關于生物制藥酶類藥物第1頁，講稿共72頁，2023年5月2日，星期三第一節(jié)藥用酶類的概述第2頁，講稿共72頁，2023年5月2日，星期三關于酶，你已經(jīng)知道了哪些知識？還想知道哪些知識？第3頁，講稿共72頁，2023年5月2日，星期三酶的分類第4頁，講稿共72頁，2023年5月2日，星期三“綠色健康，“酶”力無限醫(yī)藥、洗滌劑、紡織、淀粉制糖、發(fā)酵、酒精、食品（包括果蔬汁、啤酒釀造、谷物食品、蛋白水解、和功能食品以及食用油脂）、飼料、皮革、造紙和化工等工業(yè)領域

第5頁，講稿共72頁，2023年5月2日，星期三淀粉酶類與淀粉糖業(yè)第6頁，講稿共72頁，2023年5月2日，星期三果汁生產(chǎn)與果膠酶乳制品與凝乳酶第7頁，講稿共72頁，2023年5月2日，星期三酶蛋白成為藥物應具備的條件在生理pH下,具有最高活性和穩(wěn)定性對基質具有較高親和力(低Km值)血清中半衰期較長純度高免疫原性低或無免疫原性不需要外源輔助因子第8頁，講稿共72頁，2023年5月2日，星期三第9頁，講稿共72頁，2023年5月2日，星期三第10頁，講稿共72頁，2023年5月2日，星期三酶類藥物在疾病治療方面的應用酶名來源用途淀粉酶胰臟、麥芽、微生物治療消化不良，食欲不振蛋白酶胰臟、胃、植物、微生物治療消化不良，食欲不振，消炎，消腫，創(chuàng)愈，降壓脂肪酶胰臟、微生物治療消化不良，食欲不振纖維素酶霉菌治療消化不良，食欲不振溶菌酶蛋清、細菌治療各種細菌性和病毒性疾病尿激酶人尿治療心肌梗塞，結膜下出血，黃斑部出血鏈激酶鏈球菌治療血栓性靜脈炎，咳痰，血腫，下出血，骨折青霉素酶蠟狀芽孢桿菌治療青霉素引起的變態(tài)反應L-天冬酰胺酶大腸桿菌治療白血病超氧化物歧化酶微生物，植物，動物預防輻射損傷，治療紅斑狼瘡，皮肌炎，結腸炎凝血酶動物，蛇，細菌，酵母等治療各種出血病膠原酶細菌分解膠原，消炎，化膿，脫痂，治療潰瘍右旋糖酐酶微生物預防齲齒膽堿酯酶細菌治療皮膚病，支氣管炎，氣喘溶纖酶蚯蚓溶血栓彈性蛋白酶胰臟治療動脈硬化，降血脂核糖核酸酶胰臟抗感染，祛痰，治肝癌尿酸酶牛腎治療痛風第11頁，講稿共72頁，2023年5月2日，星期三第12頁，講稿共72頁，2023年5月2日，星期三第13頁，講稿共72頁，2023年5月2日，星期三第14頁，講稿共72頁，2023年5月2日，星期三栓溶酶類與心血管疾病第15頁，講稿共72頁，2023年5月2日，星期三凝血酶第16頁，講稿共72頁，2023年5月2日，星期三健美生消化酶—幫助腸胃蠕動【產(chǎn)品規(guī)格】90片／瓶【食用方法】成人每日3片，隨主餐服用【成分(每片含)】1)消化蛋白質：木瓜蛋白酶50毫克、菠蘿蛋白酶30毫克；2)消化脂肪：脂肪酶30毫克；3)消化碳水化合物/淀粉：淀粉酶50毫克；4)消化乳制品：乳糖酶30毫克；5)消化纖維：纖維素酶15毫克。另含：能抑制過多胃酸的葡萄糖酸鈣，能緩解反胃薄荷葉和茴香【適用人群】·消化不良者·腸胃疾病患者·大病初愈者消化酶類第17頁，講稿共72頁，2023年5月2日，星期三第二節(jié)酶類藥物的制造過程一、原料的選擇1.不同酶的用料選擇乙?；福澑危?、凝血酶(牛血）、透明質酸酶（羊睪丸）、溶菌酶（雞蛋清），超氧化物歧化酶（血、肝）第18頁，講稿共72頁，2023年5月2日，星期三2.注意不同生長發(fā)育情況及營養(yǎng)狀況3.原料來源豐富4.從簡化提純步驟著手5.如用動物組織作原料，應在此動物宰殺后立即取材。第19頁，講稿共72頁，2023年5月2日，星期三二、微生物酶制劑高產(chǎn)菌株的選育菌種是工業(yè)發(fā)酵生產(chǎn)酶制劑的重要條件。優(yōu)良菌種不僅可以提高酶制劑產(chǎn)量和發(fā)酵原料的利用率，而且還與增加品種，縮短生產(chǎn)周期，改進發(fā)酵和提煉工藝條件等密切相關。優(yōu)良菌種獲得的三種途徑：（1）從自然界分離篩選;（2）用物理或化學的方法處理，誘變;（3）用基因重組與細胞融合技術。第20頁，講稿共72頁，2023年5月2日，星期三三、微生物酶制劑生產(chǎn)的發(fā)酵技術（一）培養(yǎng)基1.碳源（甘薯、玉米、麩皮、米糠）2.氮源（豆餅、花生餅、菜籽餅、硫酸銨、尿素）3.無機鹽4.生長因子和產(chǎn)酶促進劑第21頁，講稿共72頁，2023年5月2日，星期三（二）培養(yǎng)方法1.固體培養(yǎng)法固體培養(yǎng)法也稱麩曲培養(yǎng)法，該法是利用麩皮或米糠為主要原料，另外視需要添加其它谷糠、豆餅等，加水拌成含水適度半固態(tài)物料作為培養(yǎng)基。2.液體培養(yǎng)法液體培養(yǎng)法是利用液體培養(yǎng)進行微生物的生長繁殖和產(chǎn)酶。根據(jù)通氣方法的不同，又分為液體表面培養(yǎng)和液體深層培養(yǎng)。深層通氣培養(yǎng)是目前應用最廣的方法。第22頁，講稿共72頁，2023年5月2日，星期三3.影響酶產(chǎn)生的一些因素除培養(yǎng)基，發(fā)酵工藝參數(shù)對產(chǎn)酶的影響也十分明顯。(1)溫度(2)pH(3)通氣(4)攪拌第23頁，講稿共72頁，2023年5月2日，星期三(5)泡沫發(fā)酵過程中，由于發(fā)酵液受到強烈的通氣攪拌，培養(yǎng)基中某些成分的變化及代謝中產(chǎn)生氣體，會形成較多的泡沫，而且氣泡不易消失，是由于培養(yǎng)基中蛋白質分子排在氣泡表面形成一層吸附膜，聚集成泡沫層之故。消泡劑：天然油類，醇類，脂肪酸類，胺類，酰胺類，磷酸酯類，金屬皂類，聚硅氧烷等。第24頁，講稿共72頁，2023年5月2日，星期三(6)添加誘導劑和抑制劑誘導酶抑制劑（表面活性劑）第25頁，講稿共72頁，2023年5月2日，星期三四、酶類藥物的提取和純化

