基因操作的基本技術(shù)第1頁(yè)，課件共44頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月1.凝膠電泳1.1瓊脂糖凝膠電泳原理：

不同大小、不同形狀和不同構(gòu)象的DNA分子在相同的電泳條件下（如凝膠濃度、電流、電壓、緩沖液等），有不同的遷移率，所以可通過(guò)電泳使其分離。凝膠中的DNA可與熒光染料溴化乙錠（EB）結(jié)合，在紫外燈下可看到熒光條帶，籍此可分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

——核酸的分離與檢測(cè)技術(shù)一般過(guò)程：配膠(緩沖液+瓊脂糖）制膠(加入EB，0.5μg/ml）梳子的選擇★第2頁(yè)，課件共44頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月＋－上樣（loadingbuffer)Marker的作用運(yùn)動(dòng)方向電泳分析（低至5ng)質(zhì)粒DNA通常具有三種不同的構(gòu)象：共價(jià)閉合環(huán)狀、線型、開(kāi)環(huán)型。電泳時(shí)，一般共價(jià)閉合環(huán)狀的遷移速度最快，其次為線狀分子，開(kāi)環(huán)型分子最慢凝膠成像系統(tǒng)第3頁(yè)，課件共44頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月（1）緩沖液的作用及種類維持正負(fù)極pH穩(wěn)定：電泳時(shí)正負(fù)極發(fā)生電解反應(yīng)，正極是氧化反應(yīng)（4OH--4e-=2H2O+O2)，負(fù)極是還原反應(yīng)（4H++4e-=2H2)，長(zhǎng)時(shí)間的電泳將使正極變酸，負(fù)極變堿；使溶液具有一定的導(dǎo)電性，以利于DNA分子的遷移；電泳緩沖液的EDTA螯合Mg2+等離子，失活DNA酶，還可防止Mg2+離子與核酸生成沉淀。TAE：超螺旋DNA電泳時(shí)更符合實(shí)際分子質(zhì)量（TBE中大于實(shí)際分子質(zhì)量），且雙鏈線狀DNA在其中的遷移率較其他兩種緩沖液快約10%，分離大于13kb片段效果更好；回收DNA片段時(shí)也選用TAE；但緩沖容量小，不宜長(zhǎng)時(shí)間電泳。TBE:緩沖能力強(qiáng)，適于長(zhǎng)時(shí)間電泳；分離小于1kb的片段時(shí)效果更好；用于瓊脂糖凝膠時(shí)易造成高電滲作用，并與瓊脂糖相互作用生成非共價(jià)結(jié)合的四羥基硼酸鹽復(fù)合物而使DNA片段的回收率降低，不宜在回收電泳中使用。TPE：緩沖能力較強(qiáng)，但由于磷酸鹽易在乙醇沉淀過(guò)程中析出，所以也不宜在回收DNA片段的電泳中使用?！睿═ris/Acetate/EDTA）（Tris/Borate/EDTA）（Tris/Phosphrate/EDTA）第4頁(yè)，課件共44頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月（2）影響DAN片段瓊脂糖電泳的因素：DNA分子的大?。壕€性DNA的遷移率與其分子量的對(duì)數(shù)值成反比。瓊脂糖濃度：分離大小不同的DNA片段需要選擇合適的瓊脂糖凝膠濃度。DNA分子的形態(tài)：在同一濃度的瓊脂糖凝膠中，超螺旋DNA分子遷移率比線性DNA分子快，線性DNA分子比開(kāi)環(huán)DNA分子快。電流強(qiáng)度：每厘米凝膠電壓不超過(guò)5V，若電壓過(guò)高分辨率會(huì)降低，只有在低電壓時(shí)，線性DNA分子的電泳遷移率與所用電壓成正比?！锏?頁(yè)，課件共44頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月500bp以下：聚丙烯酰胺凝膠電泳20Kb以上：脈沖電場(chǎng)凝膠電泳★第6頁(yè)，課件共44頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月（3）脈沖電場(chǎng)凝膠電泳

