第5章植物離體快速繁殖和

脫病毒技術(shù)5.1植物快速繁殖技術(shù)5.2無病毒植物的培養(yǎng)概念：所謂快速繁殖，就是將外植體在人工培養(yǎng)基和適宜的條件下進(jìn)行培養(yǎng)，以在短期內(nèi)獲得大量遺傳性一致的個(gè)體的方法。特點(diǎn)：繁殖速度快；使用材料少，生產(chǎn)效率高，省時(shí)省工；可大量繁殖脫毒苗；利于種質(zhì)資源的保存和交換等；節(jié)約空間，不受季節(jié)限制，有利于植物的工廠化生產(chǎn)；在無菌條件下進(jìn)行，不受病蟲害侵害。

5.1植物快速繁殖技術(shù)快速繁殖過程一般包括四個(gè)階段，即無菌培養(yǎng)物的建立、芽的增殖、誘導(dǎo)生根和試管苗的馴化和移載。5.1.1無菌培養(yǎng)物的建立初代培養(yǎng)：進(jìn)行離體繁殖時(shí)首先必須建立的無菌培養(yǎng)物。需注意以下幾點(diǎn)：〔1〕保證無菌：外植體、培養(yǎng)基、培養(yǎng)室無菌狀態(tài)?！?〕條件適宜：適宜的外植體；適宜的培養(yǎng)基；適宜的培養(yǎng)條件。〔3〕技術(shù)過關(guān)：要熟練掌握無菌操作技術(shù)?！?〕防止褐變：外植體褐變是指在接種后，其外表開始褐變，有時(shí)甚至?xí)拐麄€(gè)培養(yǎng)基褐變的現(xiàn)象。它的出現(xiàn)是由于植物組織中的多酚氧化酶被激活，將酚類化合物氧化成醌類物質(zhì)，它們多呈棕褐色，會(huì)抑制其它酶的活性，從而影響所接種外植體的培養(yǎng)。褐變的主要原因①植物種類和基因型由于多酚氧化酶活性上的差異，不同品種間的褐變現(xiàn)象是不同的。②取材部位和生理狀態(tài)處于幼齡期的植物材料褐變程度較淺，而從已經(jīng)成年的植株采收的外植體，由于含醌類物質(zhì)較多，因此褐變較為嚴(yán)重。③培養(yǎng)基成分無機(jī)鹽濃度過高、細(xì)胞分裂素的水平過高等都會(huì)刺激某些外植體的多酚氧化酶的活性，從而使褐變現(xiàn)象加深。④培養(yǎng)條件不當(dāng)如果光照過強(qiáng)、溫度過高、培養(yǎng)時(shí)間過長(zhǎng)等，均可使多酚氧化酶的活性提高，從而加速褐變程度。減輕褐變現(xiàn)象發(fā)生的方法①選擇適宜的外植體一般來說，最好選擇生長(zhǎng)處于旺盛的外植體，這樣可以使褐變現(xiàn)象明顯減輕。②適宜的培養(yǎng)條件無機(jī)鹽成分、植物生長(zhǎng)物質(zhì)水平、適宜溫度等均可以減輕材料的褐變現(xiàn)象。③使用抗氧化劑在培養(yǎng)基中，使用半胱氨酸、抗壞血酸、PVP等抗氧化劑能夠減輕很多外植體的褐變現(xiàn)象。另外，使用0.1%-0.5%的活性炭對(duì)防止褐變也有較為明顯的效果。④連續(xù)轉(zhuǎn)接對(duì)容易褐變的材料可間隔12~24h的培養(yǎng)后，再轉(zhuǎn)移到新的培養(yǎng)基上，這樣經(jīng)過連續(xù)處理7-l0d后，褐變現(xiàn)象便會(huì)得到控制或大為減輕。(3)誘導(dǎo)胚狀體形成是由植物器官、組織和細(xì)胞培養(yǎng)直接發(fā)生類胚結(jié)構(gòu)，最后以肧狀體成苗的方式。