CD34＋細胞絕對計數(shù)標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程××醫(yī)院檢驗科臨床免疫室作業(yè)指導(dǎo)書文件編號:XXX生效日期：共頁第頁1.目的規(guī)范流式細胞檢測操作程序，保證全血、骨髓或單采造血干細胞懸液造血干細胞的測定項目的正常開展，使得測量數(shù)據(jù)和檢測結(jié)果具有良好的溯源性、準(zhǔn)確性和可靠性。2.原理在樣本中加入適量的試劑后，試劑中熒光標(biāo)記的單克隆抗體與細胞表面的抗原特異性結(jié)合，核酸染料標(biāo)記所有有核細胞的DNA和RNA，同時加入已知數(shù)目的熒光微球。在分析時，用采集的CD34細胞的數(shù)目除以采集的熒光微球的數(shù)目，再乘以熒光微球的濃度即可計算出樣本中CD34＋細胞的絕對數(shù)目。3.標(biāo)本要求標(biāo)本主要為單采的干細胞，樣本采集后立刻送檢。4.試劑與儀器表所示CD34＋細胞絕對計數(shù)試劑一覽表試劑名稱品牌劑型規(guī)格保存條件單克隆CD34PE2~單克隆CD34PE2~8℃抗體CD45PC5品牌A液體1ml2mg／mlBSA的PBS2~8℃氯化銨溶血劑自配試劑液體室溫室溫鞘液鞘液液體—清洗液清洗液液體L—L—液體—2—含核酸染料、CD34PE、CD45PerCP組合抗體；②試劑B(1瓶)：對照試劑包含核酸染料、KLHPE、CD45PerCP組合抗體，2~8℃保存。1∶10稀釋為1×溶血素，室溫下可以穩(wěn)定1個月。5.操作步驟PE各10μl，對照管加入CD45PC510μl和IgGPE10μl。S案(ISHAGE方案)采樣分析。數(shù)據(jù)采集和結(jié)果分析(CXP2．0分析軟件分析結(jié)果)：ISHAGE方案設(shè)門有著嚴(yán)格強度。Trucount絕對計數(shù)管，CD34檢測管和對照管，同時在每一管上要同時標(biāo)記樣本的編碼。的試劑放到絕對計數(shù)管金屬網(wǎng)架上面的管壁上，不要碰到管底的顆粒。5．2．1．3反向加樣技術(shù)吸取50μl混勻的樣本到每一個絕對計數(shù)管中。蓋上絕對計數(shù)管n機檢測。光微球檢查儀器的光路、流路及補償。 取至少60000個細胞，獲取對照管細胞至少60000個細胞。用對照管來評價非特異性染色。er開始檢測樣本。錄實驗數(shù)據(jù)。若存在問題樣本，檢查出錯原因(觀察上樣管有無裂縫等)。將Loader歸位后在獲取面板點擊“RunCarousel”，在跳出的對話框中選擇要重新檢測的樣本。確認(rèn)后開始檢測樣本。6.校準(zhǔn)常用方式為使用試劑／儀器對應(yīng)的質(zhì)控微球溶液對儀器系統(tǒng)校準(zhǔn)和電壓標(biāo)定。7.質(zhì)控開機前先使用標(biāo)準(zhǔn)校準(zhǔn)微球校準(zhǔn)儀器，對于無廠家或第三方質(zhì)控品的項目可在不同儀器之間進行比對。8.結(jié)果判斷9.注意事項9．2·樣本要充分混勻后加樣；最后計算前加微球時一定要混勻，取樣及微球的均勻程度將直接影響檢測結(jié)果；建議做復(fù)管取均值。9．3·對于任何包含絕對計數(shù)的實驗，采集細胞數(shù)的多少會影響結(jié)果。至少采集60000個細胞和1000個微球。9．4·成分白細胞樣本必須在采集6h內(nèi)染色，并在染色后24h內(nèi)上機分析。外周血和動員后的血標(biāo)本要在采集后24h內(nèi)染色，并在染色后24h內(nèi)上機分析。其他類型的樣本要在10.臨床意義CD34是20世紀(jì)80年代中期發(fā)現(xiàn)的一種細胞表面黏附分子，表達在骨髓和外周血的造血干／祖細胞及具有造血潛能的各種集落形成細胞上，包括多能及定向造血祖細胞。CD34＋細胞在正常骨髓中占1％~4％，正常人外周血中＜0．01％。動物體內(nèi)及人類臨床實踐均證明輸入一定數(shù)量的CD34