖液的pH值、濃度、改性劑添加量、運(yùn)行電壓或電流的大小、運(yùn)行的時(shí)間長(zhǎng)短、毛細(xì)管的溫度等，均可參考該品種項(xiàng)下規(guī)定的數(shù)據(jù)，根據(jù)所用儀器的條件和預(yù)試驗(yàn)的結(jié)果，進(jìn)行必要的調(diào)整。電極槽和毛細(xì)管內(nèi)的溶液為緩沖液，可以加入有機(jī)溶劑作為改性劑，以及加入表面活性劑，稱作運(yùn)行緩沖液。運(yùn)行緩沖液使用前應(yīng)脫氣。電泳譜中各成分的出峰時(shí)間稱遷移時(shí)間。膠束電動(dòng)毛細(xì)管色譜中的膠束相當(dāng)于液相色譜的固定相，但它在毛細(xì)管內(nèi)隨電滲流遷移，故容量因子為無(wú)窮大的成分最終也隨膠束流出。其他各種參數(shù)都與液相色譜所用的相同。檢測(cè)方法檢測(cè)方法毛細(xì)管電泳通常用到的檢測(cè)方法有吸收光譜，熒光光譜，熱鏡，拉曼光譜，質(zhì)譜和電化學(xué)方法。分離系統(tǒng)芯片毛細(xì)管區(qū)帶電泳芯片毛細(xì)管凝膠電泳芯片等電聚焦分離芯片膠束電動(dòng)毛細(xì)管電泳分離系統(tǒng)芯片二維電泳分離展望芯片自由流電泳分離系統(tǒng)芯片毛細(xì)管區(qū)帶電泳毛細(xì)管區(qū)帶電泳是芯片毛細(xì)管電泳分離蛋白質(zhì)的一種最基本的分離模式。它基于不同的蛋白質(zhì)分子在電場(chǎng)中的遷移速率不同而實(shí)現(xiàn)分離，是一種簡(jiǎn)單、快速的分離方法。采用區(qū)帶電泳分離模式已成功地分離了多種蛋白質(zhì)樣品。Colyer等采用毛細(xì)管電泳芯片，以區(qū)帶電泳模式對(duì)人血清蛋白樣品進(jìn)行了分離，可分辨出4個(gè)蛋白質(zhì)區(qū)帶(即IgG、轉(zhuǎn)鐵蛋白、a-1-抗胰蛋白酶和白蛋白區(qū)帶，分別用以模擬血清蛋白樣品中的7、p、dl和白蛋白區(qū)帶)。其中蛋白質(zhì)的熒光標(biāo)記在分離之后進(jìn)行，由于熒光染料TNS(2-toluidinonaphtha．1-ene-5-sulfonate)標(biāo)記血清蛋白的靈敏度較低，所以沒(méi)能實(shí)現(xiàn)實(shí)際人血清蛋白樣品的5個(gè)區(qū)帶分離。Xiao等采用區(qū)帶電泳模式，以50mmoVL磷酸鹽緩沖液(pH2.15)作為工作緩沖液，在通道寬度為30um的聚二甲基硅氧烷(PDMS)芯片中，于35s內(nèi)實(shí)現(xiàn)了細(xì)胞色素C和溶菌酶的快速分離。Dodge等設(shè)計(jì)了集成8個(gè)微閥和1個(gè)微泵的PDMS芯片，通過(guò)微閥微泵實(shí)現(xiàn)了對(duì)液流的有效控制。他們首先采用區(qū)帶電泳的分離模式分離牛血清白蛋白和肌紅蛋白，然后通過(guò)閥的作用將分離后的蛋白質(zhì)組分分別引入微混合器中酶解，最后對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行質(zhì)譜分析。該工作顯示芯片技術(shù)可用于質(zhì)譜分析前復(fù)雜蛋白樣品的預(yù)處理。莊等在石英芯片上以75mmol/L硼酸鹽緩沖液(pH10.3)作為芯片電泳緩沖體系，分離了免疫球蛋白、O/一1一抗胰蛋白酶、牛血清白蛋白和鐵傳遞蛋白，并對(duì)經(jīng)臨床確診的妊娠高血壓癥、風(fēng)濕性心臟病、多發(fā)性骨髓瘤患者的尿液樣品進(jìn)行電泳分析，在2min內(nèi)得到了與美國(guó)Helena電泳系統(tǒng)一致的分析結(jié)果。在芯片毛細(xì)管電泳分離蛋白質(zhì)的研究中所要解決的一個(gè)重要問(wèn)題就是通道表面對(duì)大分子蛋白質(zhì)的吸附問(wèn)題。