/wswxtbcnJul.20,2023,50(7):2876?2Copyright?2023MicrobiologyChinaAllRightsReserved研究報(bào)告研究報(bào)告沈會(huì)芳，楊祁云，張景欣，蒲小明，孫大元，林壁潤*廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所廣東省植物保護(hù)新技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州510640沈會(huì)芳沈會(huì)芳,楊祁云,張景欣,蒲小明,孫大元,林壁潤.貝萊斯芽孢桿菌GDND-2對(duì)煙草鐮孢根腐病菌生長發(fā)育的影響[J].微生物學(xué)通報(bào),2023,50(7):2876-2891.SHENHuifang,YANGQiyun,ZHANGJingxin,PUXiaoming,SUNDayuan,LINBirun.EffectofBacillusvelenzensisGDND-2onthegrowthanddevelopmentofFusariumoxysporiumfromtobacco[J].MicrobiologyChina,2023,50(7):2876-2891.摘要：【背景】尖孢鐮孢(Fusariumoxysporum)引起的煙草根腐病在世界煙區(qū)普遍發(fā)生，嚴(yán)重影響煙草產(chǎn)量和質(zhì)量，化學(xué)農(nóng)藥無法有效防治病害，利用生防菌防治該病成為研究熱點(diǎn)。【目的】明確貝萊斯芽孢桿菌(Bacillusvelenzensis)GDND-2對(duì)尖孢鐮孢生長發(fā)育的抑制作用。【方法】制備含10%和20%GDND-2發(fā)酵濾液的PDA培養(yǎng)基，涂在玻片上，接種尖孢鐮孢分生孢子，觀察濾液對(duì)尖孢鐮孢孢子萌發(fā)、菌絲生長、孢子形成和色素產(chǎn)生的影響，應(yīng)用掃描和透射電鏡觀察菌體超微結(jié)構(gòu)的變化?！窘Y(jié)果】貝萊斯芽孢桿菌GDND-2發(fā)酵濾液延遲孢子萌發(fā)2h以上造成芽管膨大畸形，促使菌絲提早分枝，抑制菌絲延伸，使菌絲產(chǎn)生畸形球狀結(jié)構(gòu)，10%和20%發(fā)酵濾液對(duì)菌絲生長抑制率達(dá)53.41%和61.58%。濾液延遲病菌產(chǎn)孢，顯著抑制產(chǎn)孢量，影響孢子形態(tài)，刺激病菌產(chǎn)生色素。10%和20%發(fā)酵濾液延遲產(chǎn)孢20h和28h，對(duì)產(chǎn)孢量的抑制率為52.11%和78.85%，濾液促使病菌形成小型分生孢子。觀察尖孢鐮孢的超微結(jié)構(gòu)，部分菌絲膨大、畸形，細(xì)胞壁變薄，細(xì)胞膜消失，細(xì)胞質(zhì)滲出，胞內(nèi)呈空腔結(jié)構(gòu)；部分菌絲嚴(yán)重皺縮、扭曲、變細(xì)，嚴(yán)重時(shí)出現(xiàn)穿孔現(xiàn)象；部分菌絲細(xì)胞嚴(yán)重囊泡化，細(xì)胞器分布不均勻；部分細(xì)胞脂質(zhì)體數(shù)量明顯增加?！窘Y(jié)論】貝萊斯芽孢桿菌GDND-2發(fā)酵濾液能抑制尖孢鐮孢的整個(gè)生產(chǎn)發(fā)育過程，包括孢子萌發(fā)、菌絲生長和孢子形成。關(guān)鍵詞：貝萊斯芽孢桿菌GDND-2；煙草鐮孢根腐病菌；生長發(fā)育；超微結(jié)構(gòu)資助項(xiàng)目：廣東省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目(2022KJ112)；廣東省煙草科技計(jì)劃(201908)ThisworkwassupportedbytheGuangdongModernAgriculturalIndustrialTechnologySystemInnovationTeamProject(2022KJ112)andtheGuangdongProvinceTobaccoScienceandTechnologyProject(201908).*Correspondingauthor.E-mail:linbr@126.comReceived:2022-07-12;Accepted:2023-01-17;Publishedonline:2023-03-22沈會(huì)芳等:貝萊斯芽孢桿菌GDND-2對(duì)煙草鐮孢根腐病菌生長發(fā)育的影響EffectofBacillusvelenzensisGDND-2onthegrowthanddevelopmentofFusariumoxysporiumfromtobacco*SHENHuifang,YANGQiyun,ZHANGJingxin,PUXiaoming,SUNDayuan,LINBirunInstituteofPlantProtection,GuangdongAcademyofAgriculturalSciences,KeyLaboratoryofNewTechniqueforPlantProtectioninGuangdongProvince,Guangzhou510640,Guangdong,ChinaAbstract:[Background]RootrotcausedbyFusariumoxysporumiscommonintobaccogrowingareasworldwide,severelythreateningthequalityandyieldoftobacco.Aschemicalpesticidesfailtoeffectivelycontrolthepathogen,biocontrolstrainshaveattractedtheinterestofscholars.