一、實驗目的

1.學習紅薯過氧化物酶的制備方法。

2.掌握過氧化物酶的反應(yīng)原理及測定方法。

2023/7/20二、實驗原理

1、過氧化物酶（簡稱POD)簡介過氧化物酶廣泛存在于植物體中，是活性較高的一種酶。它與呼吸作用、光合作用及生長素的氧化等都有關(guān)系。在植物生長發(fā)育過程中它的活性不斷發(fā)生變化。一般老化組織中活性較高，幼嫩組織中活性較弱。這是因為過氧化物酶能使組織中所含的某些碳水化合物轉(zhuǎn)化成木質(zhì)素，增加木質(zhì)化程度，而且發(fā)現(xiàn)早衰減產(chǎn)的水稻根系中過氧化物酶的活性增加，所以過氧化物酶可作為組織老化的一種生理指標。此外，過氧化物同工酶在遺傳育種中的重要作用也正在受到重視。2023/7/202．酶活力測定(1)酶活力表示酶量的多少不能像一般物質(zhì)那樣，用重量(g)或體積(ml)。因為酶是一種生物催化劑。酶的存在和含量多少應(yīng)體現(xiàn)在催化能力大小，即用酶活力(活性)表示。酶活力（酶活性）指酶催化某一特定化學反應(yīng)的能力。催化能力強(大)，酶活力就高(大)，也表示酶量多。酶本身的重量不能說明酶的實際含量多少。同樣重量的酶，酶活力可以不同，活力高，價值就大。2023/7/20(2)酶促反應(yīng)速度酶活力具體用它所催化的某一化學反應(yīng)的反應(yīng)速度來表示，即在最適條件下(最適pH、最適T)酶催化的反應(yīng)速度愈快，酶活力就愈高。速度愈墁，酶的活力就愈低。所以測定酶的活力(實質(zhì)上就是酶的定量)測定就是測定酶促反應(yīng)的速度(用v表示)。酶促反應(yīng)速度可用單位時間內(nèi)、單位體積中底物的減少量或產(chǎn)物增加量來表示。單位：濃度/單位時間常用產(chǎn)物增加量表示，因為它從無到有，變化明顯。酶促反應(yīng)隨時間增加，產(chǎn)物增加。2023/7/20

若將產(chǎn)物濃度對反應(yīng)時間作圖得到酶促反應(yīng)的速度曲線。

Vmax時間產(chǎn)物的生成量斜率＝濃度/時間＝V2023/7/20從圖可知，反應(yīng)速度只在最初一段時間內(nèi)保持恒定，隨著反應(yīng)時間的延長，酶反應(yīng)速度逐漸下降。引起下降的原因很多，如底物濃度降低，產(chǎn)物濃度增加而加速了逆反應(yīng)的進行，產(chǎn)物對酶有抑制作用等。因此研究酶反應(yīng)速度以酶促反應(yīng)的初速度為準，即酶促反應(yīng)最初的一段時間，產(chǎn)物呈線性增加時的反應(yīng)速度。具體指酶促反應(yīng)速度曲線的斜率。即從原點對曲線作切線，求切線斜率(v)=濃度/時間2023/7/20由于產(chǎn)物從無到有，只要方法靈敏，可準確測定。測定產(chǎn)物增加量的方法很多：化學方法：滴定、比色、氣體測壓、電化學等。物理方法：UV吸收、熒光等。同位素方法等。2023/7/20(3)酶的活力單位表示酶活力大小，也就是酶量的大小的單位稱酶的活力單位(U)。國際單位(IU)定義：1個酶活力單位，是指在特定條件下，在1分鐘內(nèi)能轉(zhuǎn)化1微摩爾(μmol)底物的酶量，或是轉(zhuǎn)化1微摩爾底物中的有關(guān)基團的酶量。2023/7/203、測定原理過氧化物酶催化過氧化氫氧化酚類的反應(yīng)，產(chǎn)物為醌類化合物，此化合物進一步縮合或與其他分子縮合，產(chǎn)生顏色較深的化合物。本實驗以鄰甲氧基苯酚（即愈創(chuàng)木酚）為過氧化物酶的底物，在此酶存在下，H2O2可將鄰甲氧基苯酚氧化成紅棕色的4-鄰甲氧基苯酚，其反應(yīng)為：2023/7/20本實驗用紫外吸收法測定產(chǎn)物4－鄰甲氧基苯酚在470nm光吸收增加值表示產(chǎn)物增加量，劃出光吸收-時間的速度曲線，求出曲線的斜率，即酶促反應(yīng)初速度，再換算為酶活力。42023/7/2021345678002