芯片毛細(xì)管凝膠電泳在蛋白質(zhì)組學(xué)和蛋白質(zhì)分離研究中，凝膠電泳是廣泛使用的分離技術(shù)。它是以凝膠等聚合物作為分離介質(zhì)，利用其絡(luò)結(jié)構(gòu)并依據(jù)被測(cè)組分的分子體積不同而進(jìn)行分離的一種分離模式。在芯片上采用凝膠電泳模式分離蛋白質(zhì)，更有利于實(shí)現(xiàn)分離操作的高速度和高效率。Yao等采用十二烷基磺酸鈉(SDS)凝膠電泳分離模式，對(duì)比了芯片SDS毛細(xì)管凝膠電泳與常規(guī)毛細(xì)管凝膠電泳系統(tǒng)分離蛋白質(zhì)的性能，結(jié)果表明前者的分離效率明顯優(yōu)于后者，分離時(shí)間也明顯低于后者。與常規(guī)毛細(xì)管凝膠電泳相同，芯片毛細(xì)管凝膠電泳常用的篩分介質(zhì)也分為凝膠和非膠聚合物溶液兩種。交聯(lián)聚丙烯酰胺凝膠是廣泛使用的一種凝膠篩分介質(zhì)，Herr等首次將傳統(tǒng)的SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS·PAGE)分離蛋白質(zhì)的方法移植到芯片上，采用光聚合的方法在芯片通道內(nèi)制備濃度為6%的交聯(lián)聚丙烯酰胺凝膠作為篩分介質(zhì)，在30S的時(shí)間內(nèi)對(duì)相對(duì)分子質(zhì)量(M，)在5500～39000之問(wèn)的5種蛋白質(zhì)進(jìn)行分離，分離距離僅為4mm，分離效率達(dá)到理論塔板數(shù)4．41×105。該研究組’1引后期又在微通道內(nèi)制備了濃度為22%的交聯(lián)聚丙烯酰胺膜用于蛋白質(zhì)樣品的預(yù)富集，有效富集了相對(duì)分子質(zhì)量為12000～205000的蛋白質(zhì)分子，并采用濃度為8%的交聯(lián)聚丙烯酰胺凝膠作為篩分介質(zhì)進(jìn)行分離。Agirregabiria等在聚甲基丙烯酸甲酯(PM—MA)芯片上使用SU一8光膠制作微通道，采用濃度為12%的聚丙烯酰胺凝膠作為篩分介質(zhì)分離蛋白質(zhì)。隨后該研究組又在該芯片上集成金屬電極，采用相同的分離模式成功地分離了相對(duì)分子質(zhì)量分別為20000和97000的胰蛋白酶抑制劑和磷酸化酶兩種蛋白質(zhì)。芯片等電聚焦分離芯片等電聚焦分離蛋白質(zhì)的原理與常規(guī)毛細(xì)管等電聚焦基本相同，都是依據(jù)蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)(pI)不同而進(jìn)行分離。Hofmann等首次將毛細(xì)管等應(yīng)用于蛋白質(zhì)分析。Li等在PDMS芯片和聚碳酸酯(PC)芯片上，采用等電聚焦模式分離廠牛血清白蛋白和增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(EGFP)。Das等。263采用高聚物芯片，在等電聚焦電泳模式下優(yōu)化了，分離長(zhǎng)度及電壓條件，最終在長(zhǎng)1.9cm的通道內(nèi)于1.5min內(nèi)分離了綠熒光蛋白和R藻紅蛋白，分離電壓為500V。Cui等在PDMS芯片上采用等電聚焦分離模式成功分離了組綠熒光蛋白、異藻青蛋白和藻紅蛋白。該作者還報(bào)道，通過(guò)改變樣品和分離介質(zhì)中添加劑甲基纖維素的濃度，可以改變完成蛋白質(zhì)分離所需要的通道距離，Tsai等通過(guò)采用六甲基二硅氧烷等離子聚合膜修飾玻璃芯片通道的方法抑制蛋白質(zhì)吸附，在等電聚焦的分離模式下分離了藻青蛋白(pI：4·65)、血紅蛋白(pI:7.0)和細(xì)胞色素C(pI：9·6)3種蛋白質(zhì)混合物，分離在3min內(nèi)完成，分離效率為19600塔板/m。