在單一電場(chǎng)瓊脂糖凝膠中，DNA分子的有效直徑超過(guò)凝膠孔徑時(shí)，在電場(chǎng)作用下，迫使DNA變形擠過(guò)篩孔，而沿著泳動(dòng)方向伸直，因而分子大小對(duì)遷移率影響程度較小。而在成一定角度的雙電場(chǎng)中，電場(chǎng)方向的改變會(huì)使DNA分子重新變形后才能在新方向上通過(guò)凝膠篩孔，DNA分子的變形與改向與其分子大小相關(guān)程度更高，在交替變換電場(chǎng)方向、電場(chǎng)強(qiáng)度的條件下可以分離大分子量DNA分子（10M).★第7頁(yè)，課件共44頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月1.2聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)由丙烯酰胺單體和交聯(lián)劑甲叉雙丙烯酰胺在催化作用下形成的三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)凝膠，網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)具有分子篩效應(yīng)，可以分離大小不同的DNA分子。分辨率高，僅差1bp的DNA分子也能清晰地分開(kāi)（孔徑比瓊脂糖凝膠?。??？捎糜诜蛛x單鏈核酸分子：如RNA、引物等裝載的樣品量大，回收的DNA純度高

★聚合過(guò)程需要有自由基催化完成,過(guò)硫酸銨（AP）為催化劑，四甲基乙二胺（TEMED）為加速劑第8頁(yè)，課件共44頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月主要內(nèi)容1.凝膠電泳2.核酸印記3.PCR第9頁(yè)，課件共44頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月2.核酸印跡

2.1SouthernBlotting原理：

待測(cè)的DNA分子切割后，通過(guò)凝膠電泳進(jìn)行分離，繼而將其變性，并按其在凝膠中的位置轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素薄膜或尼龍膜上，固定后再與同位素或其它標(biāo)記物標(biāo)記的DNA或RNA探針進(jìn)行雜交反應(yīng)。如果待檢物中含有與探針互補(bǔ)的序列，則二者通過(guò)堿基互補(bǔ)的原理進(jìn)行結(jié)合，游離探針洗滌后用自顯影或其它合適的技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)，從而顯示出待檢的片段及其相對(duì)大小。

用途：檢測(cè)樣品中是否含有目的DNA

了解目的DNA的大小、方便基因的獲取檢測(cè)基因拷貝數(shù)1975年，英國(guó)愛(ài)丁堡大學(xué)的SouthernEM首創(chuàng)了DNA分子雜交方法，稱之為Southern印跡轉(zhuǎn)移★第10頁(yè)，課件共44頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月實(shí)驗(yàn)流程：SouthernBlotting★第11頁(yè)，課件共44頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月應(yīng)用舉例：基因及其旁側(cè)序列的酶切位點(diǎn)檢測(cè)

3kb2kb1kb1kbEEEE第12頁(yè)，課件共44頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月2.2NorthernBlotting原理：在變性條件下將待檢的RNA樣品進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，繼而按照同SouthernBlotting相同的原理進(jìn)行轉(zhuǎn)膜和用探針進(jìn)行雜交檢測(cè)。用途：檢測(cè)樣品中是否含有基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物（mRNA）及其含量。與Southern雜交的不同靶核酸：RNASouthern是先電泳后變性，而Northern是電泳前變性；Southern是堿變性，而Northern采用甲醛、乙二醛、二甲基亞砜等變性，因?yàn)椴捎脡A變性會(huì)導(dǎo)致RNA水解1977年,StarkGR建立了RNA分子雜交技術(shù)，被稱為Northern印跡轉(zhuǎn)移★第13頁(yè)，課件共44頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月2.3WesternBlotting原理：在變性條件下將待檢的蛋白質(zhì)樣品進(jìn)行SDS凝膠電泳，繼而按照同SouthernBlotting相同的原理進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，然后利用探針進(jìn)行檢測(cè)。對(duì)已知表達(dá)蛋白，可用相應(yīng)抗體作為探針（一抗）進(jìn)行檢測(cè)，對(duì)新基因的表達(dá)產(chǎn)物，可通過(guò)融合部分的抗體進(jìn)行檢測(cè)。用途：檢測(cè)復(fù)雜生物樣品中蛋白質(zhì)的表達(dá)水平或含量?！锏?4頁(yè)，課件共44頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月樣品變性處理：SDS：破壞氫鍵、結(jié)合蛋白β-巰基乙醇：破壞二硫鍵高溫處理：使蛋白質(zhì)完全變性和解聚，并形成棒狀結(jié)構(gòu)，同時(shí)使整個(gè)蛋白充分結(jié)合SDS，帶上負(fù)電荷。

