關(guān)于實驗六質(zhì)粒提取及瓊脂糖凝膠電泳第1頁，講稿共33頁，2023年5月2日，星期三DNA重組：指不同來源的DNA片段共價連接，通過重新組合，構(gòu)成了具有兩個DNA分子遺傳信息的新的重組體DNA。DNA體外重組技術(shù)：是在分子水平上，根據(jù)人們的需要以人工的方法感興趣的目的基因，在體外與載體DNA分子重組，然后將重組子轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞，并篩選出表達(dá)重組DNA的活細(xì)胞，加以純化、擴增、成為克隆，這一過程稱為DNA體外重組技術(shù)。DNA體外重組技術(shù)是基因工程的核心內(nèi)容。第2頁，講稿共33頁，2023年5月2日，星期三基因克隆簡介

目的基因

載體

酶切，連接

重組基因

轉(zhuǎn)入

受體細(xì)胞篩選陽性克隆

分切、接轉(zhuǎn)篩第3頁，講稿共33頁，2023年5月2日，星期三第4頁，講稿共33頁，2023年5月2日，星期三分子生物學(xué)實驗流程圖第一次第二次第三次第5頁，講稿共33頁，2023年5月2日，星期三載體：可容忍外源性DNA片段插入，可在細(xì)胞間轉(zhuǎn)移并能在細(xì)胞內(nèi)自主復(fù)制的DNA分子。理想的質(zhì)粒克隆載體應(yīng)具有的特性：能在宿主細(xì)胞中獨立復(fù)制，并能攜帶DNA片段一同擴增具有多種常用的限制性內(nèi)切酶的單酶切位點,即多克隆位點(MCS,multiplecloningsites)，便于進(jìn)行克隆分子量小，可插入較大的外源DNA而不影響復(fù)制易于導(dǎo)入受體細(xì)胞具有容易操作的檢測表型。如抗生素抗性、α-互補顯色反應(yīng)（藍(lán)白斑篩選）表達(dá)型載體應(yīng)配備與宿主細(xì)胞相適應(yīng)的啟動子，前導(dǎo)序列，增強子等調(diào)控元件生物安全性好第6頁，講稿共33頁，2023年5月2日，星期三載體種類：

質(zhì)粒噬菌體載體酵母人工染色體（YAC）病毒載體常用的克隆載體第7頁，講稿共33頁，2023年5月2日，星期三質(zhì)粒1.定義：質(zhì)粒是獨立存在于細(xì)菌染色體外的，能獨立復(fù)制的環(huán)狀雙鏈DNA分子?？少x予宿主細(xì)胞一定生物學(xué)性狀，如：抗生素抗性Ampr等。第8頁，講稿共33頁，2023年5月2日，星期三2．來源存在于細(xì)菌、放線菌、真菌以及一些動植物細(xì)胞中，在細(xì)菌細(xì)胞中最多。3．分類質(zhì)粒按復(fù)制方式分為兩種類型：松弛型質(zhì)粒和嚴(yán)緊型質(zhì)粒①嚴(yán)緊型質(zhì)粒(Stringentcontrol)嚴(yán)緊型質(zhì)粒只在細(xì)胞周期的一定階段進(jìn)行復(fù)制,當(dāng)染色體不復(fù)制時,它也不能復(fù)制,通常每個細(xì)胞內(nèi)只含有1個或幾個質(zhì)粒,如F因子。②松弛型質(zhì)粒(Relaxedcontrol)松弛型質(zhì)粒在整個細(xì)胞周期中隨時可以復(fù)制,在每個細(xì)胞中有許多拷貝,一般在20個以上,如Col質(zhì)粒。松弛型質(zhì)粒的復(fù)制不需要質(zhì)粒編碼的功能蛋白，完全依賴于宿主提供的半衰期較長的酶。即使蛋白質(zhì)合成受抑制，質(zhì)粒的復(fù)制依然進(jìn)行。當(dāng)抑制蛋白質(zhì)合成并阻斷細(xì)菌染色體復(fù)制的氯霉素等抗生素存在時，質(zhì)粒的拷貝數(shù)可達(dá)2000-3000拷貝。第9頁，講稿共33頁，2023年5月2日，星期三4.質(zhì)粒的構(gòu)型（1）.超螺旋DNA（supercoiledDNA,scDNA）超螺旋第10頁，講稿共33頁，2023年5月2日，星期三（2）.開環(huán)DNA(opencircleDNA,ocDNA)開環(huán)DNA第11頁，講稿共33頁，2023年5月2日，星期三（3）.線形DNA（linearcircleDNA，lcDNA)第12頁，講稿共33頁，2023年5月2日，星期三與本實驗有關(guān)的兩種質(zhì)粒1.PBR322(作為目的基因供體)4363bp第13頁，講稿共33頁，2023年5月2日，星期三2.PUC18(作為載體）第14頁，講稿共33頁，2023年5月2日，星期三實驗質(zhì)粒DNA提取第15頁，講稿共33頁，2023年5月2日，星期三