4

68反應(yīng)時間

（分鐘）生成物光吸收0.400.300.200.102023/7/202.pH對酶促反應(yīng)速度的影響(1)影響酶促反應(yīng)速度的因素*底物濃度米氏公式*溫度*酶濃度*激活劑、抑制劑*pH2023/7/20(2)pH對酶促反應(yīng)速度的影響大多數(shù)酶的活力受其環(huán)境pH影響。這是因為pH影響底物分子和酶分子中一些基團的解離，這些基團的離子化狀態(tài)關(guān)系到底物與酶的結(jié)合、酶的專一性和酶活性中心的構(gòu)象。通常各種酶只有在一定pH范圍內(nèi)才具有活性，并在一定pH下，酶促反應(yīng)具有最大反應(yīng)速度，此pH稱最適pH，高于或低于此值反應(yīng)速度都下降。2023/7/20如將反應(yīng)速度對pH作曲線，典型的呈鐘罩形，但不同酶受pH影響是不同，所以會有不同形狀，有的只有鐘罩形的一半，有的則是一直線，即受pH影響不大。2023/7/20木瓜蛋白酶胃蛋白酶膽堿脂酶2023/7/20不同酶的最適pH也不同，如胃蛋白酶為pH1.5-2.5、胰蛋白酶為pH8。但應(yīng)注意最適pH不是特征常數(shù)，對于同一種酶，其最適pH因底物的種類、濃度及緩沖液成份不同而有差異，因此酶的最適pH并不是一個常數(shù)，只是在一定條件下才有意義。一般最適pH在6-8之間。由于酶活力受pH影響很大，因此在測定酶活力時，pH必須恒定，所以測活反應(yīng)最好在緩沖液體系中進行。2023/7/20本實驗測定三亇不同pH下過氧化物酶的時間－光吸收關(guān)系曲線，比較三亇不同pH(6.0,7.0,8.0)條件對過氧化物酶活力的影響。2023/7/20三、實驗操作1、過氧化物酶粗品液的制備①稱取紅薯材料1g，加少許石英砂及0.1mol/LpH=6.0磷酸緩沖液（2ml左右)，于研缽中研磨成勻漿。②再加入3ml磷酸緩沖液浸提20分鐘后，以6000r/min離心15分鐘。③傾出上清液并過濾，然后轉(zhuǎn)入10ml容量瓶定容，搖勻后，貯于冷處備用。2023/7/202、酶活力測定

(1)取1只比色杯洗凈控干，按以下步驟操作：用移液管吸取0.1mol/L反應(yīng)液(pH6.0)2.9mL加入比色杯中。放入紫外分光光度計比色杯架內(nèi)，按autozero，出現(xiàn)插入空白，按ok，儀器自動調(diào)零。調(diào)零完成后按start，出現(xiàn)插入樣品。(2)取出比色杯，1人加酶液(μL)，先加20μL，另1人同時按ok開始計時，加酶后蓋上硫酸紙，按緊混勻，30秒內(nèi)放入比色杯架內(nèi)，儀器每30秒自動記錄光吸收值A(chǔ)470nm。(3)按數(shù)據(jù)處理中的數(shù)據(jù)打印，顯示8個數(shù)據(jù)，記錄數(shù)據(jù)。2023/7/20(4)操作要點：*關(guān)鍵是酶稀釋的倍數(shù)和酶量多少要合適，使ΔA470nm在0.2~0.4/min，即第1個30秒A470nm在0.1-0.2。過低過高都應(yīng)增加或減少酶量重新做。*加酶后應(yīng)迅速搖勻，立即計算時間，2人要配合好，計時不能提前或推后，否則曲線不是從原點開始。*每次測定前務(wù)必洗凈比色杯，用去離子水沖洗5遍以上，保證不殘留上次的溶液，否則影響測定。2023/7/20四.數(shù)據(jù)處理1.用坐標紙作出時間–A470nm曲線，過原點在直線部分作切線，求斜率ΔA470nm/min00.511.522.533.544.55

時間/min

10.80.60.40.2A470nm2023/7/202.代入下式計算酶活力ΔA470nm/min·VPOD活力單位（μmol/min）=————————————ε·LΔA470nm/min·3mL=————————————26.6mL/μmolcm·cmΔA470nm×3=————————(μmol/min)26.6V反應(yīng)液體積(mL)ε產(chǎn)物4—鄰甲氧基苯酚的摩爾消光系數(shù)26.6L/mmol·cm即26.6mL/μmol·cm)L比色杯光徑(1cm)2023/7/20實驗三POD蛋白濃度測定和比活力計算