Huang等在進(jìn)行芯片等電聚焦分離蛋白質(zhì)時(shí)，采用在兩性電解質(zhì)溶液中加入羥甲基纖維素作為添加劑的方法來(lái)抑制蛋白質(zhì)的吸附。芯片膠束電動(dòng)毛細(xì)管電泳膠束電動(dòng)毛細(xì)管電泳是毛細(xì)管電泳與膠束增溶色譜相結(jié)合的分離技術(shù)，其原理是在裝有膠束溶液的通道內(nèi)，溶質(zhì)組分在電場(chǎng)力的作用下根據(jù)其在膠束相和水相之問(wèn)的分配不同而產(chǎn)生分離。Jin等在玻璃芯片上采用膠束電動(dòng)色譜的分離模式，以Bio-Rad公司的CE·SDS緩沖液作為分離介質(zhì)，成功實(shí)現(xiàn)了相對(duì)分子質(zhì)量在14400～200000之間的8種蛋白質(zhì)的分離。Dou等采用Brij35(polyoxyethylenedodecan01)修飾PDMS芯片通道，在膠束電動(dòng)色譜的分離模式下實(shí)現(xiàn)了葡萄糖氧化酶和肌紅蛋白的有效分離。該芯片涂層在pH2～6范圍內(nèi)可顯著降低蛋白質(zhì)大分子的吸附，并減少檢測(cè)蛋白質(zhì)所需的沖洗時(shí)間，從而提高分離效率。Huang等在PDMS芯片中采用0.1%十二烷基麥芽糖(DDM)和0.03%SDS作為混合膠束，對(duì)通道進(jìn)行動(dòng)態(tài)修飾，有效地抑制了蛋白質(zhì)的吸附，控制了電滲流，使蛋白質(zhì)在非變性條件下得到有效分離。芯片二維電泳分離芯片毛細(xì)管電泳應(yīng)用的成功促進(jìn)了高速高效的芯片二維電泳技術(shù)的發(fā)展。對(duì)于多組分的復(fù)雜蛋白質(zhì)樣品，采用傳統(tǒng)的一維分離方法通常無(wú)法滿足要求，需要采用二維分離技術(shù)來(lái)提高分離效率，增加峰容量。與傳統(tǒng)的毛細(xì)管電泳系統(tǒng)相比，在芯片上進(jìn)行二維電泳分離，可以通過(guò)設(shè)計(jì)芯片通道結(jié)構(gòu)實(shí)現(xiàn)通道的直接交叉或連通，而無(wú)需制作復(fù)雜的二維毛細(xì)管電泳接口，從而避免了因在接口處存在死體積而導(dǎo)致的譜帶擴(kuò)展現(xiàn)象。在芯片二維電泳分離蛋白質(zhì)的研究中，第一維分離模式多采用等電聚焦模式。Chen等制作了二維毛細(xì)管電泳PDMS芯片，利用第一維的等電聚焦和第二維的凝膠電泳對(duì)熒光標(biāo)記的牛血清白蛋白和碳酸酐酶以及德科薩斯紅標(biāo)記的卵清蛋白進(jìn)行分離分析。Li等設(shè)計(jì)了等電聚焦和凝膠電泳聯(lián)用的二維分離高聚物心4t-片。蛋白質(zhì)樣品在完成第一維的等電聚焦分離后，可在多個(gè)并行的通道內(nèi)完成第二維的凝膠電泳分離。整個(gè)分離過(guò)程在10min內(nèi)完成，峰容量達(dá)到1700。Herr等：”1研制r采用十字通道構(gòu)型的等電聚焦一自由區(qū)帶電泳二維芯片系統(tǒng)，芯片通道寬200斗m，深20斗m，待測(cè)樣品在橫向通道中進(jìn)行等電聚焦分離，分離后的樣品區(qū)帶在電場(chǎng)驅(qū)動(dòng)下進(jìn)入縱向區(qū)帶電泳通道中進(jìn)行第二維分離。系統(tǒng)采用熒光顯微鏡成像的方法對(duì)分離性能進(jìn)行了評(píng)價(jià)，5min內(nèi)分離的峰容量達(dá)到1300。Wang等通過(guò)在PDMS芯片中制作微閥來(lái)防止一維等電聚焦和二維凝膠電泳系統(tǒng)之間的分離緩沖液相混合，在20rain內(nèi)有效分離了4種標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)。