淋巴細胞亞群檢測標準操作規(guī)程××醫(yī)院檢驗科臨床免疫室作業(yè)指導(dǎo)書文件編號:XXX生效日期：共頁第頁1.目的規(guī)范淋巴細胞亞群檢測的操作程序，保證項目的正常開展，使得測量數(shù)據(jù)和檢測結(jié)果具有良好的溯源性、準確性和可靠性。2.原理熒光素標記的各種單克隆抗體加入全血中，與白細胞膜上相應(yīng)的抗原結(jié)合，經(jīng)過溶血、洗滌(和固定)等步驟后，在流式細胞儀上進行分析，從而得到淋巴細胞亞群的百分數(shù)。淋巴細胞表面抗原分布如下：T淋巴細胞：CD3＋；B淋巴細胞：CD19＋；輔助性T淋巴細胞：細胞膜上CD分子表達的不同，流式細胞儀可以分辨出淋巴細胞及其各種不同的亞群，利用計算機軟件計算出淋巴細胞亞群的百分數(shù)。3.標本要求EDTA管)。室溫保存的抗凝全血，可穩(wěn)定48h；染色固定后的樣本在2~8℃條件下可穩(wěn)定24h。4.試劑與儀器表所示淋巴細胞亞群試劑一覽表試劑名稱品牌劑型規(guī)格保存條件液體液體液體2~8℃2~8℃2~8℃單克隆抗體2mg／mlBSA的PBSA：甲酸配試劑液體室溫溶血劑B：碳酸鈉等配試劑液體碳酸鈉等室溫C：多聚甲醛配試劑液體14ml多聚甲醛室溫鞘液液體—室溫清洗液液體L—室溫熒光微球液體—2~8℃Trucounttube(內(nèi)含數(shù)量已知的Beads)；FACSLysingSolution(溶血素)(10×，使用前用蒸餾含血細胞分析用溶血劑。③流式溶血劑(使用前用蒸餾水做10倍稀釋，即溶血劑∶蒸餾水＝1∶9)。5.操作步驟5．1．1按照檢測要求，分別向已編好號的試管中加入20μl單克隆抗體和同型對照。分別向試管中加入混勻的100μl抗凝血?；靹?，避光，室溫孵育20~30min。路充滿并能打出液體)。A和B)區(qū)分這兩支管。注意：使用前，確認Trucount微球處于管底部的金屬網(wǎng)下。否則，丟棄該Trucount管，并用另一支替換。不要將微球轉(zhuǎn)移到另外一支管中。使用Trucount管，確保移液液面剛好高于不銹鋼網(wǎng)。不要接觸微球。注意：①避免讓血液污染管壁。如果全血殘留在管壁，則不能被試劑染色并且會影響結(jié)果。使用Trucount管時，精確移液非常重要。②使用反向移液技術(shù)將樣本移取到管壁，使其剛好高于不銹鋼網(wǎng)。反向移液時，將按鈕按至第二個刻度點。釋放按鈕時，過量樣本將被吸入吸頭中。將按鈕按至第一個刻度點排出精確體積的樣本，將過量樣本留在吸頭中。5．2．1．5蓋上管蓋并輕輕混勻振蕩進行混勻。在室溫(20~25℃)環(huán)境下避光孵育射光照射。于室溫下(20~25℃)進行此程序操作。上機檢測。血不要碰到試管底部的微球(Beads)。置15min。FACSCantoClinical軟件獲取2500個淋巴細胞進行檢測，上機前應(yīng)充分混勻。5．3．1按照實驗需求擺放血樣和流式管，標記流式管編號對應(yīng)血樣編號(例：1T，1CD45／CD19加入BNK管底部。漩渦震蕩3s混勻或手動顛倒10次全血標本，用反向加樣法分別取50μl全血分別加入T、BNK管底部。漩渦震蕩器上，每個樣本管輕輕混勻3s，室溫靜5．3．