原料選擇生物材料的預處理☆提取濃縮☆純化結晶☆第26頁，講稿共72頁，2023年5月2日，星期三1.動物材料的預處理：（1）機械法：有絞碎、刨碎、勻漿、研磨、超聲波、擠壓等方法。有些酶用機械法處理后仍不能有效的提取，可結合其他處理法。（2）凍融：冷到-10℃左右，再緩慢溶解至室溫，如此反復多次。由于細胞中冰晶的形成，及剩下液體中鹽濃度的增高，能使細胞中顆粒及整個細胞破碎，使酶釋放出來。（3）丙酮粉：組織經(jīng)丙酮迅速脫水干燥制成丙酮粉，不僅可以減少酶的變性，同時因細胞結構成分的破碎使蛋白質與脂質結合的某些化學鍵打開，促使某些結酶釋放到溶液中。材料的預處理第27頁，講稿共72頁，2023年5月2日，星期三2.微生物材料的預處理胞外酶:除去菌體后再直接從發(fā)酵液中吸附提取酶。胞內酶:將菌體細胞破壁，制成無細胞的懸浮液后再行提取。第28頁，講稿共72頁，2023年5月2日，星期三1.干燥法:干燥后菌體產(chǎn)生自溶（1）空氣干燥:適用于熱穩(wěn)定的酶（2）真空干燥:適于細菌（3）冷凍干燥:適用于較敏感的酶2.機械法（1）研磨法（2）組織勻漿法（3）超聲波法（4）高壓勻漿法3.酶法處理第29頁，講稿共72頁，2023年5月2日，星期三(二)酶的提取1.水溶液法常用稀鹽溶液或緩沖液提取。經(jīng)過預處理的原料，包括組織糜，勻漿，細胞顆粒以及丙酮粉等，都可以用水溶液抽提。許多酶再蒸餾水中不溶解，而在低鹽濃度下易溶解，所以提取時加入少量鹽可提高酶的溶解度。第30頁，講稿共72頁，2023年5月2日，星期三2.有機溶劑法某些結合酶如微粒體和線粒體膜的酶，由于和脂質牢固結合，用水很難提取，為此必須除去結合的脂質，且不能使酶變性，最常用的有機溶劑是丁醇。丁醇具有以下特點：（1）親脂性強，特別是親磷脂的能力；（2)兼具親水性，在0℃在水中的溶解度為10.5%；（3）在脂與水分子間能起類似去垢劑的橋梁作用。3.表面活性劑法第31頁，講稿共72頁，2023年5月2日，星期三(三)酶制劑的工業(yè)提取法1.發(fā)酵液的預處理及過濾絮凝劑2.酶液的脫色0.1~1.5%活性炭3.鹽析法4.有機溶劑法5.噴霧干燥直接制備粉末酶制劑第32頁，講稿共72頁，2023年5月2日，星期三酶的分離提純三個基本環(huán)節(jié)：第一抽提，即把酶從材料轉入溶劑中制成酶溶液；

