蛋白質一級結構的測定方法一、蛋白質一級結構定義(primarystructure)

在每種蛋白質中氨基酸按照一定的數目和組成進行排列，并進一步折疊成特定的空間結構前者我們稱為蛋白質的一級結構，也叫初級結構或基本結構。核心：蛋白質中共價連接的氨基酸殘基的排列順序,包括二硫鍵的位置。意義：是理解蛋白質結構、作用機制以及與其同源蛋白質生理功能的必要基礎。2蛋白質一級結構的測定方法蛋白質序列測定的基本戰(zhàn)略和步驟一蛋白質序列測序的基本戰(zhàn)略1、直接法（測蛋白質的序列）對于一個純蛋白質，理想方法是從N端直接測至C端，但目前只能測60個N端氨基酸。

2、間接法（測核酸序列推斷氨基酸序列）蛋白質化學家收集的一個蛋白質資料庫（databaseordatabank）可以在AltasofProteinSequenceandStructure(Dayhoff,M.O.ed.1972-1978,Vols1-5,Washington,DC:NationalBiomedicalResearshFoundation)中找到。然而現在大多數蛋白質序列信息都是從基因核苷酸序列（經過密碼子）翻譯成氨基酸序列的。3蛋白質一級結構的測定方法

由于克隆核苷酸序列比測定核苷酸序列更快、更有效、信息更多，因此有不少電子數據庫問世，儲存的序列資料以驚人的速度不斷擴充，并且個人電腦可以方便利用。如果現在需要確定一個新蛋白質的序列，研究者所做的第一件事就是將新蛋白質的序列與數據庫中的其它已知序列進行比較，確定其中是否存在同源性。這些數據庫中比較有名的就是美國NationalBiomedicalResearshFoundation（國家生物醫(yī)學研究基金會）主持的PIR（ProteinInformationResource，蛋白質信息庫或ProteinIdentificationResouece蛋白質鑒定庫）,美國政府支持的GeneBank[GeneSequenceDataBank（基因序列數據庫）]，還有歐洲的EMBL（EuropeanMolecularBiologyLaboratory,歐洲分子生物學實驗室數據庫）。

4蛋白質一級結構的測定方法PDB(ProteinDataBank):蛋白質結構數據庫PDB原來有由美國Brookhaven國家實驗室負責維護和管理，為適應結構基因組和生物信息學研究的需要，1998年由美國國家科學基金委員會、能源部和衛(wèi)生研究院資助，成立結構生物學合作研究協(xié)會（ResearchCollaboratoryforStructureBioinformatics,RCSB）PDB由RCSB管理。PDB是目前最主要的蛋白質分子結構數據庫5蛋白質一級結構的測定方法二、蛋白質一級結構的測定方法研究蛋白質的一級結構從確定組成蛋白質的單元結構從氨基酸算起，已有150年的悠久歷史，直到1955年，Sanger首次闡明胰島素的氨基酸排列順序，為研究蛋白質的一級結構開辟了道路。這在分子生物學的發(fā)展進程中是一個重要突破。目前關于核酸的一級結構研究，由于Sanger等發(fā)明了加減法，可以得到了突飛猛進的發(fā)展。對比之下，關于蛋白質的一級結構研究進展不如核酸迅速。6蛋白質一級結構的測定方法但隨著Edman液相自動順序分析儀和固相順序分析儀以及氣相色譜、質譜(GCMS)等方法的相繼出現。使結構分析的速度也顯著加快。至今已完成近千種蛋白質的一級結構分析。目前不僅樣品用量減少，而且工作人員也大大減少。當年Sanger分析胰島素用了整整十年的時間，今天運用自動化儀器，分析一個分子量在10萬左右的蛋白質只需要幾天，可見新技術的應用和發(fā)展對科學發(fā)展起的促進作用，蛋白質一級結構測定方法的綜述及專著文獻較多。7蛋白質一級結構的測定方法三測定前的準備工作測序前的準備工作：

蛋白質的純度鑒定要求：純度97%以上，均一。鑒定方法：

⑴聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)要求一條帶，雙向電泳。

⑵DNS—Cl（二甲氨基萘磺酰氯）法測N端氨基酸。

(3)親和層析(4)western印跡法等測定蛋白質的分子量估算氨基酸殘基數，確定肽鏈數 方法：SDS，凝膠過濾法，沉降系數法8蛋白質一級結構的測定方法及測定的一般步驟