3將血細胞分析用溶血劑稀釋成1×備用(1體積原液∶9體積蒸餾水)。每個樣本管各加450μl稀釋好的溶血劑。漩渦震蕩器上，樣本管輕輕混勻3s，室溫靜置避光孵育15min。上機檢測(混勻一個，檢測一個)。5．4．2各吸取50μlEDTA抗凝靜脈血分別加入T管和BNK管底部(避免將血樣沾到試管壁上)。試管在渦旋混勻器上輕旋混勻，室溫(20~25℃)避光孵育15min。5．4．3分別向兩個試管中加入450μl1×溶血素，在渦旋混勻器上輕旋混勻，室溫(20~注意：以上各品牌上機后操作步驟詳見儀器操作標準操作規(guī)程。6.校準常用方式為使用試劑／儀器對應(yīng)的質(zhì)控微球溶液對儀器系統(tǒng)校準和電壓標定。7.質(zhì)控7．2·保存條件：未開瓶的試劑于2~8℃保存，可在有效期內(nèi)保持穩(wěn)定，稀釋的試劑于2~8℃可穩(wěn)定2周。質(zhì)控軟件。與靶值比較，定期評估結(jié)果穩(wěn)定性。7．6·備注：新到批號的質(zhì)控品需按照日常標本的檢測方法連續(xù)檢測20次，確定本實驗室的靶值及質(zhì)控可接受范圍。每次使用與樣本同樣抗體組合，平行染色，查對可允許范圍，確定是否可以接受，并檢查染色模式和細胞分群情況。8.結(jié)果判斷根據(jù)淋巴細胞膜上CD分子表達的不同，流式細胞儀可以根據(jù)不同熒光標識分辨出淋巴細胞及其各種不同的亞群，利用計算機軟件計算出淋巴細胞亞群的百分數(shù)。還可通過加入熒光微球計算出亞群細胞的數(shù)量。9.注意事項果。9．2·實驗操作中提到要用漩渦震蕩器混勻的步驟一定要充分混勻。min9．6·如果試劑外觀發(fā)生變化，不得繼續(xù)使用。試劑的沉淀和變色意味著試劑不穩(wěn)定或者變性。請勿使用過期的試劑；試劑請勿凍存；試劑須避光保存，使用時試劑應(yīng)盡可能短的暴露于光線下，建議使用前將試劑恢復(fù)至室溫。10.臨床意義10．1·淋巴細胞亞群的檢測是檢測機體細胞免疫和體液免疫功能的重要指標，它可以輔助診斷某些疾病(如自身免疫病、免疫缺陷病、惡性腫瘤、血液病、變態(tài)反應(yīng)性疾病等)，分析發(fā)病機制，對觀察療效及監(jiān)測預(yù)后有重要意義。10．2·T淋巴細胞在免疫應(yīng)答過程中起抗原識別、細胞免疫和免疫調(diào)節(jié)的作用，其缺陷或功能不良會引起細胞免疫功能異常，而且也會影響其調(diào)節(jié)B細胞的功能，導(dǎo)致抗體缺陷，患者經(jīng)常表現(xiàn)一系列臨床癥狀，如容易反復(fù)感染、自身免疫病或惡性腫瘤的發(fā)病率增加等。它包括CD4和CD8兩個亞群，兩個亞群之間有著相互制約和相互輔助的關(guān)系，任何一方的增多和減少都會造成機體免疫功能的紊亂。用免疫抑制劑(如環(huán)孢素A)等患者皆可降低。自身免疫病時可增高。10．2．2CD8淋巴細胞(抑制／細胞毒性T細胞)增高可見于各種病毒感染；降低見于自身免疫病，如SLE活動期、慢性活動性肝炎及各種嚴重的免疫缺陷病。CDCD后可能發(fā)生排斥反應(yīng)；比值倒置一般認為是病毒感染的重要指征。10．3·B淋巴細胞參與抗原識別和體液免疫。其降低見于體液免疫功能抑制者，如聯(lián)合免疫缺陷病、無丙球蛋白血癥或使用化療