第二純化，即把雜質從酶溶液中除掉或從酶溶液中把酶分離出來；第三制劑，即將酶制成各種劑型。在酶的分離純化過程中．每步都須做三件事：第一，測定酶活力(IU/m1)；第二，測定蛋白質含量(mg/m1)；第三，測量體積(m1)。第33頁，講稿共72頁，2023年5月2日，星期三酶是生物活性物質，操作條件要溫和，一般在0～5℃間進行。初分：用分離蛋白質的方法，如鹽析、等電點沉淀、有機溶劑分級、選擇性熱變性等方法可從酶粗提液中初步分離酶。細分：再采用吸附層析、離子交換層析、凝膠過濾、親和層析、疏水層析及高效液相色譜法等層析技術或各種制備電泳技術進一步純化酶，以得到純的酶制品結晶:酶的結晶過程進行得很慢，需要數(shù)天或數(shù)星期。第34頁，講稿共72頁，2023年5月2日，星期三凡用于蛋白質的純化手段均適用于酶的純化酶的提純常包括兩方面的工作:(1)濃縮：把酶制劑從很大體積濃縮到比較小的體積，(2)去雜蛋白：把酶制劑中大量的雜質蛋白和其他大分子物質分離出去。(四)酶的純化第35頁，講稿共72頁，2023年5月2日，星期三一般原則：防止強酸、強堿,要求加入的化學試劑不使酶變性；在低溫下操作，全部操作在低溫0～4℃；在分離提純過程中，避免劇烈攪拌；在提純溶劑中加一些保護劑，如少量EDTA、少量β-巰基乙醇；在不破壞所需酶的條件下，可使用各種“激烈”的手段。第36頁，講稿共72頁，2023年5月2日，星期三(一)雜質的除去酶提取液中，除所需酶外，還含有大量雜蛋白，多糖，脂類和核酸等，需要除去。（1）pH和加熱沉淀法利用蛋白質酸堿變性性質的差異可以通過調pH和等電點除去某些雜蛋白，也可以利用不同蛋白質對熱穩(wěn)定性的差異。（SOD酶）（2）蛋白質表面變性法利用蛋白質表面變性性質的差別，也可以除去雜蛋白。制備過氧化氫酶，加入氯仿除雜蛋白。第37頁，講稿共72頁，2023年5月2日，星期三(3)選擇性變性法利用蛋白質穩(wěn)定性的不同，除去雜蛋白。(4)核酸沉淀劑法在微生物制備酶時，常含有較多核酸，可用核酸酶降解，離心分離，用核酸沉淀劑如三甲基十六烷基溴化銨，硫酸鏈霉素等。(5)將酶與底物結合，用加熱法除去雜蛋白。近來發(fā)現(xiàn)，酶和底物結合或競爭性抑制劑結合后，穩(wěn)定性大大提高，這樣可以用加熱法除去雜蛋白。第38頁，講稿共72頁，2023年5月2日，星期三基本操作程序：分離：先進行凈化處理（過濾，絮凝，離心脫色），再采用沉淀法分離（鹽析法，沉淀法，超離心等）。第39頁，講稿共72頁，2023年5月2日，星期三酶分離方法有：分子大小:如離心分離法、篩膜分離法、凝膠過濾法等。溶解度大小:如鹽析法、有機溶劑沉淀法、共沉淀法、選擇性沉淀法、等電點沉淀法等。所帶正負電荷:如離子交換分離法、電泳分離法、聚焦層析法等。穩(wěn)定性差異:如選擇性熱變性法、表面變性法等親和作用的差異:如親和層析法等.第40頁，講稿共72頁，2023年5月2日，星期三純化：采用離子交換層析，凝膠過濾，液相色譜，親和色譜和超濾等方法。第41頁，講稿共72頁，2023年5月2日，星期三1.凝膠過濾法(分子篩)原理將樣品混合物通過一定孔徑的凝膠介質,由于流經(jīng)路徑的差異,使不同分子質量的組分分離；大分子物質直接從凝膠顆粒外通過，走得快；小分子物質進入凝膠顆粒的內部再出來，走得慢。第42頁，講稿共72頁，2023年5月2日，星期三第43頁，講稿共72頁，2023年5月2日，星期三2.離子交換法原理利用溶液中各種帶電粒子與離子交換劑之間結合力的差異進行物質分離。DEAE是一種陰離子交換劑，將樣品的pH值調至等電點以上，使樣品帶負電荷，采用鹽溶液洗脫，通過高濃度的帶同種電荷的離子(Cl-)置換被分離的組分T離子強度蛋白濃度T第44頁，講稿共72頁，2023年5月2日，星期三+++++