蛋白質分子的一級結構測定，概括起來包含多肽鏈的分離、降解、肽段的分離和順序分析以及－S－S－定位等。

9蛋白質一級結構的測定方法蛋白質測序的一般步驟（1）

測定蛋白質分子中多肽鏈的數目。（2）

拆分蛋白質分子中的多肽鏈。（3）

斷裂鏈內二硫鍵。（4）分析多肽鏈的N末端和C末端。（5）

測定多肽鏈的氨基酸組成。（6）

多肽鏈部分裂解成肽段。（7）

測定各個肽段的氨基酸順序（8）

確定肽段在多肽鏈中的順序。（9）

確定多肽鏈中二硫鍵的位置。10蛋白質一級結構的測定方法一級結構的測定方法

1.多肽鏈的分離1）肽鏈的拆開蛋白質分子多肽鏈的連接有共價結合和非共價結合兩種。要拆開以共價結合的-S-S-連接的多肽鏈，采用的化學處理方法有：

11蛋白質一級結構的測定方法①過甲酸氧化

12蛋白質一級結構的測定方法②巰基乙醇還原

13蛋白質一級結構的測定方法③Cleland‘s試劑的還原作用

14蛋白質一級結構的測定方法穩(wěn)定SH基的方法：

（A）烷基化試劑使SH基轉變?yōu)榉€(wěn)定的硫醚衍生物

15蛋白質一級結構的測定方法穩(wěn)定SH基的方法：

（B）氨乙基化

16蛋白質一級結構的測定方法非共價結合尿素，SDS，鹽酸胍，高濃度的鹽17蛋白質一級結構的測定方法2）末端分析

（1）N-末端測定A.二硝基氟苯法(FDNB，DNFB)18蛋白質一級結構的測定方法19蛋白質一級結構的測定方法（1）N-末端測定

B.氰酸鹽法

異硫氰酸苯酯（PTC或PITC）與N末端的α－氨基發(fā)生的反應，生成PTC－鈦,在弱酸中自發(fā)環(huán)化轉變成PTH－衍生物。該試劑稱為Edman試劑。

由于PTH－衍生物從多肽鏈上脫落下來對其余部分沒有影響，所以常用來測定蛋白質的一級結構。

20蛋白質一級結構的測定方法21蛋白質一級結構的測定方法（1）N-末端測定

C.二甲基氨基萘磺酰氯法

在堿性條件下，丹磺酰氯（二甲氨基萘磺酰氯DNS-Cl）可以與N-端氨基酸的游離氨基作用，得到丹磺酰-肽。此法的優(yōu)點是丹磺酰-氨基酸有很強的熒光性質，檢測靈敏度可以達到110-9mol。22蛋白質一級結構的測定方法23蛋白質一級結構的測定方法氨肽酶法氨肽酶是一種肽鏈外切酶，它能從多肽鏈的N-端逐個的向里水解。根據不同的反應時間測出酶水解所釋放出的氨基酸種類和數量，按反應時間和氨基酸殘基釋放量作動力學曲線，從而知道蛋白質的N-末端殘基順序。最常用的氨肽酶是亮氨酸氨肽酶，水解以亮氨酸殘基為N-末端的肽鍵速度最大。24蛋白質一級結構的測定方法2）末端分析

（2）C-末端分析A.肼解法

無水肼NH2NH2100℃5-10h。苯甲醛沉淀氨基酸的酰肼，C端游離氨基酸留在上清中。Gln（谷氨酰胺）、Asn（天冬酰胺）、Cys（半胱氨酸）、Arg（精氨酸）不能產生游離的羧基末端aa。25蛋白質一級結構的測定方法26蛋白質一級結構的測定方法（2）C-末端分析

B.羧肽酶水解法

羧肽酶可以專一性地水解羧基末端氨基酸。根據酶解的專一性不同，可區(qū)分為羧肽酶A、B和C。應用羧肽酶測定末端時，需要事先進行酶的動力學實驗，以便選擇合適的酶濃度及反應時間，使釋放出的氨基酸主要是C末端氨基酸。

27蛋白質一級結構的測定方法羧肽酶法測C末端羧肽酶法羧肽酶A：除Pro、Arg（精氨酸）、Lys（賴氨酸）外的所有C端氨基酸羧肽酶B：只水解Arg、Lys28蛋白質一級結構的測定方法C-末端分析

