關(guān)于蛋白質(zhì)糖基化的研究及進(jìn)展第1頁，講稿共20頁，2023年5月2日，星期三1概述1988年，牛津大學(xué)的RaymondDwek在

AnnualReviewofBiochemistry上發(fā)表題為“糖生物學(xué)”的綜述，標(biāo)志糖生物學(xué)這一前沿領(lǐng)域的誕生。美國的新罕布什大學(xué)首先開展了“糖組學(xué)”（glycomics)的研究美國于2001年正式啟動了“功能糖組學(xué)”的研究第2頁，講稿共20頁，2023年5月2日，星期三“功能糖組學(xué)”研究目標(biāo)基因組計劃提供了基本的遺傳信息，而許多基因的功能仍需要闡明。其中的關(guān)鍵就是蛋白質(zhì)的翻譯后修飾，而糖基化是最主要的翻譯后修飾之一。闡明由蛋白質(zhì)-糖鏈所介導(dǎo)的細(xì)胞通訊機制糖組學(xué)研究的重心便是蛋白質(zhì)糖基化的研究。第3頁，講稿共20頁，2023年5月2日，星期三蛋白質(zhì)糖基化研究的基本目標(biāo)是：尋找編碼糖蛋白的基因?qū)ふ姨腔稽c解析糖鏈及糖基化肽段的結(jié)構(gòu)研究糖基化的功能基因組信息糖基化位點信息結(jié)構(gòu)信息功能信息第4頁，講稿共20頁，2023年5月2日，星期三現(xiàn)代分子生物學(xué)的中心法則：第5頁，講稿共20頁，2023年5月2日，星期三蛋白質(zhì)的糖基化在生物體是廣泛存在的。真核細(xì)胞中，有一半以上的蛋白質(zhì)被糖基化第6頁，講稿共20頁，2023年5月2日，星期三糖鏈的多樣性和復(fù)雜性“連接方式異構(gòu)體”“分枝形成”第7頁，講稿共20頁，2023年5月2日，星期三2蛋白質(zhì)糖基化的分類1．O-糖基化:糖鏈通過GalNAc連接在蛋白質(zhì)的Ser或Thr

等側(cè)鏈的羥基處2．N-糖基化:糖鏈連接在蛋白質(zhì)的Asn的氨基側(cè)鏈處3．GPI-Anchor糖基化:蛋白質(zhì)通過肽鏈的C端共價連接的糖基磷脂酸肌醇錨定在膜脂上。第8頁，講稿共20頁，2023年5月2日，星期三3蛋白質(zhì)糖基化常用研究方法

因為糖鏈的復(fù)雜性，很難通過單一的方法進(jìn)行序列測定等研究，需要多種方法組合完成。糖基化位點分析糖基化蛋白分析糖鏈分析糖蛋白糖鏈釋放單糖分析蛋白酶水解去糖基蛋白氨基酸分析糖鏈糖基肽肽鏈糖鏈釋放氨基酸序列分析去糖基肽鏈糖鏈分餾/純化結(jié)構(gòu)分析酶解糖基肽/寡糖多糖圖譜質(zhì)譜核磁共振第9頁，講稿共20頁，2023年5月2日，星期三蛋白質(zhì)糖基化的研究策略1.凝膠技術(shù)與質(zhì)譜聯(lián)用2.非凝膠技術(shù)與質(zhì)譜聯(lián)用3.O-β-GlcNAc糖基化研究細(xì)胞組織雙向電泳切割酶切質(zhì)譜分析糖鏈鑒定數(shù)據(jù)庫搜索靶蛋白鑒定及功能分析與磷酸化之間存在“陰陽”關(guān)系可以被篩選和鑒定O-β-GlcNApr親和層析母離子掃描366數(shù)據(jù)庫搜索鑒定第10頁，講稿共20頁，2023年5月2日，星期三4糖基化蛋白質(zhì)的分離技術(shù)蛋白質(zhì)混合物分離純化糖蛋白糖肽

凝集素

ConA

是一種典型的對于一系列高甘露糖型的N-連接糖鏈具有高親和性的植物凝集素，同時也能結(jié)合復(fù)雜型的N-連接糖鏈及雙分枝的復(fù)雜型的N-連接糖鏈Mana1-6(Mana1-3)Manβ較強Mana1-2Mana1-6(Mana1-3)Manβ最強缺少三甘露糖核心結(jié)構(gòu)或含有阻礙性的3-OH，6-OH取代基團(tuán)的Mana（α1-6）較弱第11頁，講稿共20頁，2023年5月2日，星期三GalectinLEC-6