SDS凝膠電泳濃縮膠：pH6.8,濃度3％，交聯(lián)度低、孔徑大、利于所有蛋白質(zhì)在分離膠前集中成一條很細(xì)的區(qū)帶分離膠：pH8.8按照分子量大小分開(kāi)蛋白質(zhì)分離膠的選擇第15頁(yè)，課件共44頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月SDS垂直電泳系統(tǒng)第16頁(yè)，課件共44頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月印跡固相材料：NC膜、DBM、DDT、尼龍膜、PVDF（聚偏二氟乙烯）等。PVDF具有更好的蛋白吸附、物理強(qiáng)度，以及具有更好的化學(xué)兼容性方法：毛細(xì)管印跡法(效率較低，僅轉(zhuǎn)移10～20％蛋白，較慢）和電泳印跡法（快速高效）封閉

用BSA或脫脂奶等將膜上未結(jié)合蛋白質(zhì)的位點(diǎn)封閉，以免這些位點(diǎn)和后續(xù)實(shí)驗(yàn)中的抗體結(jié)合而干擾分析。第17頁(yè)，課件共44頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月探針雜交用待測(cè)蛋白質(zhì)的抗血清（一抗）處理膜上的印跡，印跡中只有待測(cè)蛋白質(zhì)與一抗結(jié)合，而其它蛋白質(zhì)不與一抗結(jié)合。清洗去除未結(jié)合的一抗后，進(jìn)一步用適當(dāng)標(biāo)記的二抗處理，二抗是指一抗的抗體，帶有標(biāo)記的二抗與一抗結(jié)合，可以指示一抗的位置，即待測(cè)蛋白質(zhì)的條帶位置。除了使用抗體或蛋白作為檢測(cè)探針外，也可用其它探針如放射性標(biāo)記的DNA，可以檢測(cè)印跡中的DNA結(jié)合蛋白。

二抗標(biāo)記方法酶聯(lián)（標(biāo)）法：如堿性磷酸酶或辣根過(guò)氧化物標(biāo)記的二抗，這些酶可以催化某種顯色反應(yīng)。熒光素標(biāo)記法：主要有異硫氰酸熒光素(FITC)或羅達(dá)明

(LissaminerhodamineB200)。同位素標(biāo)記法：125I

高密度金屬標(biāo)記：金標(biāo)記第18頁(yè)，課件共44頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月二抗針對(duì)某一特定物種（如小鼠）的所有抗體均具有特異性，因而使用標(biāo)記的二抗可以免去對(duì)每一個(gè)一抗進(jìn)行標(biāo)記，大大節(jié)省了時(shí)間和費(fèi)用；此外，一個(gè)一抗分子可以同時(shí)結(jié)合幾個(gè)二抗分子，從而使信號(hào)大大增強(qiáng)，提高了實(shí)驗(yàn)靈敏度。第19頁(yè)，課件共44頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月斑點(diǎn)雜交（Dot

blot）將核酸樣品變性后直接點(diǎn)樣于濾膜上，烤干或紫外線照射以固定標(biāo)本，然后與探針進(jìn)行雜交的方法稱斑點(diǎn)雜交或狹縫雜交。斑點(diǎn)印跡為斑點(diǎn)狀，狹縫印跡為線狀。斑點(diǎn)雜交耗時(shí)短，可做半定量分析，一張膜上可同時(shí)檢測(cè)多個(gè)樣品。多用于病原體基因，如微生物的基因，但也可用于檢查人類基因組中的DNA序列。原位雜交（in