[Objective]ToclarifytheinhibitoryeffectofBacillusvelenzensisGDND-2onthegrowthanddevelopmentofF.oxysporiumfromtobacco.[Methods]ThePDAcontaining10%and20%fermentationfiltrateofGDND-2wascoatedonglassslides,andthentheconidiaofF.oxysporumwereinoculated.Theeffectofthefermentationfiltrateonconidialgermination,hyphalgrowth,sporulation,andpigmentproductionofF.oxysporumwasinvestigated,andtheultrastructureofF.oxysporumhyphaewasobservedbyscanningandtransmissionelectronmicroscopy.[Results]AfterthetreatmentwithfermentationfiltrateofGDND-2,theconidialgerminationwasover2hlate.Thefermentationfiltrateresultedinthemalformationofgermtubesandearlybranchingofhyphae.Itinhibitedtheelongationofhyphaeandthustheyshowedmalformedsphericalstructure.Theinhibitionratesofhyphalgrowthby10%and20%fermentationfiltratewere53.41%and61.58%,separately.Thefermentationfiltratedelayedthesporulationofthepathogen,significantlyreducedthesporequantity,affectedtheconidialmorphology,andpromotedthepigmentproductionbythepathogen.Undertheactionof10%and20%fermentationfiltrate,thesporulationhappened20hand28hlate,respectively,andtheinhibitionratesofsporequantitywere52.11%and78.85%,separately.ThefermentationfiltratestimulatedF.oxysporumtoformmicroconidia.AsfortheultrastructureofF.oxysporium,somehyphaeswelledandmalformed,withthinnercellwall,disappearanceofcellmembrane,cytoplasmexudation,andintracellularcavitystructure.Somehyphaeshriveled,twistedandthinned,andperforatedinseverecases.Somehyphaecellswereseverelyvesiculatedandorganelledistributionwasuneven.Insomecells,thenumberofliposomesincreasedobviously.[Conclusion]ThefermentationfiltrateofB.velenzensisGDND-2inhibitedthegrowthanddevelopmentofF.oxysporum,includingconidialgermination,hyphalgrowth,andsporulation.Keywords:BacillusvelenzensisGDND-2;Fusariumoxysporum;growthanddevelopment;ultrastructure鐮孢(Fusarium)根腐病在世界煙區(qū)普遍發(fā)生，鐮孢既可單獨(dú)侵染，又可與黑脛病菌、青枯病菌、根結(jié)線蟲等混合侵染，造成煙葉大幅減產(chǎn)甚至絕收，成為嚴(yán)重危害煙草的根莖病害之一[1]。20世紀(jì)80?90年代，該病為美國康涅狄格和馬薩諸塞州闊葉雪茄煙上最具破壞性的病害，近20%煙田受到侵染[2]。此外，在希臘[3]、西班牙[4]、馬來西亞[5]等國也有發(fā)生。1998年，TelE-mail:tongbao@;/wswxtbcn2878微生物學(xué)通報(bào)Micro桑維鈞等首次報(bào)道貴州省煙草鐮孢根腐病的危害[6]，此后該病在云南省[7]、福建省[8]、山東省[9]、湖北省[10]、安徽省[11]、河南省[12]等地均普遍發(fā)生。2013年河南平頂山煙區(qū)根腐病發(fā)病率在5%?10%，造成3000萬元的經(jīng)濟(jì)損失[13]。引起煙草根腐病的鐮孢種類較多，貴州省為尖孢鐮孢(Fusariumoxysporium)和茄病鐮孢(Fusariumsolani)[6]。湖北省、云南省經(jīng)鑒定是尖孢鐮孢[1,10]。福建省煙區(qū)為尖孢鐮孢、茄病鐮孢和半裸鐮孢(Fusariumsemitectum)，其中尖孢鐮孢致病性最強(qiáng)，是優(yōu)勢病原種群[8]。美國報(bào)道的病原主要是尖孢鐮孢，并在病害發(fā)生流行、抗病育種、病害防治等方面做了大量的工作[2]。此外，我國還報(bào)道有共享鐮孢(Fusariumcommune)[14]、木賊鐮孢(Fusariumequiseti)[15]和層出鐮孢(Fusariumproliferatum)[15]等侵染煙草。