C.C-端氨基酸選擇性氚標記法：

使用氚標記是測定C-端氨基酸最好的辦法，專一性強，靈敏度高，但是這種方法不能用于C-端脯氨酸（Pro）和天冬氨酸（Asp）還原法：利用硼氫化鋰將C-端氨基酸還原成－氨基醇。然后堿多肽水解，用色譜法鑒定－氨基醇的類別。29蛋白質一級結構的測定方法酸水解常用6mol/L的鹽酸或4mol/L的硫酸（磺酸）在105-110℃條件下進行水解，反應時間約20小時。近年來用4mol/L的甲基磺酸代替鹽酸，效果比較好，被廣泛應用。此法的優(yōu)點是不容易引起水解產物的消旋化。缺點是色氨酸被沸酸完全破壞，含有羥基的氨基酸如絲氨酸或蘇氨酸有一小部分被分解；天門冬酰胺和谷氨酰胺側鏈的酰胺基被水解成了羧基。-COO+3）氨基酸組成分析30蛋白質一級結構的測定方法堿水解一般用5mol/L氫氧化鈉于真空或充氮條件下進行，1100C煮沸10-20小時。由于水解過程中許多氨基酸都受到不同程度的破壞，產率不高。部分的水解產物發(fā)生消旋化。該法的優(yōu)點是色氨酸在水解中不受破壞。31蛋白質一級結構的測定方法

酶法裂解胰蛋白酶

（賴氨酸）Lys——X（精氨酸）Arg——X(X≠Pro)胰凝乳蛋白酶（糜蛋白酶）

（酪氨酸）Tyr——X（色氨酸）Trp——X（苯丙氨酸）Phe——X(X≠Pro)嗜熱菌蛋白酶

X--Leu（亮氨酸）,Ile（異亮氨酸）,Phe（苯丙氨酸）,Trp（色氨酸），Val（纈氨酸）,Tyr（酪氨酸），Met（甲硫氨酸）胃蛋白酶Phe（苯丙氨酸），Trp（色氨酸）Tyr（酪氨酸），Leu（亮氨酸）——X不能水解Pro羧基參與形成的肽鍵。Glu蛋白酶

Glu（谷氨酸）——XArg蛋白酶Arg（精氨酸）——XLys蛋白酶X——Lys（賴氨酸）Pro蛋白酶Pro——X32蛋白質一級結構的測定方法

氨基酸的分離和含量測定氨基酸的顏色反應：紫色在570nm比色茚三酮與Pro生成黃色產物，在440nm比色33蛋白質一級結構的測定方法層析基于不同物質在流動相和固定相之間的分配系數不同而將混合組分分離的技術。當流動相(液體或氣體)流經固定相(多孔的固體或覆蓋在固體支持物上的液體)時，各組分沿固定相移動的速度不同而分離。能用于微量樣品的分析和大量樣品的純化制備。34蛋白質一級結構的測定方法氨基酸的分離

色譜法利用不同物質在不同相態(tài)的選擇性分配，以流動相對固定相中的混合物進行洗脫，混合物中不同的物質會以不同的速度沿固定相移動，最終達到分離的效果。色譜過程的本質是待分離物質分子在固定相和流動相之間分配平衡的過程，不同的物質在兩相之間的分配會不同，這使其隨流動相運動速度各不相同，隨著流動相的運動，混合物中的不同組分在固定相上相互分離。根據物質的分離機制，又可以分為吸附色譜、分配色譜、離子交換色譜、凝膠色譜、親和色譜等類別。

35蛋白質一級結構的測定方法①薄膜層析

將多肽鏈完全酸水解成游離氨基酸，然后進行Dansyl標記，聚酰胺薄膜層析，此方法在蛋白質結構分析中是一種超微量的分析術，但此方法用于定量分析尚不夠準確。

36蛋白質一級結構的測定方法②氨基酸自動分析儀就是利用離子交換的方法離子交換色譜法：利用離子交換原理和液相色譜技術的結合來測定溶液中陽離子和陰離子的一種分離分析方法，利用被分離組分與固定相之間發(fā)生離子交換的能力差異來實現分離。離子交換色譜主要是用來分離離子或可離解的化合物。它不僅廣泛地應用于無機離子的分離，而且廣泛地應用于有機和生物物質，如氨基酸、核酸、蛋白質等的分離。37蛋白質一級結構的測定方法氨基酸自動分析儀就是利用離子交換的方法