PNA

半乳糖苷結(jié)合凝集素是一類分布廣泛，不依賴于金屬離子的可溶性凝集素很多生物具有保守性傾向于結(jié)合包含半乳糖且具有分枝結(jié)構(gòu)的N-連接糖鏈花生凝集素是組織化學(xué)中用于檢測T抗原的。T抗原在黏蛋白中廣泛存在（如血型糖蛋白A）可廣泛結(jié)合于存在O-連接糖鏈的T抗原上第12頁，講稿共20頁，2023年5月2日，星期三5糖基化蛋白的檢測技術(shù)1熒光染色檢測法丹磺酰肼檢測聚丙烯酰胺凝膠中的糖蛋白綠色熒光蛋白即Pro-QEmerald300染色劑

SYPRORubbyPro-QEmerald488第13頁，講稿共20頁，2023年5月2日，星期三2與凝集素聯(lián)用的檢測方法蛋白質(zhì)印跡到膜上后，與標(biāo)記了地高辛的凝集素一起孵育，再通過與帶有堿性磷酸酶的抗地高辛抗體結(jié)合，最后加入顯色試劑進(jìn)行檢測。第14頁，講稿共20頁，2023年5月2日，星期三6質(zhì)譜在蛋白質(zhì)糖基化研究中的應(yīng)用1位點分析

a特征離子檢測尋找糖基特征離子，進(jìn)而確定糖肽如NacGlc特征離子為m/z204b酶處理前后酶解肽譜比對在TIC圖上，酶解前的糖肽峰酶解后消失，出現(xiàn)去糖肽，根據(jù)去糖肽的相對分子量及MS/MS圖確定糖基化位點第15頁，講稿共20頁，2023年5月2日，星期三2糖鏈組成，連接順序及連接方式的分析

ESI串聯(lián)質(zhì)譜可以MS和MS/MS譜圖進(jìn)行解析

離子肼和FTICR在分析糖鏈結(jié)構(gòu)方面有其獨特優(yōu)勢

Cancilla利用堿性降解和MALIDY-FT-MS成功分析了寡糖連接方式質(zhì)量數(shù)推斷對于同質(zhì)量異構(gòu)的糖基無法分辨（Man/Glu)

利用外切糖苷酶處理后，再分析具體的糖鏈結(jié)構(gòu)還需進(jìn)行衍生化。（甲基化，還原胺化）增強疏水性和離子化能力第16頁，講稿共20頁，2023年5月2日，星期三Q-TOF-MS高分辨高靈敏度高精確度母離子掃描

HexNAc+(m/z204)HexHexNAc+(m/z366)MALDI-TOF-MS能方便的檢測出衍生或未衍生的寡糖可以直接分析分子質(zhì)量較大的糖蛋白，并分辨不均一性第17頁，講稿共20頁，2023年5月2日，星期三展望

由于糖蛋白本身的復(fù)雜性，蛋白質(zhì)糖基化的研究必須采取多元化的研究策略和技術(shù)，而各種新的檢測方法也不斷的被采用。

隨著各種分離技術(shù)的不斷發(fā)展，研究方法也不斷翻新。蛋白質(zhì)糖基化研究也將成為翻譯后修飾研究的新熱點第18頁，講稿共20頁，2023年5月2日，星期三主要參考文獻(xiàn)1夏其昌曾嶸等蛋白質(zhì)化學(xué)與蛋白質(zhì)組學(xué)科學(xué)出版社

20042HirabayashiJ,etcJCB2002,771(1-2):67-873HirabayashiJ,etcTrendsGlycosciGlyco,2000,20(6):286-2874CourtenayHartetcElectrophoresis2003,24,588–5985CristianI.RuseetcAnal.Chem.2002,74,1658-16646STEVENAetcProteinScience(1993),2,183-196.7BenjaminL.etcAnal.Chem.2002,74,6088-60978WeiLi,etcAnal.Chem.2002,74,5701-57109RongZeng,etcEur.J.Biochem.266,352-358(1999)10PaulineM.etcProteomics2001,1,285–29411SchulzBLetcAnalChem,2002,74:6088-609712RobbeC,etcBiochemJ2004Dec1;384：307-1613Suzuki,etc,AnalChem,2006A