兔脂肪源性干細(xì)胞在顱骨缺損修復(fù)中的應(yīng)用【摘要】目的:探討脂肪源性干細(xì)胞作為骨組織工程的種子細(xì)胞在修復(fù)兔顱骨缺損中的應(yīng)用前景.方法:提取兔脂肪源性干細(xì)胞，成骨誘導(dǎo)并檢測，將成骨誘導(dǎo)前后的脂肪源性干細(xì)胞種植到自制松質(zhì)骨支架上，將細(xì)胞支架復(fù)合物和單純支架材料分別移植至兔顱骨缺損部位.結(jié)果:與未誘導(dǎo)的脂肪源性干細(xì)胞復(fù)合支架、單純支架以及空白處理對比，成骨誘導(dǎo)后的脂肪源性干細(xì)胞復(fù)合支架修復(fù)骨缺損面積最大，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義.結(jié)論:脂肪源性干細(xì)胞可作為骨組織工程的種子細(xì)胞，其成骨誘導(dǎo)后與自制松質(zhì)骨復(fù)合植入體內(nèi)，能顯著促進骨缺損的修復(fù).

【關(guān)鍵詞】脂肪源性干細(xì)胞；異種松質(zhì)骨；支架材料；骨代用品；生物醫(yī)學(xué)工程；成骨誘導(dǎo)；種子細(xì)胞

0引言

如何獲得充足的種子細(xì)胞是長期以來限制組織工程研究的瓶頸，骨髓基質(zhì)干細(xì)胞盡管已被廣泛應(yīng)用于組織工程研究，但由于其干細(xì)胞含量過低、骨髓抽取量有限以及對患者造成的創(chuàng)傷等，使其廣泛應(yīng)用到受限.2001年Zuk等［1］從脂肪組織中成功提取了干細(xì)胞，并成功誘導(dǎo)其向骨、軟骨、脂肪、心肌等多個方向誘導(dǎo)分化.我們將成骨誘導(dǎo)的脂肪源性干細(xì)胞與異種松質(zhì)骨支架復(fù)合，移植至兔顱骨缺損部位，以探討成骨誘導(dǎo)脂肪源性干細(xì)胞修復(fù)骨缺損的應(yīng)用前景.

1材料和方法

材料新西蘭大白兔12只，4mo齡，體質(zhì)量～kg；Dolbecco改良的Eagle培養(yǎng)基，胎牛血清，地塞米松，抗壞血酸，β甘油磷酸鈉；堿性磷酸酶活性測定試劑盒，牛股骨，甲醇，氯仿，300g/LH2O2等.

方法

的分離培養(yǎng)［1］將新西蘭大白兔按mL/kg速眠新麻醉，取頸部后正中3cm切口，無菌切取肩胛上脂肪組織約2mL.清除切取組織中肉眼可見的小血管，去除外包膜和明顯的結(jié)締組織，DHanks沖洗3遍以洗去紅細(xì)胞的污染.切碎成糊狀，加入2g/LⅠ型膠原酶5mL，在37℃水浴攪拌消化40min，過濾，加入兩倍體積DMEM培養(yǎng)液；②支架+ADSCs；③單純支架；④對照組.A，B組植入上述成骨誘導(dǎo)和未誘導(dǎo)的脂肪源性干細(xì)胞復(fù)合異種松質(zhì)骨支架，所用細(xì)胞均為自體細(xì)胞；C組植入單純的松質(zhì)骨支架，為前述松質(zhì)骨成品PBS液中浸泡7d，9g/LNaCl溶液中浸泡3d后植入；D組不做處理.術(shù)前術(shù)后肌注慶大霉素，2萬U/kg.術(shù)后14wk用過量戊巴比妥鈉麻醉處死動物，取材，X線攝片，計算成骨面積，HE染色行組織學(xué)分析.

統(tǒng)計學(xué)處理：數(shù)據(jù)以x±s表示,應(yīng)用SPSS醫(yī)用統(tǒng)計軟件包進行OneWayANOVA檢驗.為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義.

2結(jié)果

細(xì)胞培養(yǎng)原代脂肪源性干細(xì)胞呈梭形，在β甘油磷酸鈉，地塞米松，抗壞血酸的誘導(dǎo)下，能向成骨方向分化.誘導(dǎo)2wk后茜素紅染色陽性，提示有鈣結(jié)節(jié)形成(圖1B).ALP活性檢測結(jié)果顯示，成骨誘導(dǎo)6d后，支架+成骨誘導(dǎo)ADSCs組與對照組間差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，支架+成骨誘導(dǎo)ADSCs組的ALP活性明顯高于單純支架組.表1不同時期對照組和成骨誘導(dǎo)組堿性磷酸酶含量

電鏡觀察電鏡觀察結(jié)果顯示，成品松質(zhì)骨表面粗糙凸凹不平，ADSCs及成骨誘導(dǎo)后的ADSCs均能粘附在其表面并伸入裂隙中生長，呈現(xiàn)梭形，表面有突起偽足.