在組織培養(yǎng)條件下胚狀體的發(fā)育過程類似于合子胚的發(fā)育：細(xì)胞經(jīng)脫分化后，發(fā)生持續(xù)細(xì)胞分裂增殖，并依次經(jīng)過原胚期、球形胚期、心形胚期、魚雷形胚期和子葉期，進(jìn)而成為成熟的胚狀體。肧狀體途徑優(yōu)點(diǎn)是增值率高，同時(shí)具胚根和胚芽，免去生根一步；可用于制作人工種子，便于運(yùn)輸和保存。缺點(diǎn)是肧狀體成苗率低，遺傳性狀不穩(wěn)定。5.1.3誘導(dǎo)生根MS、B5、White等培養(yǎng)基，都可用于誘導(dǎo)生根，但是其含鹽濃度要適當(dāng)加以稀釋，它們都抑制根的發(fā)生。應(yīng)將它們降低到1／2，1／3或1／4，甚至更低的水平。生根培養(yǎng)基適當(dāng)加大生長(zhǎng)素的濃度，不用或少用細(xì)胞分裂素，生長(zhǎng)素濃度在1-10mg/l，使用較多的是NAA，其次為IAA和IBA。培養(yǎng)基中蔗糖的濃度降低到1.0-1.5%，以增強(qiáng)植株的自養(yǎng)能力。培養(yǎng)基不宜過硬以免影響生根。為提高小植株的光合能力，可將光強(qiáng)度增加到3000-10000lux。5.1.4試管苗的馴化和移栽馴化或煉苗：為了適應(yīng)移栽后較低濕度和較高光強(qiáng)等環(huán)境條件，能順利進(jìn)行自養(yǎng)，必須有一個(gè)逐步鍛煉和適應(yīng)的過程，這個(gè)過程叫馴化或煉苗。移栽前的練苗移栽前可將培養(yǎng)物不開口移到自然光照下鍛煉2—3d，讓試管苗接受強(qiáng)光的照射，或培養(yǎng)基中參加矮壯素等生長(zhǎng)延緩劑等。使苗長(zhǎng)得壯實(shí)起來，然后再開口練苗1—2d，經(jīng)受較低濕度的處理，以適應(yīng)將來自然濕度的條件。移栽和幼苗的管理從試管中取出發(fā)根的小苗，用自來水洗掉根部粘著的培養(yǎng)基，要全部除去，以防殘留培養(yǎng)基滋生雜菌。但要輕輕除去，應(yīng)防止造成傷根。栽植時(shí)用一個(gè)筷子粗的竹簽在基質(zhì)中插一小孔，然后將小苗插入，注意幼苗較嫩，防止弄傷，栽后把苗周圍基質(zhì)壓實(shí)，栽前基質(zhì)要澆透水。栽后輕澆薄水。再將苗移入高濕度的環(huán)境中。搭設(shè)小拱棚，以減少水分的蒸發(fā)，保證空氣濕度達(dá)90%以上。5.1.5快速繁殖中應(yīng)注意的問題〔1〕遺傳穩(wěn)定性外植體的來源：不同種、同一種的不同品種以及同一植株的不同器官發(fā)生變異頻率不同。繼代培養(yǎng)：繼代培養(yǎng)的時(shí)間和次數(shù)是造成變異重要因素。再生植株發(fā)生方式：莖芽直接增殖、外植體直接形成不定芽方式或愈傷組織誘導(dǎo)不定芽方式，變異率依次增強(qiáng)。植物生長(zhǎng)物質(zhì)：是誘導(dǎo)變異的重要原因之一?！?〕玻璃化現(xiàn)象定義：當(dāng)植物材料不斷地進(jìn)行離體繁殖時(shí)，有些培養(yǎng)物的嫩莖、葉片往往會(huì)呈半透明水漬狀，這種現(xiàn)象通常稱為玻璃化。