4、調(diào)控基因

調(diào)控基因(regulatorygene)是編碼能與操縱子序列結(jié)合的調(diào)控蛋白的基因。調(diào)控方式有負調(diào)控(negativeregulation)和正調(diào)控(positiveregulation)。某些特定的物質(zhì)能與調(diào)控蛋白結(jié)合，使調(diào)控蛋白的空間構(gòu)像發(fā)生變化，從而改變其對基因轉(zhuǎn)錄的影響，這些特定物質(zhì)中凡能引起誘導(dǎo)發(fā)生的分子稱為誘導(dǎo)劑(inducer)，能導(dǎo)致阻遏發(fā)生的分子稱為阻遏劑或輔助阻遏劑(corepressor)。在乳糖操縱元中，調(diào)控基因1acI位于P鄰近，有其自身的啟動子和終止子，轉(zhuǎn)錄方向和結(jié)構(gòu)基因群的轉(zhuǎn)錄方向一致，編碼產(chǎn)生由347個氨基酸組成的調(diào)控蛋白R，在環(huán)境沒有乳糖存在的情況下，R形成分子量為152000的活性四聚體，能特異地與操縱子o緊密結(jié)合，從而阻止結(jié)構(gòu)基因的轉(zhuǎn)錄；當(dāng)環(huán)境中有足夠的乳糖時，乳糖受β-半乳糖苷酶作用轉(zhuǎn)變?yōu)閯e乳糖，別乳糖與R結(jié)合，使R的空間構(gòu)像變化，四聚體解聚成單體，失去與操縱子特異性緊密結(jié)合的能力，從而解除了阻遏蛋白的作用，使其后的基因得以轉(zhuǎn)錄合成利用乳糖的酶類。在這過程中乳糖(實際起作用的是別乳糖)就是誘導(dǎo)劑。5、終止子

終止子(terminator，T)是給予RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄終止信號的DNA序列。在一個操縱元中至少在結(jié)構(gòu)基因群最后一個基因的后面有一個終止子。

說明：在沒有乳糖存在的情況下，乳糖操縱元并非完全停止，還存在著本底組成型合成（backgroundconstitutivesynthesis）。因為阻遏蛋白和操縱子的結(jié)合并不是完全牢固的。也就是說，即使沒有乳糖存在，也會有少數(shù)幾個結(jié)構(gòu)基因群得以合成，一旦有乳糖或者類似物存在，馬上可以利用。和阻遏蛋白結(jié)合的是別乳糖，而不是乳糖。乳糖+H2O別乳糖葡萄糖+半乳糖β-半乳糖苷酶在研究誘導(dǎo)作用時，并不真正用乳糖進行，因為它會被催化降解。實際上用的是一些化學(xué)合成的乳糖類似物，例如異丙基硫代半乳糖苷(isopropylthiogalactoside,IPTG)。它不受β-半乳糖苷酶的催化分解，不被細胞代謝而十分穩(wěn)定，但能與R特異性結(jié)合，使R構(gòu)象變化，誘導(dǎo)1ac操縱元的開放。是很強的誘導(dǎo)劑。還有巰甲基半乳糖苷（TMG）。事例X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-β-半乳糖苷)也是一種人工化學(xué)合成的半乳糖苷，可被β-半乳糖苷酶水解產(chǎn)生蘭色化合物，因此可以用作β-半乳糖苷酶活性的指示劑。IPTG和X-gal被廣泛應(yīng)用在基因工程的工作中。