綜合多地對(duì)煙草根腐病的研究，尖孢鐮孢是引起根腐病的優(yōu)勢種群。煙草鐮孢根腐病防治方法有抗病品種、化學(xué)防治和生物菌劑等?？共∑贩N是最經(jīng)濟(jì)有效的防治措施，但不同產(chǎn)區(qū)致病鐮孢種類不同，同一煙草品種在不同種植區(qū)的抗性表現(xiàn)不同，難以向其他產(chǎn)區(qū)推廣應(yīng)用，篩選適宜本地?zé)焻^(qū)的主栽抗性品種還任重道遠(yuǎn)[16]。化學(xué)藥劑是控制該病的主要方法。精甲·噁霉靈在有效用量范圍內(nèi)防效為78.17%?82.94%[17]。62.5g/L精甲·咯菌腈懸浮種衣劑在處理后46d相對(duì)防效達(dá)72.69%[18]。但因鐮孢根腐病為土傳病害，化學(xué)農(nóng)藥防治效果不理想，使生防菌的篩選成為研究熱點(diǎn)。對(duì)煙草鐮孢根腐病生防菌劑的研究相對(duì)較少，棘孢木霉(Trichodermaasperellum)Tr-0111對(duì)尖孢鐮孢的抑制率達(dá)93.13%，木霉發(fā)酵液使煙草種子萌發(fā)率提高5.34%，煙苗根長增長62.39%[19]。特基拉芽孢桿菌(Bacillusteqyilensis)KC121對(duì)煙草擬枝鐮孢(Fusariumsporotrichioodes)的抑制效果達(dá)82.66%，對(duì)腐皮鐮孢的抑菌率達(dá)76.9%，其發(fā)酵液對(duì)擬枝鐮孢和腐皮鐮孢的抑菌率分別為84.76%和60.85%[20]。陳長卿等應(yīng)用4種芽孢桿菌類生物殺菌劑進(jìn)行試驗(yàn)，田間防效達(dá)42.97%?70.19%，且對(duì)煙草根、莖、葉均有不同程度的促進(jìn)作用[17]。劉暢等將假單胞菌(Pseudomonassp.)與綠色木霉(Trichodermaharzianum)制成復(fù)合菌劑，均能降低煙田根莖病害發(fā)病率和病情指數(shù)，改善煙株農(nóng)藝性狀[21]。但在煙草鐮孢根腐病生防菌劑的研究方面存在以下問題：(1)為節(jié)省時(shí)間，研究者多將現(xiàn)有的生防菌劑引入進(jìn)行防病試驗(yàn)，防治效果不理想；(2)直接針對(duì)煙草鐮孢根腐病篩選的生防菌資源貯備較少，研究過程中，一旦生防菌性狀較差，難以繼續(xù)開展研究。然而美國有4株芽孢桿菌生防菌株獲得環(huán)保局(U.S.EnvironmentalProtectionAgency)商品化或有限商品化生產(chǎn)應(yīng)用許可，分別是GB03、MBI600、QST713和Bacillusvar.amyloliquefaciensFZB24，其中，GB03、MBI600和FZB24都可用于防治尖孢鐮孢引起的枯萎或根腐病[22]。截至2022年6月，中國農(nóng)藥信息網(wǎng)尚無防治煙草鐮孢根腐病的生防藥劑登記。因此需要針對(duì)煙草鐮孢根腐病開展生防菌篩選，貯備菌種資源，并對(duì)生防菌防病機(jī)制進(jìn)行深入研究。尖孢鐮孢為煙草根腐病的優(yōu)勢致病菌，貝萊斯芽孢桿菌(Bacillusvelenzensis)GDND-2對(duì)煙草根腐病菌有明顯抑制作用。因?yàn)樨惾R斯芽孢桿菌易于分離和培養(yǎng)，生長快，抗逆性強(qiáng)，代謝產(chǎn)物豐富，對(duì)人和動(dòng)物安全無毒，具有豐富的次級(jí)代謝產(chǎn)物，所以它是理想的生防菌源，成為近年來的研究熱點(diǎn)[23]，研究論文、專利申請(qǐng)、產(chǎn)品開發(fā)等呈暴發(fā)式增長[24]。本文研究貝TelE-mail:tongbao@;/wswxtbcn沈會(huì)芳等:貝萊斯芽孢桿菌GDND-2對(duì)煙草鐮孢根腐病菌生長發(fā)育的影響萊斯芽孢桿菌GDND-2對(duì)尖孢鐮孢生長發(fā)育的影響，以期為揭示該生防菌株的防病機(jī)制提供依據(jù)。1.1.1菌株菌株GDND-2分離自廣東梅州五華煙草根圍土壤，鑒定為貝萊斯芽孢桿菌(B.velenzensis)，保存于廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所。尖孢鐮孢(F.oxysporium)分離自廣東省韶關(guān)始興煙草根腐病株，經(jīng)致病性測定和病原菌鑒定為尖孢鐮孢，保存于廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所。1.1.2培養(yǎng)基馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)和培養(yǎng)液(PDB)，青島海博生物技術(shù)有限公司，用于尖孢鐮孢的培養(yǎng)；LB培養(yǎng)基，用于生防菌的發(fā)酵；水瓊脂1.1.3主要試劑和儀器蛋白胨和酵母提取物，生工生物工程(上海)股份有限公司；生化培養(yǎng)箱和恒溫培養(yǎng)振蕩器，上海智城分析儀器制造有限公司；熒光正置顯微鏡，蔡氏公司；掃描電子顯微鏡和透射電子顯微鏡，日立公司。1.2菌株GDND-2發(fā)酵濾液的制備將100μLGDND-2菌液(108CFU/mL)接種于LB培養(yǎng)基中，于32℃、150r/min發(fā)酵培養(yǎng)36h后，15000r/min離心5min收集上清液，用0.2μm的微孔濾膜過濾除菌，保留發(fā)酵濾液，?20℃保存?zhèn)溆谩?.3菌株GDND-2發(fā)酵濾液對(duì)尖孢鐮孢生長發(fā)育的影響將GDND-2發(fā)酵濾液加入PDA(45℃)中，使濾液含量為10%和20%，吸取2mL涂在玻片上，凝固后滴50μL尖孢鐮孢孢子懸浮液(106個(gè)/mL)，涂抹均勻。以加等量LB培養(yǎng)基為每處理5片玻片，3次重復(fù)。