situ

hybridization）將噬菌斑或菌落從培養(yǎng)平板轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素濾膜上，然后將濾膜上的菌落裂菌以釋出DNA。將DNA烘干固定于膜上與32P標(biāo)記的探針雜交，放射自顯影檢測(cè)菌落雜交信號(hào)，并與平板上的菌落對(duì)位?？梢杂糜诤Y選大量標(biāo)本，因?yàn)樗辜?xì)胞或噬菌體直接在膜上溶解，所以DNA含量甚至比常用的提取法還高，又不影響與32P標(biāo)記的探針雜交，但它不適用于非放射性標(biāo)記探針，因?yàn)镈NA純度不夠，會(huì)產(chǎn)生高本底。

2.4其他印跡雜交技術(shù)★第20頁(yè)，課件共44頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月原位雜交篩選對(duì)應(yīng)的菌斑或噬菌斑位置不變，可以直接找出陽(yáng)性菌落,多用于從基因文庫(kù)中篩選目標(biāo)基因?！锝M織原位雜交篩選

細(xì)胞或組織經(jīng)處理后不裂解，而是通透性增加使探針進(jìn)入細(xì)胞或組織內(nèi)部，確定目的核酸分子在細(xì)胞內(nèi)的位置第21頁(yè)，課件共44頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月主要內(nèi)容1.凝膠電泳

瓊脂糖，PAGE，脈沖場(chǎng)2.核酸印記

Southern,Northern,WesternBlotting

原位雜交3.PCR第22頁(yè)，課件共44頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月3.PCR(PolymeraseChainReaction)3.1基本原理PCR由變性--退火--延伸三個(gè)基本反應(yīng)步驟構(gòu)成：模板DNA的變性：模板DNA經(jīng)加熱至94℃左右一定時(shí)間后，使模板DNA雙鏈解鏈成單鏈，以便它與引物互補(bǔ)結(jié)合，為下輪反應(yīng)作準(zhǔn)備；模板DNA與引物的退火：模板DNA變性后，溫度降至55℃左右，引物與模板DNA單鏈的互補(bǔ)序列配對(duì)結(jié)合；變性退火延伸★第23頁(yè)，課件共44頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月引物的延伸：DNA模板--引物結(jié)合物在DNA聚合酶的作用下，以dNTP為反應(yīng)原料，靶序列為模板，按堿基配合成一條新的與模板DNA鏈互補(bǔ)的半保留復(fù)制鏈。重復(fù)循環(huán)變性--退火--延伸三過(guò)程，就可獲得更多的“半保留復(fù)制鏈”，而且這種新鏈又可成為下次循環(huán)的模板。每完成一個(gè)循環(huán)需2～4分鐘，2～3小時(shí)就能將待擴(kuò)目的基因擴(kuò)增放大幾百萬(wàn)倍。第24頁(yè)，課件共44頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月3.2反應(yīng)體系反應(yīng)體系包括引物、模板、dNTP、DNA聚合酶、緩沖液引物：和模板配對(duì)的序列一般長(zhǎng)20bp左右，在引物的5’端可加上RBS、啟動(dòng)子、或限制性內(nèi)切酶識(shí)別序列。而3’端必須嚴(yán)格配對(duì)。濃度一般為0.5M，濃度過(guò)高會(huì)導(dǎo)致非特異性擴(kuò)征。模板：模板可以是DNA片段、質(zhì)粒、染色體，甚至可以直接在反應(yīng)體系中加入細(xì)胞來(lái)提供模板。粗制的模板加入量不宜過(guò)多，以避免雜質(zhì)（核酸酶、蛋白酶等）對(duì)反應(yīng)的抑制作用。dNTP：一般加入量為200M，過(guò)高濃度會(huì)提高錯(cuò)配幾率。DNA聚合酶：根據(jù)不同酶產(chǎn)品，按推薦量添加。緩沖液：主要成分為50mMKCl，10mMTris-HCl和1.5MmMgCl2TaqDNA聚合酶的濃度：1.0～2.5U/100μl反應(yīng)液dNTP的濃度：20～200μmol/L。Mg2+濃度：0.5～2.5mmol/L。引物的濃度：0.1～0.5μmol/L★第25頁(yè)，課件共44頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月3.3PCR引物的設(shè)計(jì)原則