特點(diǎn)：外觀形態(tài)有明顯異常；體內(nèi)含水量、礦質(zhì)元素、糖類、纖維、蛋白質(zhì)等根本成分含量有變化，一些酶活和內(nèi)源激素含量有變化。影響玻璃化苗發(fā)生的因素：培養(yǎng)材料：材料種類和外植體不同都有影響。環(huán)境因素：液體培養(yǎng)比固體培養(yǎng)更易玻璃化；蔗糖濃度與玻璃化呈負(fù)相關(guān)；通氣不良；溫度過高等都可導(dǎo)致玻璃化。培養(yǎng)基成分：銨離子過多可致玻璃化；6-BA濃度與玻璃化呈正相關(guān)等?？刂撇ＡЩ绲拇胧翰捎霉腆w培養(yǎng)，提高蔗糖含量通氣，適當(dāng)提高光強(qiáng)，控制溫度降低培養(yǎng)基中NH4+和細(xì)胞分裂素濃度其它措施月季快速繁殖5.2無病毒植物的培養(yǎng)病毒的危害給植物生產(chǎn)帶來的損失是很大的，造成減產(chǎn)、品質(zhì)變劣等嚴(yán)重后果。如草莓病毒的危害，使草莓產(chǎn)量嚴(yán)重降低，品質(zhì)大大退化。葡萄扇葉病毒使葡萄減產(chǎn)l0%-18%，為害馬鈴薯的病蟲害那么更多，花卉病毒的危害一般會(huì)影響花卉的欣賞價(jià)值等。無病毒苗培育的意義用組織培養(yǎng)方法生產(chǎn)無毒苗，排除了使用藥劑，所以對(duì)減少污染，防止公害，保護(hù)環(huán)境都有積極的意義。5.2.1脫除植物病毒的方法〔1〕物理方法：X射線、紫外線、超短波、熱處理等。熱處理，原理是當(dāng)植物組織處于高于正常溫度的環(huán)境中時(shí)，組織內(nèi)部的病毒受熱之后局部或全部鈍化，在高溫下，不能生成或生成病毒很少，這樣持續(xù)一段時(shí)間，病毒自行消滅，從而到達(dá)脫毒的目的。溫水浸漬處理適用于休眠器官、剪下的接穗或種植的材料，在50℃左右的溫水中浸漬10min至數(shù)小時(shí)，方法簡(jiǎn)便易行，但易使材料受傷。熱空氣處理熱空氣處理對(duì)休眠組織和活潑生長(zhǎng)的莖尖效果較好，將生長(zhǎng)的盆栽植株移入溫?zé)嶂委熓?箱)內(nèi)，一般在35—40℃。處理時(shí)間因植物而異，短那么幾十分鐘，長(zhǎng)可達(dá)數(shù)月。熱處理方法主要缺陷是并非能脫除所有病毒，因此熱處理需與其他方法配合應(yīng)用，才可獲得良好的效果?！?〕化學(xué)方法許多化學(xué)藥品(包括嘌呤、嘧啶類似物、抗菌素等)對(duì)離體組織和原生質(zhì)體具有脫毒效果。常用的藥品有：8—氮鳥嘌呤、2—硫脲嘧啶、殺稻瘟抗菌素、放線菌素D、慶大霉素等。例如，將100μg2—硫脲嘧啶參加培養(yǎng)基可除去煙草愈傷組織中的PVY(馬鈴薯病毒)?！?〕生物方法種子繁殖莖尖培養(yǎng)脫毒法原理：A傳導(dǎo)抑制；B酶缺乏；C能量競(jìng)爭(zhēng)；D抑制因子存在。方法：在進(jìn)行脫毒培養(yǎng)時(shí)，由于微小的莖尖組織很難靠肉眼操作，因而需用帶有適當(dāng)光源的簡(jiǎn)單解剖鏡(8—40倍)。在切取外植體之前一般須對(duì)莖芽進(jìn)行外表消毒。葉片包被嚴(yán)緊的芽，如菊花、蘭花，只須在75%酒精中浸蘸一下，而葉片包被松散的芽，那么要用0.1%次氯酸鈉外表消毒10min。