每隔2h鏡檢孢子萌發(fā)、菌絲生長、孢子形成和色素產(chǎn)生情況。1.4菌株GDND-2發(fā)酵濾液對(duì)尖孢鐮孢分生孢子萌發(fā)的影響制備含10%和20%GDND-2發(fā)酵濾液的水瓊脂，吸取2mL涂在玻片上，凝尖孢鐮孢孢子懸浮液(106個(gè)/mL)，涂抹均勻。以重復(fù)。玻片放入培養(yǎng)皿，26℃黑暗保濕培養(yǎng)，培養(yǎng)8h，每個(gè)玻片隨機(jī)統(tǒng)計(jì)100個(gè)孢子萌發(fā)情況，計(jì)算萌發(fā)率。1.5菌株GDND-2發(fā)酵濾液對(duì)尖孢鐮孢菌體生長量和孢子形成量的影響制備含10%和20%GDND-2發(fā)酵濾液的PDA(45℃)，倒入平皿，接入尖孢鐮孢菌餅(直徑6mm)，以加等量LB培養(yǎng)基為對(duì)照，每處理字交叉測量菌落直徑，計(jì)算各處理的菌絲生長速率及抑制率。菌絲生長速率=(處理菌落直徑–菌餅直徑)/培養(yǎng)菌絲生長抑制率(%)=(對(duì)照菌絲生長速率–處理菌絲生長速率)/(對(duì)照菌絲生長速率)×100。制備含10%和20%GDND-2發(fā)酵濾液的PDB培養(yǎng)液，每瓶100mL，接入100μL尖孢鐮孢孢子懸浮液(106個(gè)/mL)，以加等量LB培養(yǎng)液為對(duì)照，每處理5瓶，3次重復(fù)，于26℃、150r/min培養(yǎng)4d，過濾保留菌體，無菌水沖洗3次，60℃烘干，稱重。菌體生長量=處理菌體干重/培養(yǎng)天數(shù)；菌體生長量抑制率(%)=(對(duì)照菌體生長量?處理菌體生長量)/對(duì)照菌體生長量×100。TelE-mail:tongbao@;/wswxtbcn2880微生物學(xué)通報(bào)Micro制備含10%和20%GDND-2發(fā)酵濾液的PDA(45℃)，倒入平皿，接入尖孢鐮孢菌餅(直徑6mm)，以加等量LB培養(yǎng)基為對(duì)照，每處理皿加10mL無菌水，刮掉孢子，鏡檢孢子量。產(chǎn)孢量抑制率(%)=(對(duì)照孢子量?處理孢子量)/(對(duì)照孢子量)×100。1.6菌株GDND-2發(fā)酵濾液對(duì)尖孢鐮孢菌體外部形態(tài)的影響制備含10%和20%GDND-2發(fā)酵濾液的PDA平板，接入尖孢鐮孢菌餅，26℃黑暗培養(yǎng)4d，切取2mm×2mm菌塊，用2.5%戊二醛加多聚甲醛溶液在4℃冰箱固定3h，PBS沖洗樣品3次，依次30min。用1%鋨酸固定3h，PBS沖洗3次。依次30min用30%、50%、70%、90%、95%、100%、100%、100%酒精梯度脫水，每梯度處理20min。乙酸異戊酯置換20min。臨界點(diǎn)干燥，真空噴金。樣本置于掃描電鏡下觀察。1.7菌株GDND-2發(fā)酵濾液對(duì)尖孢鐮孢菌體內(nèi)部形態(tài)的影響制備含10%和20%GDND-2發(fā)酵濾液的PDA平板，接入尖孢鐮孢菌餅，26℃黑暗培養(yǎng)4d，切取2mm×2mm菌塊，用2.5%戊二醛溶液在4℃冰箱固定3h，PBS沖洗樣品3次，每次30min。用1%鋨酸固定3h，PBS沖洗3次，100%、100%、100%酒精梯度脫水，每梯度處理20min。用環(huán)氧丙烷逐步置換，環(huán)氧丙烷與酒精比為1:3、2:2、3:1、100%、100%、100%，每梯度處理20min。用樹脂浸透后包埋，超薄切片，醋酸鈾和檸檬酸鉛雙染色。樣本置于透射電鏡下觀察。1.8數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析采用DPS軟件處理數(shù)據(jù)，對(duì)試驗(yàn)結(jié)果用鄧肯氏新復(fù)極差多重比較法(Duncan’smuitiplerangetest,DMRT)進(jìn)行差異顯著性分析。2結(jié)果與分析2.1GDND-2發(fā)酵濾液對(duì)尖孢鐮孢分生孢子萌發(fā)和芽管形態(tài)的影響在水瓊脂培養(yǎng)基上，正常尖孢鐮孢孢子培養(yǎng)2?4h逐漸萌發(fā)，用10%和20%GDND-2發(fā)酵濾液處理的孢子推遲至4?6h逐漸萌發(fā)。培養(yǎng)8h時(shí)，發(fā)酵濾液處理的孢子萌發(fā)率均在95%以上，與對(duì)照差異不顯著(表1)。因此在試驗(yàn)濃度范圍內(nèi)，GDND-2發(fā)酵濾液對(duì)孢子萌發(fā)率影響不大。在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)4h，對(duì)照孢子萌發(fā)產(chǎn)生正常芽管(圖1A)。10%GDND-2發(fā)酵濾液處理的孢子也萌發(fā)產(chǎn)生芽管，但芽管出現(xiàn)明顯膨大現(xiàn)象，嚴(yán)重畸形(圖1B)；20%發(fā)酵濾液處理的孢子剛開始萌發(fā)，已可見芽管出現(xiàn)膨大現(xiàn)象(圖1C)。綜上可見，在試驗(yàn)濃度范圍內(nèi)，GDND-2發(fā)酵濾液延遲孢子萌發(fā)，但對(duì)孢子萌發(fā)率影響不大，同時(shí)影響芽管的形態(tài)，造成芽管的膨大畸形。表1菌株GDND-2發(fā)酵濾液對(duì)尖孢鐮孢分生孢子萌發(fā)的抑制作用Table1InhibitionoffermentationfiltrateofBacillusvelenzensisGDND-2onconidialgerminationofFusariumoxysporumfromtobaccoTreatmentConidialgerminationrate(%)Inhibitionrateofconidialgermination(%)10%fermentationfiltrate96.20±1.47a20%fermentationfiltrate95.00±1.41a2.46Control97.40±0.80a表中數(shù)據(jù)為平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差，同列數(shù)據(jù)后不同小寫字母表示5%水平上差異顯著.