實驗?zāi)康?.掌握堿裂解法提取質(zhì)粒的原理和方法。2.掌握瓊脂糖凝膠電泳的原理和基本操作技術(shù)。第16頁，講稿共33頁，2023年5月2日，星期三堿裂解法提取質(zhì)粒原理堿裂解法提取質(zhì)粒DNA的原理是根據(jù)共價閉合環(huán)狀質(zhì)粒DNA與線性染色體DNA的分子大小和結(jié)構(gòu)不同利用二者之間變性和復(fù)性的差異來實現(xiàn)分離的。第17頁，講稿共33頁，2023年5月2日，星期三強堿及機械剪切力①染色體DNA斷裂成小片段線性DNA（機械剪切力)②染色體氫鍵斷裂，雙鏈解離變性（強堿）；①質(zhì)粒DNA保持閉合環(huán)狀；②雙鏈DNA并未完全分離（強堿）。酸中和至中性變性的染色體DNA與變性的蛋白質(zhì)以及細(xì)胞碎片凝聚成網(wǎng)絡(luò)狀大分子不溶性沉淀物質(zhì)粒DNA又恢復(fù)天然構(gòu)型，溶解在上清液中第18頁，講稿共33頁，2023年5月2日，星期三瓊脂糖凝膠電泳瓊脂糖凝膠電泳分離DNA原理第19頁，講稿共33頁，2023年5月2日，星期三帶電顆粒在電場中泳動的速度由于電場力的作用，使帶電顆粒在電場中向一定方向泳動；此顆粒在泳動過程中還受到一個相反方向的摩擦力(f·υ)阻擋；當(dāng)這兩種力相等時，顆粒則以均勻速度(υ)向前泳動第20頁，講稿共33頁，2023年5月2日，星期三式中f為摩擦系數(shù)。根據(jù)Stoke公式，阻力大小取決于帶電顆粒的大小、形狀以及所處介質(zhì)的黏度，即式中f——阻力，牛頓；r——粒子半徑，米；

η——介質(zhì)粘度，牛頓·秒/米2；第21頁，講稿共33頁，2023年5月2日，星期三從公式看出，帶電顆粒在電場中泳動的速度與電場強度和帶電顆粒的凈電荷量成正比，而與顆粒半徑和介質(zhì)黏度成反比

第22頁，講稿共33頁，2023年5月2日，星期三電泳遷移率電泳遷移率（mobility）:在電位強度E的影響下，帶電顆粒在時間t中的遷移距離d。d為帶電顆粒泳動的距離(cm)；l

為支持物的有效長度(cm)；t為通電時間(秒)；V為加在支持物兩端的實際電壓(V)

單位是cm2·sec-1·V-1第23頁，講稿共33頁，2023年5月2日，星期三實驗步驟加1.5ml培養(yǎng)物于EP管，12000rpm×30S重復(fù)一次，最后一次將EP管放在吸水紙上扣干除去上清，加入冰的100μl溶液I，劇烈振蕩EP管

以下動作要輕柔

加入200μl溶液II，溫和顛倒數(shù)次，室溫放置3min

加入150μl冰溶液III，溫和顛倒2-3次，冰浴5min，12000rpm×10min轉(zhuǎn)移上清到新EP管（統(tǒng)一吸400μl

）加入等體積氯仿，溫和混勻，12000rpm×2min

上層水相轉(zhuǎn)移到新EP管（統(tǒng)一吸300μl

）加入2倍體積無水乙醇，顛倒混勻，室溫靜置5min，12000rpm5min

棄上清，沉淀中加1ml70%乙醇，12000rpm×2min

去上清，管平放室溫靜置20-30min，40μlTE溶解DNA

第24頁，講稿共33頁，2023年5月2日，星期三瓊脂糖凝膠板的制備（封板、制備1%凝膠、倒膠、插梳、凝固后拔梳）倒緩沖液，加樣（取質(zhì)粒DNA樣品液10μl+2μl上樣緩沖液，輕輕混勻，避免氣泡）電泳（100V0.5小時，5V/cm）檢測（紫外燈下檢測）第25頁，講稿共33頁，2023年5月2日，星期三主要試劑及作用1.solutionⅠ：①蔗糖：增加溶液的粘度,減少抽提過程中的機械剪切作用,防止破壞質(zhì)粒.(保護(hù)作用)②EDTA：絡(luò)合掉鎂等二價金屬離子,防止DNA酶對質(zhì)粒分子的降解作用。（保護(hù)作用）③Tris?HCl

：能使溶菌液維持溶菌作用的最適PH范圍（緩沖作用）第26頁，講稿共33頁，2023年5月2日，星期三2.solutionII：①SDS的作用裂解細(xì)胞和蛋白質(zhì)變性作用②NaOH（PH>12）的作用是破壞氫鍵，使DNA分子變性（DNA變性作用）0.2mol/LNaOH1%SDS臨用前新鮮配制.第27頁，講稿共33頁，2023年5月2日，星期三3.solutionIII：①HAC溶液能中和溶液Ⅱ的堿性，使質(zhì)粒DNA復(fù)性。②KAC會與SDS形成溶解度很低的鹽，并與蛋白質(zhì)形成沉淀而除去；溶液中的染色體DNA也會與蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合物纏繞成大分子而與小分子質(zhì)粒DNA分離。第28頁，講稿共33頁，2023年5月2日，星期三4.氯仿：進(jìn)一步沉淀去除蛋白質(zhì)5.無水乙醇：沉淀質(zhì)粒DNA6.70%乙醇：洗滌質(zhì)粒DNA7.上樣緩沖液（6x）：

①50%蔗糖：增加密度，以確保DNA樣品沉入點樣孔內(nèi)。②溴酚藍(lán)：指示前沿。第29頁，講稿共33頁，2023年5月2日，星期三便于觀察DNA片段的位置第30頁，講稿共33頁，2023年5月2日，星期三質(zhì)粒三種構(gòu)型電泳時泳動速度大