這些替代物都不是真正的酶的底物，所以稱為安慰性誘導(dǎo)物（gratuitousinducer）。四、真核生物的基因調(diào)控1、真核生物基因組的特點真核基因組比原核基因組大得多真核生物主要的遺傳物質(zhì)在核膜內(nèi)，核外還有遺傳成分，增加了調(diào)控的層次和復(fù)雜性原核基本是單倍體，而真核是二倍體原核編碼序列絕大多數(shù)是連續(xù)的，而真核絕大多數(shù)是不連續(xù)的原核基因組中重復(fù)序列不多，真核中則存在大量重復(fù)序列真核基因表達調(diào)控的環(huán)節(jié)更多真核基因轉(zhuǎn)錄與染色質(zhì)的結(jié)構(gòu)變化相關(guān)真核基因表達以正性調(diào)控為主2、真核生物基因調(diào)控的特點第五章DNA重組與基因工程前言基因工程屬于生物技術(shù)范疇，生物技術(shù)（biotechnology）不是一個獨立的學(xué)科而是一套技術(shù)或手段。廣義的生物技術(shù)指任何利用活的生物體或其一部分生產(chǎn)產(chǎn)品或改良生物品質(zhì)的技術(shù)；狹義的生物技術(shù)是專指以DNA重組技術(shù)和單克隆技術(shù)為標(biāo)志發(fā)展起來的新技術(shù)。一般認(rèn)為生物技術(shù)包括基因工程、細胞工程、酶工程和發(fā)酵工程幾方面的內(nèi)容?；蚬こ淌巧锛夹g(shù)的核心和關(guān)鍵，是主導(dǎo)技術(shù)；細胞技術(shù)是生物技術(shù)的基礎(chǔ)；酶工程是生物技術(shù)的條件；發(fā)酵工程是生物技術(shù)獲得最終產(chǎn)品的手段，四個方面相互聯(lián)系的。生物技術(shù)是一個綜合技術(shù)體系，其中基因工程和細胞融合技術(shù)最為突出。蛋白質(zhì)工程則是在基因工程基礎(chǔ)上綜合蛋白質(zhì)化學(xué)、蛋白質(zhì)晶體學(xué)、計算機學(xué)輔助設(shè)計等知識和技術(shù)發(fā)展起來的研究新領(lǐng)域，開創(chuàng)了按人類意愿設(shè)計和研制人類需要的蛋白質(zhì)的新時期，被稱為第二代基因工程。一般來說，基因工程是指在體外將核酸分子插入質(zhì)粒、病毒或其它的載體當(dāng)中，形成遺傳物質(zhì)的重新組合，使之進入到寄主細胞內(nèi)，并且在寄主細胞當(dāng)中可以持續(xù)穩(wěn)定地繁殖?；蚬こ逃纸凶龌蛑亟M，DNA重組技術(shù)。第一節(jié)工具酶

DNA重組技術(shù)中對核酸的“精雕細刻”主要用酶作為工具。分子生物學(xué)研究過程中發(fā)現(xiàn)的酶，許多都用作工具。限制性核酸內(nèi)切酶（restrictionendonuclease）在重組DNA技術(shù)中有重要地位，在此做詳細介紹。

一、工具酶種類1、限制性內(nèi)切酶：分I、II、III三種2、連接酶：DNA連接酶、RNA連接酶3、聚合酶：DNA聚合酶、RNA聚合酶4、激酶、磷酸酶：堿性磷酸酶、T4多核苷酸激酶5、核酸酶：核酸外切酶、核酸內(nèi)切酶（S1）、脫氧核糖核酸酶（DNaseI）、核糖核酸酶（RNaseA、RNaseH、RNaseT1）6、其他常用酶：甲基化酶、拓撲異構(gòu)酶I、SSB二、限制性核酸內(nèi)切酶的概念很多細菌和細胞中都能識別外來的核酸并將其分解，1962年發(fā)現(xiàn)這是因為細菌中含有特異的核酸內(nèi)切酶，能識別特定的核酸序列而將核酸切斷;同時又伴隨有特定的核酸修飾酶。最常見的是甲基化酶,能使細胞自身核酸特定的序列上堿基甲基化,從而避免受內(nèi)切酶水解,外來核酸沒有這種特異的甲基化修飾,就會被細胞的核酸酶所水解.這樣細胞就構(gòu)成了限制--修飾體系。其功能就是保護自身的DNA,分解外來的DNA,以保護和維持自身遺傳信息的穩(wěn)定,這對細菌的生存和繁衍具有重要意義。這就是限制性核酸內(nèi)切酶名稱中“限制”二字概念的由來。二、限制性核酸內(nèi)切酶的命名