下同Dataaremean±SD,valuesinthesamecolumnfollowedbydifferentsmalllettersaresignificantlydifferentat0.05level.Thesamebelow.TelE-mail:tongbao@;/wswxtbcn沈會(huì)芳等:貝萊斯芽孢桿菌GDND-2對(duì)煙草鐮孢根腐病菌生長發(fā)育的影響圖1菌株GDND-2發(fā)酵濾液對(duì)尖孢鐮孢芽管形態(tài)的影響A：對(duì)照.B：10%發(fā)酵濾液處理.C：20%發(fā)酵濾液處理Figure1EffectsofthefermentationfiltrateofBacillusvelenzensisGDND-2ongermtubemorphologyofFusariumoxysporumfromtobacco.A:Control.B:10%fermentationfiltratetreatment.C:20%fermentationfiltratetreatment.2.2菌株GDND-2發(fā)酵濾液對(duì)尖孢鐮孢菌絲生長和形態(tài)的影響在PDA上培養(yǎng)8h，對(duì)照芽管已延長為細(xì)長的菌絲，菌絲直，粗細(xì)均勻，產(chǎn)生少量分枝(圖2A)，濾液處理的芽管也形成菌絲，但菌絲未有效延伸，產(chǎn)生較多分枝，大量菌絲膨大畸形(圖2B、2C)。培養(yǎng)16h，對(duì)照菌絲繼續(xù)生長延伸，并交織在一起，形成菌絲體(圖2D)，濾液處理的菌絲延長，在菌絲上形成大量畸形的球狀膨大，連成一串，呈捻珠狀，膨大處多中空，部分菌絲表現(xiàn)出粗細(xì)不均現(xiàn)象(圖2E、2F)；培養(yǎng)20h，對(duì)照菌絲正常生長，菌落更加濃密且有分生孢子梗產(chǎn)生(圖2G)，濾液處理的菌體交織成菌絲體，菌絲體內(nèi)可見大量球狀膨大發(fā)酵濾液可使尖孢鐮孢菌絲明顯畸形，抑制菌體正常發(fā)育。在含GDND-2發(fā)酵濾液的PDA培養(yǎng)基上，10%和20%發(fā)酵濾液顯著抑制尖孢鐮孢菌絲生長，對(duì)菌絲生長抑制率達(dá)53.41%和61.58%(圖3)。檢測各處理菌體生長量，10%和20%發(fā)酵濾液對(duì)菌體干重的抑制率僅為23.49%和30.46%(表2)。結(jié)果表明，發(fā)酵濾液對(duì)菌體生長量的抑制效果比對(duì)菌絲生長速率的抑制效果差。由圖3可見，GDND-2發(fā)酵濾液明顯抑制菌絲直徑，但與對(duì)照相比，濾液處理的菌落更致密、濃厚，因而菌體生長量下降較少。綜上，在試驗(yàn)濃度范圍內(nèi)，GDND-2發(fā)酵濾液造成菌絲球狀膨大、嚴(yán)重畸形，無法正常延伸，對(duì)菌絲生長的抑制效果明顯，同時(shí)發(fā)酵濾液促使菌絲產(chǎn)生分枝，分枝短而多，表現(xiàn)為菌落致密而濃厚，菌體量即菌絲干重下降相對(duì)較少。2.3菌株GDND-2發(fā)酵濾液對(duì)尖孢鐮孢分生孢子形成及孢子活力的影響正常尖孢鐮孢在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)20h產(chǎn)生大量產(chǎn)孢梗并開始產(chǎn)孢，培養(yǎng)24h有大量孢子形成(圖4A)。10%GDND-2發(fā)酵濾液處理后，培養(yǎng)40h見菌絲體有少量孢子，培養(yǎng)44h孢子量明顯增加(圖4B)。20%發(fā)酵濾液處理后，在培養(yǎng)48h時(shí)才觀察到菌絲體產(chǎn)生極少量孢子，隨著培養(yǎng)時(shí)間延長，未見孢子量明顯增加(圖4C)。TelE-mail:tongbao@;/wswxtbcn2882微生物學(xué)通報(bào)MicroFigure2EffectsofthefermentationfiltrateofBacillusvelenzensisGDND-2onhyphalgrowthandmorphologyofFusariumoxysporumfromtobacco.A?C:Culturefor8h.D?F:Culturefor16h.G?I:Culturefor20h.A,D,G:Control.B,E,H:10%fermentationfiltratetreatment.C,F,I:20%fermentationfiltratetreatment.圖3菌株GDND-2發(fā)酵濾液對(duì)尖孢鐮孢菌絲生長的抑制效果圖Figure3InhibitioneffectoffermentationfiltrateofBacillusvelenzensisGDND-2onhyphalgrowthofFusariumoxysporumfromtobacco.TelE-mail:tongbao@;/wswxtbcn沈會(huì)芳等:貝萊斯芽孢桿菌GDND-2對(duì)煙草鐮孢根腐病菌生長發(fā)育的影響表2菌株GDND-2發(fā)酵濾液對(duì)尖孢鐮孢菌體生長的抑制作用Table2InhibitionoffermentationfiltrateofBacillusvelenzensisGDND-2onhyphalgrowthofFusariumoxysporumfromtobaccoTreatmentHyphaldiameterHyphaldryweightGrowthspeed(mm/d)Inhibitionrate(%