術(shù)后大體觀察手術(shù)植入后大體觀察，家兔手術(shù)區(qū)域無紅腫、滲出，無異物排出，給予抗感染治療，家兔飲食、活動良好.

定量分析術(shù)后14wk取材，X線攝片顯示缺損部位有不同量的骨組織形成.對照組、單純支架組和支架+ADSCs組骨缺損部位成骨面積差異無統(tǒng)計學(xué)意義.支架+成骨誘導(dǎo)ADSCs組的成骨面積大于其余3組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，其余各組間成骨面積無顯著性差異.表2兔顱骨缺損修復(fù)的定量分析

組織學(xué)分析HE染色可見各組均有不同程度的新骨形成，尤以支架+成骨誘導(dǎo)ADSCs組新骨形成最為顯著.支架+成骨誘導(dǎo)ADSCs組，支架+ADSCs組和單純支架組均可見支架材料不同程度被吸收，沿支架有新骨形成，支架吸收、新骨形成均以支架+成骨誘導(dǎo)ADSCs組最為顯著.

3討論

ADSCs是一種新的干細(xì)胞，能夠向骨、軟骨、心肌細(xì)胞等多個方向分化［1］.ADSCs可經(jīng)抽脂術(shù)獲得，安全性較高，不良反應(yīng)少，患者容易接受，ASCs在體外增殖和誘導(dǎo)時對血清的要求較低［2-5］.

在抗壞血酸、地塞米松、β磷酸甘油鈉的誘導(dǎo)下，ADSCs的ALP的表達增多，誘導(dǎo)2wk后，茜素紅染色陽性，提示有鈣結(jié)節(jié)的形成，而非誘導(dǎo)組茜素紅染色為陰性，提示ADSCs向成骨方向的分化.2003年Lee等［6］將ADSCs應(yīng)用于體內(nèi)成骨研究，將成骨誘導(dǎo)后的ADSCs復(fù)合多孔PLA材料埋植于大鼠皮下，8wk后有骨組織生成.將成骨誘導(dǎo)的ADSCs與可吸收材料相復(fù)合，有望用于修復(fù)骨缺損.Alejandro等［3］將成骨誘導(dǎo)后的ADSCs用于修復(fù)大鼠腭骨缺損，12wk后，在缺損部位發(fā)現(xiàn)了新生的骨組織.Stefan等［7］將ADSCs與自體松質(zhì)骨顆粒和纖維蛋白膠相混合，成功用于修復(fù)一7歲女孩大面積顱骨缺損，盡管還不能確定這其中ADSCs起了多大的作用，但這一臨床病例確實令關(guān)注ADSCs的人們大受鼓舞.

異種骨來源廣泛，沒有傳播疾病的潛在危險性，且因骨組織結(jié)構(gòu)在不同種屬動物間存在高度同源性，其骨小梁、小梁間隙、空隙率、骨內(nèi)管腔系統(tǒng)及骨鹽支架的三維結(jié)構(gòu)有利于組織細(xì)胞粘附、生長，并為細(xì)胞外基質(zhì)的分泌提供寬大的內(nèi)部空間及表面積，加之其無機成分主要是羥基磷灰石，與人骨成分相同，因此，異種骨結(jié)構(gòu)植入體內(nèi)后易被宿主組織細(xì)胞接近而發(fā)生爬行替代及生物降解，應(yīng)當(dāng)是較理想的載體材料［8-10］.

我們將自制脫鈣、去抗原后的異種松質(zhì)骨用于骨組織工程的支架材料，將其與ADSCs相復(fù)合，用于修復(fù)骨缺損.結(jié)果表明，脫鈣、去抗原后的異種松質(zhì)骨具有良好的生物相容性，成骨誘導(dǎo)前后的ADSCs均能在其表面良好生長，植入體內(nèi)后，能夠被逐步吸收.脫鈣、去抗原后的異種松質(zhì)骨可用作骨組織工程的支架.

我們所用細(xì)胞為自體細(xì)胞，最大程度減小了因機體免疫力的不同而對試驗結(jié)果造成的影響.植入體內(nèi)12wk后，取材X線攝片結(jié)果顯示，成骨誘導(dǎo)后的ADSCs復(fù)合異種松質(zhì)骨支架后能夠更好地修復(fù)骨缺損，而未誘導(dǎo)的支架+ADSCs、單純支架、對照組3組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義.HE染色結(jié)果顯示支架+成骨誘導(dǎo)ADSCs組，支架+ADSCs組和單純支架組均可見支架材料不同程度被吸收，沿支架有新骨形成，支架吸收、新骨形成，但均以支架+成骨誘導(dǎo)ADSCs組最為顯著.成骨誘導(dǎo)后的ADSCs促進了骨缺損的修復(fù).

【參考文獻】

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