按酶的來源的屬、種名而定，取屬名的第一個字母與種名的頭兩個字母組成的三個斜體字母作略語表示；如有株名，再加上一個字母，其后再按發(fā)現(xiàn)的先后寫上羅馬數(shù)字。例如：從流感嗜血桿菌d株（Haemophilusinfluenzaed）中先后分離到3種限制酶，則分別命名為HindⅠ、HindⅡ和HindⅢ。三、限制性核酸內(nèi)切酶的分類按限制酶的組成、與修飾酶活性關(guān)系，切斷核酸的情況不同，分為三類：Ⅰ類限制性核酸內(nèi)切酶：由3種不同亞基構(gòu)成，具有修飾酶活性和內(nèi)切酶活性，它能識別和結(jié)合于特定位點，隨機切斷識別位點以外的DNA序列，通常在識別位點周圍400-700bp（1000-5000bp）。這類酶的作用需要Mg2+，S腺苷甲硫氨酸及ATP。III類限制性核酸內(nèi)切酶：與Ⅰ類酶相似，既有內(nèi)切酶活性，又有修飾酶活性，切斷位點在識別序列周圍25-30bp（24-26bp）范圍內(nèi)，酶促反應(yīng)除Mg2+外，也需要ATP供給能量。II類限制性核酸內(nèi)切酶：只由一條肽鏈構(gòu)成，僅需Mg2+，切割DNA特異性最強，且就在識別位點范圍內(nèi)切斷DNA。是分子生物學(xué)中應(yīng)用最廣的限制性內(nèi)切酶。通常在重組DNA技術(shù)提到的限制性核酸內(nèi)切酶主要指Ⅱ類酶而言。

四、限制性核酸內(nèi)切酶的作用

1、切割方式大部分限制性核酸內(nèi)切酶識別DNA序列具有回文結(jié)構(gòu)特征，切斷的雙鏈DNA都產(chǎn)生5’磷酸基和3’羥基末端。不同限制性核酸內(nèi)切酶識別和切割的特異性不同。

HindIII5`…AAGCTT…3`3`…TTCGAA…5`EcoRI5`…GAATTC…3`3`…CTTAAG…5`切割產(chǎn)生的末端有三種情況：3`粘性末端，PstI，5`-CTGCAG-3`5`粘性末端，EcoRI，5`-GAATTC-3`平末端，SmaI，5`-CCCGGG-3`2、識別序列頻率1/4N，其中N=識別序列的長度3、同裂酶和同尾酶來源不同但可以識別切割相同的DNA序列，產(chǎn)生相同的末端，這樣的酶稱為同裂酶。如：MboI和Sau3AI（5`-GATC-3`）來源不同，識別切割的序列也不同，但產(chǎn)生相同的粘性末端，稱為同尾酶。如SalI（5`-GTCGAC）和XhoI（5`-CTCGAG-3`）。4、影響酶切反應(yīng)的因素1）鹽濃度2）pH值3）甘油比例4）DNA純度5）DNA甲基化樹立質(zhì)量法制觀念、提高全員質(zhì)量意識。7月-237月-23Saturday,July15,2023人生得意須盡歡，莫使金樽空對月。19:27:3219:27:3219:277/15/20237:27:32PM安全象只弓，不拉它就松，要想保安全，常把弓弦繃。7月-2319:27:3219:27Jul-2315-Jul-23加強交通建設(shè)管理，確保工程建設(shè)質(zhì)量。19:27:3219:27:3219:27Saturday,July15,2023安全在于心細，事故出在麻痹。7月-237月-2319:27:3219:27:32July15,2023踏實肯干，努力奮斗。2023年7月15日7:27下午7月-237月-23追求至善憑技術(shù)開拓市場，憑管理增創(chuàng)效益，憑服務(wù)樹立形象。15七月20237:27:32下午19:27:327月-23嚴(yán)格把控質(zhì)量關(guān)，讓生產(chǎn)更加有保障。七月237:27下午7月-2319:27July15,2023作業(yè)標(biāo)準(zhǔn)記得牢，駕輕就熟除煩惱。2023/7/1519:27:3219:27:3215July2023好的事情馬上就會到來，一切都是最好的安