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帶負電荷的被吸附上帶負電荷少的先被置換帶負電荷多的后被置換第45頁，講稿共72頁，2023年5月2日，星期三

NaClTris連續(xù)梯度洗脫:梯度混合儀第46頁，講稿共72頁，2023年5月2日，星期三3.親和層析法原理

親和吸附劑一般是由固相載體和能與目的酶專一可逆結合的配體共價結合而成的．將親和吸附劑填充層析柱，讓酶溶液流過層析柱，則目的酶能迅速而又選擇件地吸附在親和吸附劑上，用適當?shù)娜芤哼M行洗脫，除去—些非專—性的雜質后．再用濃度高的或親和力強的配體溶液邊行親和洗脫，酶便脫離層析柱上的配體而流出柱外。洗脫方法

改變溫度的洗脫改變pH、離子強度及溶劑系統(tǒng)組成進行洗脫。第47頁，講稿共72頁，2023年5月2日，星期三親合層析原理圖解洗脫液支持物被分離物的抗體其它物質被分離物第48頁，講稿共72頁，2023年5月2日，星期三表—些互為配基的物質。第49頁，講稿共72頁，2023年5月2日，星期三第50頁，講稿共72頁，2023年5月2日，星期三

2.酶的濃縮:（1）工業(yè)上：超濾、真空減壓濃縮、薄膜濃縮、冷凍濃縮、離子交換法、（2）實驗室：除上述方法外，對少量樣品可用下列方法

1.用G-15或G-25濃縮

2.用聚乙二醇(PEG)濃縮

3.凝膠吸水第51頁，講稿共72頁，2023年5月2日，星期三（二）脫鹽和濃縮1.脫鹽（1）透析玻璃紙袋（2）凝膠過濾SephadexG－10第52頁，講稿共72頁，2023年5月2日，星期三(3)復合結晶法有時可以利用某些酶與有機化合物或金屬離子形成復合物或成鹽的性質來結晶。(4)透析平衡利用透析平衡進行結晶也是常用方法之一。(5)等電點法第53頁，講稿共72頁，2023年5月2日，星期三(三)酶的結晶☆特征：有序性，對稱排列，周期性的重復結構