2023/7/20一.實驗目的1.學習Folin酚法（Lowry法）測定POD蛋白濃度的原理和方法2.掌握比活力計算方法2023/7/20二.實驗原理1．Folin酚法原理Folin酚試劑由兩種試劑組成：甲試劑：雙縮脲試劑尿素加熱至180℃左右，兩分子尿素縮合放出一分子氨，而形成雙縮脲。

2023/7/20NH2

╱NH2

C=O╱╲C=ONH2180℃╲NH+NH3↑╱NH2C=O╱╲C=ONH2╲NH22023/7/20雙縮脲在堿性溶液中與銅離子（酒石酸鉀鈉-CuSO4）絡(luò)合生成復雜的紫紅色化合物。蛋白質(zhì)分子中的肽鍵（—CO—NH—）與雙縮脲結(jié)構(gòu)相似，也有雙縮脲反應(yīng)，其顏色深淺與蛋白質(zhì)的含量成正比，因此所有蛋白質(zhì)或二肽以上的多肽都有雙縮脲反應(yīng)，可用作蛋白質(zhì)定性、定量分析。2023/7/20甲試劑實質(zhì)是利用蛋白質(zhì)中肽鍵反應(yīng)進行定量測定，它與蛋白質(zhì)分子量及氨基酸組成無關(guān)，即受蛋白質(zhì)氨基酸的特異性影響較少。但靈敏度較低，mg級水平，0~10mg/mL作標準曲線。2023/7/20乙試劑：主要起作用是磷鉬酸（磷鎢酸），它由鉬酸鈉（鎢酸鈉）在酸性（磷酸等）作用下產(chǎn)生。鉬酸鈉（鎢酸鈉）∣↓HCl