)Increasespeed(mg/d)Inhibitionrate(%)10%fermentationfiltrate53.41140.90±5.14b23.4920%fermentationfiltrate7.05±0.10c61.58128.05±5.91c30.46Control18.35±0.20a184.15±8.56a圖4菌株GDND-2發(fā)酵濾液對(duì)尖孢鐮孢分生孢子形成的影響A：對(duì)照，培養(yǎng)24h.B：10%發(fā)酵濾Figure4EffectsoffermentationfiltrateofBacillusvelenzensisGDND-2onconidialformationofFusariumoxysporumfromtobacco.A:Control,culturefor24h.B:10%fermentationfiltratetreatment,culturefor44h.C:20%fermentationfiltratetreatment,culturefor48h.制備含GDND-2發(fā)酵濾液的PDA培養(yǎng)基，接種尖孢鐮孢，培養(yǎng)4d后檢測產(chǎn)孢量，結(jié)果見表3，GDND-2發(fā)酵濾液處理病菌可顯著降低產(chǎn)孢量，10%和20%發(fā)酵濾液處理后對(duì)產(chǎn)孢量的抑制率達(dá)52.11%和78.85%。顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)發(fā)酵濾液處理可影響尖孢鐮孢分生孢子的形態(tài)(圖5)。對(duì)照產(chǎn)生的孢子以1?4個(gè)隔膜的大型分生孢子為主，平均長度為30.03μm。10%和20%發(fā)酵濾液處理后，孢子多為0?1個(gè)隔膜的小型分生孢子，平均長度為12.85μm和12.45μm，與對(duì)照差異明顯(表3)。將處理后尖孢鐮孢所產(chǎn)生的孢子制成懸浮分生孢子萌發(fā)率均在95.80%以上，與對(duì)照差異不顯著。將懸浮液涂在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)，孢子萌發(fā)后的芽管和菌絲形態(tài)均未出現(xiàn)膨大等畸形變異。綜上所述，GDND-2發(fā)酵濾液處理可延遲尖孢鐮孢產(chǎn)孢，顯著抑制產(chǎn)孢量，影響病菌所產(chǎn)生孢子形態(tài)，主要形成小型分生孢子，但小型分生孢子的萌發(fā)及生長發(fā)育無異常。2.4GDND-2發(fā)酵濾液對(duì)尖孢鐮孢產(chǎn)素的在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)24h，對(duì)照尖孢鐮孢菌絲生長良好，白色，基物無色素；10%GDND-2發(fā)酵濾液處理后菌絲青灰色，基物無色素；20%發(fā)酵濾液處理后，部分菌絲灰色，基物內(nèi)出現(xiàn)磚紅色色素(圖6A)。培養(yǎng)48h，對(duì)照菌絲白色，基物無色素；發(fā)酵濾液處理的菌絲轉(zhuǎn)為白色，基物磚紅色(圖6B)。培養(yǎng)72h，發(fā)酵濾液處理TelE-mail:tongbao@;/wswxtbcn2884微生物學(xué)通報(bào)Micro表3菌株GDND-2發(fā)酵濾液對(duì)尖孢鐮孢分生孢子形成及孢子活力的抑制作用Table3InhibitionoffermentationfiltrateofBacillusvelenzensisGDND-2onconidialformationandactivityofFusariumoxysporumfromtobaccoofconidialInhibitionrateof20%fermentationfiltr圖5菌株GDND-2發(fā)酵濾液對(duì)尖孢鐮孢分生孢子形態(tài)的影響A：對(duì)照.B：10%發(fā)酵濾液處理.C：20%發(fā)酵濾液處理Figure5EffectoffermentationfiltrateofBacillusvelenzensisGDND-2onconidialmorphologyofFusariumoxysporumfromtobacco.A:Control.B:10%fermen圖6菌株GDND-2發(fā)酵濾液對(duì)尖孢鐮孢產(chǎn)素的影響A：培養(yǎng)24h.B：培養(yǎng)48h.C：培養(yǎng)72hFigure6EffectoffermentationfiltrateofBacillusvelenzensisGDND-2onpigmentproductionofFusariumoxysporumfromtobacco.A:Culturefor24h.B:Culturefor48h.C:Culturefor72h.的菌落基物色素進(jìn)一步加深，對(duì)照仍無色素產(chǎn)生(圖6C)。因此，GDND-2發(fā)酵濾液促進(jìn)尖孢鐮孢色素的產(chǎn)生。2.5掃描電鏡觀察GDND-2發(fā)酵濾液對(duì)尖孢鐮孢菌體外部形態(tài)的影響正常尖孢鐮孢菌絲體圓潤、飽滿，粗細(xì)基本均勻(圖7A中a)，少量菌絲有輕微褶皺和溢縮(圖7A中b)。GDND-2發(fā)酵濾液處理后菌絲出現(xiàn)明顯縊縮現(xiàn)象(圖7B中c)，部分菌絲明顯膨大，如球狀(圖7C中d)，膨大后表現(xiàn)萎蔫、疲軟、皺TelE-mail:tongbao@;/wswxtbcn沈會(huì)芳等:貝萊斯芽孢桿菌GDND-2對(duì)煙草鐮孢根腐病菌生長發(fā)育的影響圖7菌株GDND-2對(duì)尖孢鐮孢菌體外部形態(tài)的影響A：對(duì)照.B?D：10%發(fā)酵濾液處理.E、F：20%發(fā)酵濾液處理Figure7EffectsofBacillusvelenzensisGDND-2onmycelialexternalmorphologyofFusafromtobacco.A:Control.B?D:10%fermentationfiltrat細(xì)胞也表現(xiàn)為皺縮、扭曲(圖7E中g(shù))。