若要測定某蛋白質樣品的氨基酸組成，事先把樣品經酸水解，調節(jié)水解液的pH為3，使所有的氨基酸都帶負電荷，由于各種氨基酸側鏈基團的復雜性，各種氨基酸所帶的電荷強度差異比較大，pH3時,對于酸性氨基酸來說雖然也帶正電荷，但由于谷氨酸γ-羧基和天冬氨酸的β-羧基，都有不同程度的離解，導致整個分子偏中性，對于堿性氨基酸來說，本來結合質子的能力就很強，此時，它所帶的正點荷強度就更大。酸水解破壞了色氨酸、使谷酰胺和天冬酰胺轉變?yōu)橄鄳墓劝彼岷吞於彼帷榱朔蛛x效果好，在洗脫過程中，使用不同pH和離子強度的洗脫液。經氨基酸自動分析儀洗脫下來的氨基酸，按順序進行染色，由記錄儀自動描繪出各種氨基酸的光吸收圖譜。38蛋白質一級結構的測定方法3）氨基酸組成分析②離子交換層析法

39蛋白質一級結構的測定方法離子交換色譜利用被分離組分與固定相之間發(fā)生離子交換的能力差異來實現分離。離子交換色譜的固定相一般為離子交換樹脂，樹脂分子結構中存在許多可以電離的活性中心，待分離組分中的離子會與這些活性中心發(fā)生離子交換，形成離子交換平衡，從而在流動相與固定相之間形成分配。固定相的固有離子與待分離組分中的離子之間相互爭奪固定相中的離子交換中心，并隨著流動相的運動而運動，最終實現分離。40蛋白質一級結構的測定方法41蛋白質一級結構的測定方法各種氨基酸側鏈基團的性質對于氨基酸與離子交換樹脂，結合的情況有相當復雜的影響。在氨基酸自動分析儀的記錄上可以看出：天冬氨酸（pI為2.98）最先隨洗脫液下來，賴氨酸（pI為9.74）最后下來，三個中性氨基酸如:甘氨酸（pI為5.97）、蘇氨酸（pI為6.53）和亮氨酸（pI為5.98）洗脫的順序又如何呢?蘇氨酸應當帶有較多的正電荷，與樹脂結合比較緊，不易被洗脫下來，但是由于羥基具有極性，減弱了樹脂對氨基酸的吸引力。所以反而比甘氨酸和亮氨酸后被洗脫下來。甘氨酸和亮氨酸相比，亮氨酸側鏈疏水性強，與樹脂結合緊，后甘氨酸被洗脫下來。綜上所述：影響離子交換樹脂分離氨基酸的因素：（1）氨基酸分子所帶的電荷；（2）氨基酸分子的極性；（3）氨基酸分子的形狀和大小。42蛋白質一級結構的測定方法3特殊氨基酸的測定

巰基：—SH,Cys（半胱氨酸）特性：弱酸性pKa’=10.28；具有極強的還原性，兩個半胱氨酸的巰基靠近脫氫形成二硫鍵。pKa(電離程度)反應：①與鹵代烴，如：芐氧、碘乙酰胺，反應生成穩(wěn)定的烴基衍生物。該反應常用于對巰基的保護。②與各種金屬形成穩(wěn)定性不同的絡合物，該反應在研究蛋白質結構，制備蛋白質晶體過程中具有重要作用。③與某些重金屬生成不溶性的硫酸鹽，導致蛋白質失活。④與硝基苯甲酸二硫化合物（DTNB）反應，生成的產物在412nm處有強烈的光吸收，應用該反應可以用比色法測定半胱氨酸的含量。⑤在強氧化劑，如過氧甲酸的作用下，半胱氨酸的巰基和胱氨酸的二硫鍵都可被氧化生成磺基丙氨酸。43蛋白質一級結構的測定方法羥基：Ser（絲氨酸），

Thr（蘇氨酸），—OH

特性：在一般條件下，絲氨酸和蘇氨酸分子中的羥基都不解離。反應：①與酸作用生成酯，如絲氨酸磷酯，蛋白質的磷酸化絕大多數都發(fā)生在絲氨酸殘基上。②許多種?；瘎┠軌蚺c酶活性中心的絲氨酸羥基作用，導致酶失活。