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為空間結構研究提供x-衍射樣品既是純化的結果又是純化的手段第54頁，講稿共72頁，2023年5月2日，星期三把酶提純到一定純度以后，可使其結晶。蛋白質分子多數(shù)處于含水的環(huán)境中，蛋白質分子與水分子結晶形成穩(wěn)定的水合物。當?shù)鞍踪|的濃度非常高的時候，溶液中沒有足夠可以與蛋白質結合的水分子用于形成水合物，在蛋白質分子之間也沒有足夠的水分子可以將它們充分隔開，于是蛋白質就以無定形沉淀或結晶的形式從溶液中析出。第55頁，講稿共72頁，2023年5月2日，星期三2.結晶的條件選擇酶的純度酶的濃度金屬離子pH溫度、時間晶種第56頁，講稿共72頁，2023年5月2日，星期三酶蛋白結晶的基本條件:(1)酶的純度酶只有達到相當純度后才能結晶。酶的純度越高，結晶越容易，長成大的結晶可能性也越大。(2)酶的濃度結晶母液盡可能保持高的濃度。酶的濃度越高越有利于溶液中溶質分子間的相互碰撞聚合，形成結晶的機會也越大。第57頁，講稿共72頁，2023年5月2日，星期三(3)溫度(4)時間(5)pH有時相差0.2pH，只能達到沉淀，而不能達到晶體。(6)金屬離子許多金屬離子能引起或有助于酶的結晶。(7)晶種(8)結晶器皿處理。第58頁，講稿共72頁，2023年5月2日，星期三酶的結晶方法(1)鹽析法在適當?shù)膒H、溫度等條件下，保持酶的穩(wěn)定性，慢慢改變鹽濃度進行結晶。結晶時采用的鹽有硫酸銨，檸檬酸鈉，乙酸銨，硫酸鎂等。利用硫酸銨結晶時一般是把鹽加入到一個比較濃的酶溶液中，并使溶液微呈渾濁為止。然后放置，并且非常緩慢地增加鹽濃度。操作要在低溫下進行，緩沖液pH要接近酶的等電點。第59頁，講稿共72頁，2023年5月2日，星期三(2)有機溶劑法酶液中滴加有機溶劑，有時也能使酶形成結晶。結晶用溶劑有：乙醇，丙醇，丁醇，乙腈，異丙醇，二惡烷，二甲亞砜，二氧雜環(huán)已烷。(3)復合結晶法(4)透析平衡法(5)等電點法第60頁，講稿共72頁，2023年5月2日，星期三酶的制劑形式：

結晶：固體：干燥（冰凍升華，噴霧干燥，真空干燥）液體：低溫（0-4℃，-20℃）提高酶蛋白的濃度加入穩(wěn)定劑固定化第61頁，講稿共72頁，2023年5月2日，星期三保存：通常將純化后的酶溶液經(jīng)透析除鹽后冷凍干燥得到酶粉，低溫下可較長時期保存。也可將酶溶液制成25％甘油或50％甘油分別貯于—25℃或—50℃冰箱中保存。注意：酶溶液濃度越低越易變性，因此切記不能保存酶的稀溶液。

第62頁，講稿共72頁，2023年5月2日，星期三

酶的分離純化工作中的注意事項1.防止酶蛋白變性2.防止輔因子丟失3.防止酶被蛋白水解酶降解第63頁，講稿共72頁，2023年5月2日，星期三采取的措施:1.避免泡沫的生成2.加入金屬鏊合劑EDTA3.加入巰基試劑，如巰基乙醇、二硫蘇糖醇(DTT)等4.加入蛋白酶抑制劑

第64頁，講稿共72頁，2023年5月2日，星期三衡量分離提純方法優(yōu)劣的指標:總活力的回收(表示提純過程中酶的損失情況).比活力提高的倍數(shù)(表示提純方法的有效程度)。第65頁，講稿共72頁，2023年5月2日，星期三總活力=活力單位數(shù)/ml酶液×總體積(m1)比活力=活力單位數(shù)/mg蛋白(氮)=總活力單位數(shù)/總蛋白(氮)mg純化倍數(shù)=每次比活力/第一次比活力回收率(產(chǎn)率)=每次總活力/第一次總活力×100%第66頁，講稿共72頁，2023年5月2日，星期三二、酶活性測定（一）、酶活性1.酶活性或酶活力(Enzymeactivity)：在最適條件下(25C,最適底物濃度和最適pH），酶催化一定化學反應的能力，以酶促反應速度表示。第67頁，講稿共72頁，2023年