20%發(fā)酵濾液處理后部分菌絲出現(xiàn)穿孔現(xiàn)象(圖7F中h)。2.6透射電鏡觀察GDND-2發(fā)酵濾液對(duì)尖孢鐮孢菌體內(nèi)部形態(tài)的影響正常尖孢鐮孢菌絲直徑在25μm左右，菌絲體細(xì)胞壁、細(xì)胞膜、線粒體、細(xì)胞質(zhì)等超微結(jié)構(gòu)清晰，分布均勻(圖8A)。菌株GDND-2發(fā)酵濾液處理后部分細(xì)胞膨大呈圓球狀，直徑達(dá)200μm以上，細(xì)胞壁變薄，細(xì)胞膜消失，細(xì)胞器分布于靠近細(xì)胞壁的邊緣部位，幾乎未見細(xì)TelE-mail:tongbao@;/wswxtbcn2886微生物學(xué)通報(bào)Micro圖8菌株GDND-2對(duì)尖孢鐮孢菌體內(nèi)部形態(tài)的影響A：對(duì)照.B、C：10%發(fā)酵濾液處理.D：20%Figure8EffectsofBacillusvelenzensisGDND-2onmycelialinternalmorphologyofFusariumoxysporum.A:Control.B,C:10%fermentationfiltratetreatment.D:20%fermentationfiltratetreatment.cw:Cellwall;m:Mitochondria;v:Vesicle;l:Liposomes.胞質(zhì)基質(zhì)，菌絲內(nèi)呈空腔結(jié)構(gòu)(圖8B)；部分細(xì)胞出現(xiàn)大面積囊泡，擠壓其他細(xì)胞器，使胞內(nèi)空腔部分明顯增加，細(xì)胞器分布不均勻(圖8C)；部分菌絲細(xì)胞內(nèi)形成大量脂質(zhì)體，數(shù)量比正常菌絲明顯增加(圖8D)。3討論與結(jié)論生防菌常抑制尖孢鐮孢的孢子萌發(fā)、菌絲生長及對(duì)菌絲有致畸效果。芽孢桿菌(Bacillussp.)CYY-6和CYY-42發(fā)酵液可致尖孢鐮孢菌絲扭曲、斷裂、破碎[25]。貝萊斯芽孢桿菌3A3-15的次生代謝物致尖孢鐮孢菌絲扭曲、畸形，抑制孢子萌發(fā)作用較強(qiáng)，抑制率達(dá)93.2%[26]。短芽孢桿菌(Brevibacillusbrevis)ZJY-1顯著抑制尖孢鐮孢孢子萌發(fā)和芽管伸長，使菌絲變得細(xì)弱、枯萎、褶皺[27]。貝萊斯芽孢桿菌GDND-2發(fā)酵濾液同樣可延遲尖孢鐮孢孢子萌發(fā)，造成芽管膨大畸形，可使菌絲產(chǎn)生畸形的球狀結(jié)構(gòu)，促進(jìn)菌絲產(chǎn)生分枝，抑制菌絲延伸。但GDND-2發(fā)酵濾液還可顯著抑制尖孢鐮孢產(chǎn)孢量，20%TelE-mail:tongbao@;/wswxtbcn沈會(huì)芳等:貝萊斯芽孢桿菌GDND-2對(duì)煙草鐮孢根腐病菌生長發(fā)育的影響發(fā)酵濾液抑制產(chǎn)孢量達(dá)78.85%，可大幅度降低病菌基數(shù)，同時(shí)改變病菌產(chǎn)生孢子的形態(tài)，刺激病菌產(chǎn)生色素，這在生防菌抑菌機(jī)理研究上很少報(bào)道。促分裂素原活化蛋白激酶(mitogen-activatedproteinkinase,MAPK)途徑主要控制細(xì)胞延伸，環(huán)腺苷酸單磷酸-蛋白激酶A(cyclicadenosinemonophosphate-proteinkinaseA,cAMP-PKA)途徑主要控制孢子形成，尖孢鐮孢的侵染性則由兩者雙重控制[28-29]。GDND-2促使尖孢鐮孢菌絲提早分枝，抑制菌絲延伸，顯著抑制產(chǎn)孢量，推斷GDND-2通過影響cAMP-PKA途徑和MAPK途徑降低尖孢鐮孢的侵染性。同時(shí)，GDND-2也影響病菌的孢子形態(tài)，處理后病菌由正常產(chǎn)生大型孢子為主變?yōu)楫a(chǎn)小型孢子為主?，F(xiàn)有報(bào)道基因folczf1[30]、folvam7[31]對(duì)尖孢鐮孢分生孢子的形態(tài)有調(diào)控作用，folstua[32]、foswi6[33]、folssol[34]、folprp4[35]調(diào)控其產(chǎn)孢量。foplc4對(duì)尖孢鐮孢的產(chǎn)孢類型和產(chǎn)孢量均有調(diào)控作用，對(duì)尖孢鐮孢黃瓜?；?Fusariumoxysporumf.sp.cucumerinum)研究發(fā)現(xiàn)，基因野生型菌株只產(chǎn)生小型孢子，而foplc4菌株可產(chǎn)生兩種類型的分生孢子，floplc4菌株的產(chǎn)孢量較野生型降低82.2%[36]。GDND-2處理后極可能影響了相關(guān)基因的表達(dá)，從而改變產(chǎn)孢量和孢子的形態(tài)，這有待進(jìn)一步研究。孔建等用枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)B-903處理后，尖孢鐮孢芽管頂端、菌絲末端及中央的多處細(xì)胞形成畸形的球狀結(jié)構(gòu)，隨著處理時(shí)間的延長，球狀結(jié)構(gòu)增加，連成一串，胞內(nèi)含物消失，變成空胞[37]。對(duì)比發(fā)現(xiàn)B-903和GDND-2對(duì)尖孢鐮孢的作用相似，推測GDND-2所產(chǎn)生的抑菌物質(zhì)與B-903活性物質(zhì)結(jié)構(gòu)相似。