引物應(yīng)用核酸序列保守區(qū)內(nèi)設(shè)計(jì)并具有特異性引物與非特異性擴(kuò)增序列的同源性不應(yīng)超過(guò)70%，避免有連續(xù)8個(gè)以上堿基同源。

產(chǎn)物不能形成二級(jí)結(jié)構(gòu)。引物長(zhǎng)度一般在15~30堿基之間。

G+C含量在40%~60%之間。堿基要隨機(jī)分布。引物自身、引物之間不能有連續(xù)4個(gè)以上堿基的互補(bǔ)引物5′端可以修飾。引物3′端不可修飾，也不能形成任何二級(jí)結(jié)構(gòu)。簡(jiǎn)并引物：3′端要避開(kāi)密碼子的第3位。5’3’產(chǎn)物☆第26頁(yè)，課件共44頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月（1）反轉(zhuǎn)錄PCR(ReverseTranscriptionPCR)

經(jīng)過(guò)反轉(zhuǎn)錄酶的作用把RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA后再通過(guò)PCR擴(kuò)增。應(yīng)用于RNA的構(gòu)造解析、cDNA的克隆及RNA水平上的表達(dá)解析等多種領(lǐng)域?！?.4主要的PCR應(yīng)用技術(shù)

第27頁(yè)，課件共44頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月一步法RT-PCR第28頁(yè)，課件共44頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月(2)重疊延伸PCR

SOE—PCR(genesplicingbyoverlapextension

重疊延伸PCR

技術(shù)是一種通過(guò)寡聚核苷酸鏈之間重疊的部分互相搭橋、互為模板,通過(guò)多次PCR擴(kuò)增,從而獲得目的DNA基因片段的方法.

相連引物間的重疊區(qū)域以15～20個(gè)堿基為宜不需要內(nèi)切酶消化和連接酶處理，操作非常簡(jiǎn)便可用于體外進(jìn)行定點(diǎn)突變或DNA片段連接,可用于大片段基因的人工合成,也可在兩片段間插入短序列。成功率高.省去了常規(guī)亞克隆的煩瑣工作.★第29頁(yè)，課件共44頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月重疊延伸PCR原理A1A2B1B23’3’5’5’5’5’3’3’A1B2A1B2第30頁(yè)，課件共44頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月(3)反向PCR反向PCR是用于擴(kuò)增、克隆已知DNA區(qū)段上下游旁側(cè)區(qū)段的PCR方法，可以用于確定未知的旁側(cè)DNA序列。原理圖：如果已知序列為轉(zhuǎn)座子，可以高通量的進(jìn)行基因型-表型關(guān)系的鑒定和研究★第31頁(yè)，課件共44頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月（4）多重PCR多重PCR(multiplexPCR)，又稱多重引物PCR或復(fù)合PCR，它是在同一PCR反應(yīng)體系里加上二對(duì)以上引物，同時(shí)擴(kuò)增出多個(gè)核酸片段的PCR反應(yīng)，其反應(yīng)原理，反應(yīng)試劑和操作過(guò)程與一般PCR相同

多重PCR的主要用于多種病原微生物的同時(shí)檢測(cè)或鑒定,或者病原微生物、某些遺傳病及癌基因的分型鑒定。在同一PCR反應(yīng)管中同時(shí)加上多種病原微生物的特異性引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增.可用于同時(shí)檢測(cè)多種病原體或鑒定出是那一型病原體感染在疾病診斷方面可以節(jié)省大量時(shí)間和病人DNA樣品★第32頁(yè)，課件共44頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月（5）不對(duì)稱PCR（asymmetricPCR）不對(duì)稱PCR：用不等量的引物對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)生大量單鏈DNA的PCR方法,用于DNA測(cè)序和探針制備