將接種好的莖尖置于22℃左右的溫度下。每天以16h2000—30001x的光照條件下培養(yǎng)。微體嫁接脫毒法木本植物莖尖培養(yǎng)難以生根成植株，將實(shí)生苗砧木在人工培養(yǎng)基上種植培育，再從成年無病樹枝上切取0.2mm左右莖尖，在砧木上進(jìn)行試管微體嫁接，以獲得無病毒幼苗。珠心組織培養(yǎng)脫毒法原理：珠心與維管束系統(tǒng)無直接聯(lián)系。愈傷組織培養(yǎng)脫毒法通過植物器官和組織脫分化培養(yǎng)誘導(dǎo)產(chǎn)生愈傷組織，經(jīng)幾次繼代，然后從愈傷組織再分化產(chǎn)生芽，長(zhǎng)成小植株，可以得到無病毒苗。病毒可能會(huì)在愈傷組織繼代培養(yǎng)過程中消失。莖圓盤培養(yǎng)脫毒法5.2.2脫病毒植株的鑒定〔一〕指示植物(indmatingplant)法利用病毒在其他植物上產(chǎn)生的枯斑作為鑒別病毒種類的方法。摩擦接種法：最早是美國(guó)的病毒學(xué)家Holmes1929年發(fā)現(xiàn)的。他用感染TMV的普通煙葉的粗汁液和少許金剛砂相混合，然后在煙葉子上摩擦，2—3d后葉片止出現(xiàn)了局部壞死斑。這種方法條件簡(jiǎn)單，操作方便，故一直沿用至今，嫁接法：指示植物作砧木，被鑒定植物芽作接穗?！捕趁庖邔W(xué)方法抗血清(antisemm)鑒定法用抗血清可以鑒定未知病毒的種類。這種抗血清就是高度專一性的試劑，這種方法特異性高，測(cè)定速度快，一般幾小時(shí)甚至幾分鐘就可以完成。所以抗血清法成為植物病毒鑒定中最有用的方法之一。酶聯(lián)免疫鑒定法(EnzymelinkedimmunityabsorptionassayELISA)酶聯(lián)免疫法是指采用酶標(biāo)記抗原或抗體的定量測(cè)定法。將抗原固定在支持物上，參加待檢血清，然后參加酶(過氧化物酶或堿性磷酸酶)標(biāo)記的抗體，使待檢血清中與對(duì)應(yīng)抗原的特異性抗體結(jié)合，最后用特殊分光光度計(jì)測(cè)定。此法是現(xiàn)在靈敏度較高和常使用的方法?！踩畴娮语@微鏡鑒定法由于人的眼睛難以觀察小于0.1mm的微粒，所以只有通過電子顯微鏡才能分辨0.5μm大小的病毒顆粒。這樣采用電子顯微鏡既可以直接觀察病毒，檢查出有無病毒存在，了解病毒顆粒的大小、形狀和結(jié)構(gòu)，又可以鑒定病毒的種類。這是一種較為先進(jìn)的方法，但需一定的設(shè)備和技術(shù)。這一方法的優(yōu)點(diǎn)是靈敏度高和能在植物粗提取液中定量測(cè)定病毒?！菜摹撤肿由飳W(xué)方法具有快速、簡(jiǎn)便、靈敏度高、特異性強(qiáng)等特點(diǎn)。核酸雜交技術(shù)PCR技術(shù)基因芯片技術(shù)以馬鈴薯莖尖脫毒培養(yǎng)為例圖1-1脫〔無〕毒試管苗生產(chǎn)程序莖尖繁殖試管苗切斷到試管薯繁殖過程圖4-2不同濃度IAA與GA〔A〕、GA+BAP〔B〕互作對(duì)試管苗生長(zhǎng)及試管薯形成的影響

Fig.4-2DetailsoftheinteractionofvariousIAAconcentratio