③酪氨酸的酚基可與Folin反應的基礎，可作為蛋白質定量。為Millon反應的基礎。44蛋白質一級結構的測定方法咪唑基：His（組氨酸）,特性：在生理條件（pH7）下，組氨酸的咪唑基具有緩沖作用。這是因為咪唑基一側的去質子化和另一側的質子化作用同步進行。pH6時，50％質子化，pH7時，90％去質子化。也就是說，在生理條件（pH7）下，組氨酸的咪唑基既可以作為質子的受體，也可以作為質子的供體。因此組氨酸在酶催化作用中，起非常重要的作用。反應：Pauly反應（對氨基苯磺酸的重氮鹽，紅色產物）胍基：Arg（精氨酸）特性:具有很強的堿性。反應：與板口試劑（萘酚、次溴酸鹽）反應生成紅色，該反應是鑒定精氨酸存在的定性反應。也可用于定量測定45蛋白質一級結構的測定方法甲硫基：Met（甲硫氨酸）,－S－CH3特性：甲硫氨基酸側鏈上的甲硫基是一個強的親核中心，容易與鹵代烷發(fā)生親核反應，生成烷基化產物。該種產物用巰基試劑處理可以除去烷基和原有的甲基，因此與帶有14C標記的碘甲烷反應，再用巰基試劑處理能夠得到含有同位素14C標記的甲硫氨酸。46蛋白質一級結構的測定方法2.多肽鏈的降解1）化學法①溴化氫法溴化氰

Met（甲硫氨酸）——X

47蛋白質一級結構的測定方法溴化氫化學降解法其優(yōu)點：①一般蛋白質含甲硫氨酸較少，由此可獲得大片段②專一性強③產率高達80%以上④作用條件溫和，在室溫中用幾到十幾小時即可48蛋白質一級結構的測定方法1）化學法

②羥胺法

這種方法近十年來開始受人注意，羥胺能專一性地裂解Asn（天冬酰胺）-Glu（谷氨酸）的肽鍵，酸性條件下裂解Asn-Pro肽鍵。已用于某些蛋白質的分析。Asn（天冬酰胺）——Leu（亮氨酸）Asn（天冬酰胺）——Ala（丙氨酸）③N-溴代琥珀酰亞胺法主要裂解Tyr（酪氨酸）處的肽鍵，五十年代研究較多。但由于它也能斷裂Tyr（酪氨酸）——His(組氨酸)肽鍵，因此應用不廣。49蛋白質一級結構的測定方法④NTCB（2-硝基-5-硫氰苯甲酸）—X—Cys（半胱氨酸）—X－Cys（半胱氨酸）鍵的裂解：⑤2－硝基－5－硫氰苯甲酸（NTCB）和2－甲基－N－1－苯磺酰－N－4－（溴乙酰）醌二亞酰胺（也稱Cyssor，專切半胱氨酸）⑥亞碘?；郊姿帷猅rp（色氨酸）—X—產率70-100%50蛋白質一級結構的測定方法1）化學法

（2）部分酸水解法Sanger在分析胰島素的一級結構中采用了此法，即用0.1N鹽酸在110℃或用6N鹽酸在37℃水解。這種部分酸水解的方法特異性不強，因此對大片段的蛋白質和肽均不合適。51蛋白質一級結構的測定方法優(yōu)點：專一性高，降解后的多肽容易純化，產率高，副作用小。注意事項：適合酶作用的溫度和酸堿度（pH），反應時間。酶的用量，待裂解蛋白質的物理狀態(tài)。緩沖溶液的離子強度等酶裂解前需要作預備實驗，掌握好各種條件。2.多肽鏈的降解

2）酶解法52蛋白質一級結構的測定方法胰蛋白酶Trypsin：R1=賴氨酸Lys和精氨酸Arg側鏈（專一性較強，水解速度快）。53蛋白質一級結構的測定方法糜蛋白酶或胰凝乳蛋白酶Chymotrypsin：（α糜蛋白酶）對疏水性氨基酸水解速度比較快。R1=苯丙氨酸Phe,色氨酸Trp,酪氨酸Tyr;亮氨酸Leu，蛋氨酸Met和組氨酸His水解稍慢。54蛋白質一級結構的測定方法胃蛋白酶