也有報(bào)道在PMMA芯片上進(jìn)行SDS凝膠電泳和膠束電動(dòng)毛細(xì)管電泳相結(jié)合的蛋白質(zhì)二維電泳分離。該系統(tǒng)在12min內(nèi)完成10種蛋白質(zhì)的分離，峰容量約為l000。此外，還有一類基于芯片的二維分離系統(tǒng)主要應(yīng)用于蛋白質(zhì)酶解物的分離分析。芯片自由流電泳除上述分離模式外，芯片自由流電泳也是芯片電泳分離蛋白質(zhì)的重要方法。芯片自由流電泳是指在芯片中通過(guò)外加電場(chǎng)使樣品隨緩沖液連續(xù)流動(dòng)的同時(shí)沿電場(chǎng)方向進(jìn)行電遷移，從而按照電泳淌度不同實(shí)現(xiàn)分離的電泳分離模式。Raymond等采用芯片自由流電泳模式分離了人血清蛋白、緩激肽和核糖核酸酶A，其分離長(zhǎng)度為3.1cm，流出時(shí)間為62S。Kobayashi等采用自由流電泳的分離模式在一個(gè)體積為56.5mm×35mm×30mm的微分離室(60uL)中實(shí)現(xiàn)了持續(xù)的蛋白質(zhì)分離，并用羥丙基甲基纖維素涂覆來(lái)抑制蛋白質(zhì)吸附，在25min內(nèi)有效分離了細(xì)胞色素C和肌紅蛋白。最近，Kohl．heyer等H3。制作了一種自由流等電聚焦分離蛋白質(zhì)的玻璃芯片，成功地將人血清白蛋白(pI=4.4)與等電聚焦標(biāo)記物(pH3和9)分離。展望微流控芯片毛細(xì)管電泳系統(tǒng)應(yīng)用于蛋白質(zhì)的分離分析具有突出的優(yōu)越性，特別是在臨床檢驗(yàn)及現(xiàn)場(chǎng)監(jiān)測(cè)等方面的應(yīng)用具有良好的發(fā)展前景，同時(shí)，其對(duì)分析儀器的集成化、微型化與便攜化的發(fā)展也具有重要意義。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，Renzi等已經(jīng)研制出手持式的微流控芯片電泳分離蛋白質(zhì)裝置。該裝置由電泳芯片、小型激光誘導(dǎo)熒光檢測(cè)系統(tǒng)以及高壓電源等組成，其體積僅為11.5cm×11.5cm×19.0cm，可用于現(xiàn)場(chǎng)分析、床旁醫(yī)學(xué)診斷以及取證分析。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)已有關(guān)于利用芯片毛細(xì)管電泳進(jìn)行臨床尿蛋白和脂蛋白檢測(cè)的報(bào)道。最近，Pandey等”川使用Caliper公司和Agilent公司的P200蛋白質(zhì)芯片來(lái)檢測(cè)微量的白蛋白尿，將蛋白質(zhì)的電泳分離和熒光檢測(cè)集成化、自動(dòng)化，實(shí)現(xiàn)了其在臨床實(shí)驗(yàn)室的應(yīng)用。很多科研工作者正致力于微流控芯片毛細(xì)管電泳與質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)的研究，以進(jìn)一步提高系統(tǒng)對(duì)復(fù)雜樣品的分離分析能力。上述系統(tǒng)在蛋白質(zhì)分離分析及蛋白質(zhì)組研究中有廣闊的應(yīng)用前景。尤其是對(duì)于復(fù)雜蛋白質(zhì)樣品的多維分離分析，芯片毛細(xì)管電泳以其快速高效的特點(diǎn)，可以作為其中的一維分離方法，顯著提高蛋白質(zhì)的分析通量。相信隨著研究的不斷深入及相關(guān)技術(shù)的不斷發(fā)展，微流控芯片毛細(xì)管電泳蛋白質(zhì)分離技術(shù)將日趨成熟，在生