堿性

H3PO4+鉬酸（鎢酸）

磷鉬酸鉬蘭（鎢蘭）（磷鎢酸）還原劑

2023/7/20

H3PO4+12H2MoO4→H3Mo12PO40+12H2O

堿性↓還原劑

Mo2O3?MoO3

蘭色2023/7/20

Folin酚試劑最初由Folin等于1912年提出，當時只有乙試劑應(yīng)用于酚類測定，以后才用于蛋白質(zhì)測定。因為Tyr的酚基也能起還原劑作用，呈蘭色反應(yīng)，因而被利用于測定蛋白質(zhì)，產(chǎn)物顏色深淺與被測蛋白質(zhì)含量成正比關(guān)系，所以乙試劑作用是利用蛋白質(zhì)中Tyr、Try、Cys等具有還原性的氨基酸殘基的作用進行測定，靈敏度高，但是后來發(fā)現(xiàn)有些缺點，出現(xiàn)不少改良方法。2023/7/201951年Lowry（勞里）在Folin酚試劑中引入雙縮脲反應(yīng)（加入甲試劑）即成為如今廣泛被使用的Lowry法。為什么要作這樣改良？Folin酚試劑中只有乙試劑，依賴蛋白質(zhì)中Tyr、Trp等氨基酸殘基的反應(yīng)，而對于不同種類蛋白質(zhì)，由于它們之間的氨基酸組成不同，在呈色反應(yīng)中就會有差異，影響實驗準確度，即受蛋白質(zhì)特性影響較大，而雙縮脲試劑是利用肽鍵反應(yīng)，不受氨基酸組成的影響。2023/7/20引入雙縮脲試劑后，具有兩種試劑雙重作用，互相補充，結(jié)果大大增加了反應(yīng)的靈敏度和準確度。Lowry法較雙縮脲靈敏度提高100倍，較UV法靈敏10~20倍。Folin酚（Lowry）法，靈敏度高，操作簡單，迅速，不需要特殊儀器，常用作蛋白質(zhì)定量測定，文獻引用最多。2023/7/20方法靈敏度時間原理干擾物質(zhì)說明凱氏定氮法（Kjedahl法）靈敏度低，適用于0.2～1.0mg/ml氮，誤差為2％費時8～10小時蛋白質(zhì)（平均含氮量16％）經(jīng)過硫酸消化，強堿堿化，吸收并滴定，準確測定氮量非蛋白氮（可用三氯乙酸沉淀蛋白質(zhì)而分離）用于標準蛋白質(zhì)含量的準確測定；干擾少；費時太長雙縮脲法（Biuret法）靈敏度低310nm比色0.1～1.0mg/ml540nm比色1～10mg/ml中速20~30分鐘多肽鍵＋堿性Cu2＋紫色絡(luò)合物硫酸銨；Tris緩沖液；某些氨基酸用于快速測定，但不太靈敏；不同蛋白質(zhì)顯色相似紫外吸收法較為靈敏0.1～1.0mg/ml快速5～10分鐘蛋白質(zhì)中的酪氨酸和色氨酸殘基在280nm處的光吸收各種嘌吟和嘧啶；各種核苷酸用于層析柱流出液的檢測；核酸的吸收可以校正Folin－酚試劑法（Lowry法）靈敏度高0.03～5g慢速40～60分鐘雙縮脲反應(yīng)；磷鉬酸－磷鎢酸試劑被Tyr和Phe還原硫酸銨；Tris緩沖液；甘氨酸；各種硫醇耗費時間長；操作要嚴格計時；顏色深淺隨不同蛋白質(zhì)變化考馬斯亮藍法(Bradford法)靈敏度最高1～5g快速5～15分鐘考馬斯亮藍染料與蛋白質(zhì)結(jié)合時，其max由465nm變?yōu)?95nm強堿性緩沖液；TritonX-100;SDS最好的方法；干擾物質(zhì)少；顏色穩(wěn)定；顏色深淺隨不同蛋白質(zhì)變化2、蛋白質(zhì)的定量測定2023/7/203.比活力概念比較不同重量或不同蛋白含量的酶活力并無實際意義，不同酶或同一種酶在不同情況下的比較應(yīng)有一個重量標準，于是產(chǎn)生出另一個酶的重要參數(shù)——比活力。比活力指單位質(zhì)量的酶蛋白所具有的酶活力單位酶活力單位/mg酶蛋白(IU/mg酶蛋白)比活力是酶學研究及酶制劑生產(chǎn)制備中經(jīng)常使用的數(shù)據(jù)，用來比較單位重量酶蛋白的催化能力(即酶活力大小)。2023/7/20比活力實際意義可以說明酶的質(zhì)量好壞，純度高低。不同酶比較時，比活力高，說明其質(zhì)量好，純度高；對同一種酶，可以比較不同批次的質(zhì)量和純度。在酶的生產(chǎn)制備過程，考察比活力尤為重要，隨著該酶不斷被提純，它的比活力升高，說明酶逐步被純化，比如，粗制品總活力很高，蛋白質(zhì)含量也很高(雜蛋白多)，比活力低。純化后雖然總活力降低，但蛋白質(zhì)含量也因大量雜蛋白被除去而減少，使比活力升高。酶愈純，比活力愈高，比活力不再升高，酶就相當純了，因此比活力用以衡量生產(chǎn)工藝優(yōu)劣、生產(chǎn)效率高低。它是一個很有實際用途的參數(shù)，是經(jīng)常要測定的數(shù)據(jù)。2023/7/20三、操作步驟

每人取16支試管，按下表平行操作：12345678標準蛋白質(zhì)溶液/mL00.10.20.30.40.5——待測蛋白質(zhì)溶液/mL——————0.030.05dH2O/mL0.50.40.30.20.100.470.45甲試劑/mL2.52.52.52.52.52.52.52.5混勻，于室溫放置10min乙試劑/mL0.250.250.250.250.250.250.250.25迅速混勻，室溫放置30min后，以dH2O為空白，在640nm處比色

A640nm(1)A640nm(2)A640nm

2023/7/20*標準蛋白質(zhì)溶液為牛血清清蛋白(150μg/mL)。*侍測樣品x為POD酶原液，輕輕倒置搖勻后用注射器加50μL(0.050mL)，去離子水加0.450mL。

2023/7/202.注意事項：*定量測定要求各種試劑量取準確，正確規(guī)范使用移液管。*乙試劑在酸性條件下穩(wěn)定，而甲試劑在堿性條件下與蛋白質(zhì)反應(yīng)，生成堿性的銅-蛋白質(zhì)絡(luò)合物溶液，所以在加入乙試劑后，應(yīng)迅速搖勻(用振蕩器)，使還原反應(yīng)發(fā)生在磷鉬酸-磷鎢酸試劑被破壞之前。加一管搖一管，直接取0.25mL吹下，二人可合作，乙試劑比重大，一定要搖起來。*待測樣品所取體積應(yīng)使其濃度在標準曲線范圍內(nèi)。2023/7/20