B-903所產(chǎn)的殺菌活性物質(zhì)為大分子多肽[38]，該物質(zhì)對(duì)多種植物病原真菌具有強(qiáng)抑制活性[39]，可為GDND-2抑菌活性物質(zhì)的研究提供參考。GDND-2發(fā)酵濾液可促使尖孢鐮孢產(chǎn)生磚紅色色素。鐮孢屬色素在功能上具有多樣性，部分色素具有抗菌、毒性功能、抗腫瘤活性等[40-41]。如禾谷鐮孢(Fusariumgraminearum)產(chǎn)生的色素具有抑菌功能，能夠抑制酵母生長[42]。輪狀鐮孢(Fusariumverticillioides)產(chǎn)生的色素與該菌的毒性有密切關(guān)系[43]。Medentsev等研究了多隔鐮孢(Fusariumdecemcellulare)、禾谷鐮孢和瓜類萎蔫鐮孢(Fusariumbulbigenum)產(chǎn)生萘醌類色素的條件，發(fā)現(xiàn)萘醌類色素具有抗菌活性，可對(duì)周圍競爭性菌類產(chǎn)生抑制和致毒作用，該色素合成是真菌抵御環(huán)境壓力的手段[40]。生防菌刺激尖孢鐮孢產(chǎn)生色素報(bào)道極少，GDND-2促使其產(chǎn)生的色素是否具有抗菌或毒性功能，無相關(guān)文獻(xiàn)可以參考，需要進(jìn)一步研究。劉群等報(bào)道鏈霉菌(Streptomycessp.)N2所產(chǎn)農(nóng)抗N2使橘青霉(Penicilliumcitrinum)細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)密度降低，細(xì)胞內(nèi)嚴(yán)重囊泡化，細(xì)胞質(zhì)出現(xiàn)無序排列，降低病菌細(xì)胞的活力[44]，同樣地，GDND-2發(fā)酵濾液也使尖孢鐮孢部分細(xì)胞囊泡化嚴(yán)重，內(nèi)部空腔面積增加，細(xì)胞器分布不均，但本研究還觀察到尖孢鐮孢部分細(xì)胞內(nèi)形成大量脂質(zhì)體。脂質(zhì)體主要功能是為菌體提供碳源和能量，李璇等報(bào)道37℃和40℃的高溫條件下，黃曲霉脂質(zhì)體數(shù)量的急劇增加可為高溫脅迫下的黃曲霉細(xì)胞提供更多的能量和儲(chǔ)能物質(zhì)，減輕高溫對(duì)黃曲霉生長帶來的傷害[45]。因此，推斷生防菌GDND-2發(fā)酵濾液處理后部分細(xì)胞脂質(zhì)體數(shù)量明顯增加，是病菌為抵御生防菌保護(hù)自身的一種方式。綜上所述，貝萊斯芽孢桿菌GDND-2發(fā)酵濾液造成尖孢鐮孢芽管膨大畸形，促使菌絲提TelE-mail:tongbao@;/wswxtbcn2888微生物學(xué)通報(bào)Micro早產(chǎn)生分枝，抑制菌絲延伸，引起菌絲扭曲、球狀膨大、畸形，顯著抑制菌絲生長，延遲病菌產(chǎn)生孢子，嚴(yán)重抑制產(chǎn)孢量，造成菌絲內(nèi)部空腔化、囊泡化，病菌形態(tài)的改變可能會(huì)影響病菌對(duì)寄主的侵染能力，降低病菌致病性。研究表明貝萊斯芽孢桿菌GDND-2發(fā)酵濾液能抑制尖孢鐮孢的整個(gè)生產(chǎn)發(fā)育過程，包括孢子萌發(fā)、菌絲生長、孢子形成并促使病菌產(chǎn)生色素。REFERENCES[1]蓋曉彤,代快,戶艷霞,王繼明,姜寧,盧燦華,夏振遠(yuǎn).云南省煙草鐮刀菌根腐病菌遺傳多樣性分析[J].中國煙草學(xué)報(bào),2022,28(5):113-120.GAIXT,DAIK,HUYX,WANGJM,JIANGN,LUCH,XIAZY.GeneticdiversityofFusariumoxysporumisolatescausingtobaccorootrotinYunnan[J].ActaTabacariaSinica,2022,28(5):113-120(inChinese).[2]LAMONDIAJA.Fusariumwiltoftobacco[J].CropProtection,2015,73:73-77.[3]TJAMOSSE,MARKAKISEA,ANTONIOUP,PAPLOMATASEJ.FirstrecordofFusariumwiltoftobaccoinGreeceimportedasseedborneinoculum[J].JournalofPhytopathology,2006,154(4):193-196.[4]ALVES-SANTOSFM,MARTíNEZ-BERMEJOD,RODRíGUEZ-MOLINAMC,DIEZJJ.Culturalcharacteristics,pathogenicityandgeneticdiversityofFusariumoxysporumisolatesfromtobaccofieldsinSpain[J].PhysiologicalandMolecularPlantPathology,2007,71(1/2/3):26-32.[5]BINJUSOHMN,ZINNBM,NAGAOH.VegetativecompatibilitygroupofFusariumsolanipathogenictotobaccoplantinpeninsularMalaysia[J].SongklanakarinJournalofScienceandTechnology(SJST),2013,35(6):615-621.[6]桑維鈞,祝明亮,吳興祿,鐘黔英,李永順.煙草鐮刀菌根腐病研究初報(bào)[J].山地農(nóng)業(yè)生物學(xué)報(bào),1998,17(3):140-141,145.SANGWJ,ZHUML,WUXL,ZHONGQY,LIYS.Apreliminaryreportoftobaccorootro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