兩條引物的比例50:1~100:1，先產(chǎn)生雙鏈DNA，量少的引物耗完后開(kāi)始產(chǎn)生單鏈DNA，PCR結(jié)束后通過(guò)電泳分離單、雙鏈DNA，回收單鏈DNA★第33頁(yè)，課件共44頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月（6）嵌套PCR（nestedprimerPCR）嵌套PCR：是指用兩對(duì)引物擴(kuò)增一個(gè)目標(biāo)片段的PCR，第一對(duì)引物序列在第二對(duì)引物序列的外側(cè)（外引物和內(nèi)引物）。如果內(nèi)側(cè)引物的特異性比較差，使用該引物不能使靶序列得到有效擴(kuò)增。這時(shí)可以先用特異性好的外側(cè)引物進(jìn)行PCR，然后將其擴(kuò)增產(chǎn)物作為模板，用內(nèi)側(cè)引物進(jìn)行第二次PCR。反之，如果外側(cè)引物特異性較差，通過(guò)內(nèi)側(cè)引物再次PCR也能提高特異性（兩對(duì)引物均可擴(kuò)增同一條非特異性條帶的可能性很?。┌肭短譖CR：三條引物，其中一條同時(shí)充當(dāng)外引物和內(nèi)引物。★第34頁(yè)，課件共44頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月第35頁(yè)，課件共44頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月（7）熱啟動(dòng)PCR（hotstartPCR）熱啟動(dòng)PCR:

溫度超過(guò)70℃才能進(jìn)行DNA聚合反應(yīng)的PCR。一般TaqDNA聚合酶在低溫條件下也有活性，如果引物特異性差，當(dāng)PCR反應(yīng)體系配置完成之后，如果模板中有部分單鏈，有可能部分引物在錯(cuò)誤位點(diǎn)結(jié)合進(jìn)行非特異性擴(kuò)增。模板預(yù)熱法（70℃后加入引物和酶等物質(zhì)）蠟防護(hù)層法改進(jìn)的耐熱DNA聚合酶（94℃高溫處理后才具有活性）★第36頁(yè)，課件共44頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月（8）免疫PCR（immunoPCR）免疫PCR：是1992年Sano建立的一種檢測(cè)微量抗原的高靈敏度技術(shù)。該技術(shù)把抗原抗體反應(yīng)的高特異性和聚合酶鏈反應(yīng)的高敏感性有機(jī)結(jié)合起來(lái)，利用抗原抗體反應(yīng)的特異性和PCR擴(kuò)增反應(yīng)的極高靈敏性而建立的一種微量抗原檢測(cè)技術(shù)。其本質(zhì)是一種以PCR擴(kuò)增一段DNA報(bào)告分子代替酶反應(yīng)來(lái)放大抗原抗體結(jié)合率的一種改良型ELISA?？乖H和素標(biāo)記的抗體++DNA報(bào)告分子生物素PCR檢測(cè)★第37頁(yè)，課件共44頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月降落PCR

：是一種設(shè)計(jì)多循環(huán)以使相連循環(huán)的退火溫度越來(lái)越低,從而達(dá)到最佳擴(kuò)增條件的PCR方法。反應(yīng)過(guò)程中起始退火溫度高于Tm值,隨著循環(huán)的進(jìn)行,退火溫度逐漸降低到Tm值,從而確保第一個(gè)引物-模板雜交事件發(fā)生在最互補(bǔ)的反應(yīng)物之間,退火溫度最終低于Tm值。退火溫度的范圍可跨越15℃,從高于Tm5℃至低于Tm10℃左右,條件允許的話,退火溫度可以1℃~2℃遞降。盡管退火溫度最終會(huì)降低到非特異性雜交的Tm值,但此時(shí)目的擴(kuò)增產(chǎn)物已開(kāi)始幾何擴(kuò)增,在剩余循環(huán)中將超過(guò)任何非特異性產(chǎn)物的擴(kuò)增量。降落PCR是一種潛在的一步法找到最佳退火溫度的方法,大大提高了工作效率，保證特異性條帶被優(yōu)先擴(kuò)增出來(lái)。（9）降落PCR（touchdownPCR）★第38頁(yè)，課件共44頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月(10)實(shí)時(shí)定量PCR(RealtimePCR)原理通過(guò)對(duì)PCR擴(kuò)增反應(yīng)中每一個(gè)