水解專一性比較廣。Pepsin：R1和/或R2=苯丙氨酸Phe,色氨酸Trp,酪氨酸Tyr;亮氨酸Leu以及其它疏水性氨基酸水解速度較快55蛋白質一級結構的測定方法嗜熱菌蛋白酶中性金屬酶它的專一性取決于氨基參與形成的肽鍵。thermolysin：R2=苯丙氨酸Phe,色氨酸Trp,酪氨酸Tyr;亮氨酸Leu，異亮氨酸Ileu,甲硫氨酸Met以及其它疏水性強的氨基酸水解速度較快。56蛋白質一級結構的測定方法金黃色葡萄球菌Glu蛋白酶——Glu——X——谷氨酸羧基端參與形成的肽鍵。梭菌Arg蛋白酶(clostripain)——Arg——X——精氨酸羧基端參與形成的肽鍵。Lys蛋白酶——X——Lys——賴氨酸氨基端參與形成的肽鍵。小羊腎Pro蛋白酶——Pro——X——57蛋白質一級結構的測定方法胰蛋白酶

（賴氨酸）Lys——X，（精氨酸）Arg——X(X≠Pro)胰凝乳蛋白酶（糜蛋白酶）

（酪氨酸）Tyr——X，（色氨酸）Trp——X（苯丙氨酸）Phe——X(X≠Pro)嗜熱菌蛋白酶

X--Leu（亮氨酸）,Ile（異亮氨酸）,Phe（苯丙氨酸）,Trp（色氨酸），Val（纈氨酸）,Tyr（酪氨酸），Met（甲硫氨酸）2）酶解法58蛋白質一級結構的測定方法

酶法裂解胃蛋白酶Phe（苯丙氨酸），Trp（色氨酸）Tyr（酪氨酸），Leu（亮氨酸）——X不能水解Pro羧基參與形成的肽鍵。Glu蛋白酶

Glu（谷氨酸）——XArg蛋白酶Arg（精氨酸）——XLys蛋白酶X——Lys（賴氨酸）Pro蛋白酶Pro——X59蛋白質一級結構的測定方法氨基酸的修飾與保護

（1）賴氨酸的修飾——胰蛋白酶60蛋白質一級結構的測定方法2）酶解法

（1）賴氨酸的修飾

蛋白質中的賴氨酸，經順丁烯酰化作用后，被胰蛋白酶水解

61蛋白質一級結構的測定方法2）氨基酸的修飾與保護

（2）精氨酸的修飾胰蛋白酶62蛋白質一級結構的測定方法2）酶解法

（3）半胱氨酸的修飾

63蛋白質一級結構的測定方法肽鏈的裂解和重組大致有三種情況：一種是非特異性裂解，如酸水解。由于裂解的片段較小，造成分離的困難。因此這種非特異性裂解對大分子肽鏈是不適用的。第二種是特異性裂解，采用兩種以上的專一裂解，然后進行組合，這種方法一般也適用于分子量小于5萬的蛋白質。第三種是逐步的專一裂解，首先將某種氨基酸進行化學修飾，使水解酶專一斷裂某一種氨基酸，分成若干片段，然后解除化學封閉，再用此酶裂解，使曾被封閉過的氨基酸斷裂。目前傾向于采用這種裂解方式。64蛋白質一級結構的測定方法

大部分肽段的分離主要通過凝膠過濾法，由于大分子肽溶解度小。往往采用甲酸、醋酸、丙酸等有機溶劑使之溶解。單用凝膠過濾法分離肽段一般純度不高，常需輔以離子交換層析法，大片段肽可用離子交換葡聚糖作載體，小肽則多用Dowex-50等樹脂。小肽分離還常采用高壓電泳與層析相結合的指紋圖譜法，得到純凈肽

3肽段的分離和純度鑒定65蛋白質一級結構的測定方法凝膠過濾法凝膠過濾法又稱分子排阻法，這是一種高效分離純化蛋白質的方法。原理是不同的蛋白質分子對固定化在載體上的特殊配基具有不同的識別和結合能力。選擇與待純化蛋白質具有特殊識別和結合作用的配基，然后應用化學方法將該配基與載體共價鏈接。將這種有配基的載體裝入層析柱中，當含有待純化的蛋白質溶液通過層析柱時，該蛋白質即與配基發(fā)生特異性結合而被吸附在層析柱上，而其他蛋白質則流出柱外。被特異性結合在層析柱上的蛋白質，可以用適當的配體洗脫液洗脫66蛋白質一級結構的測定方法離子交換層析固定相是離子交換劑的層析分離技術。樣品中待分離的溶質離子，與固定相上所結合的離子交換，不同的溶質離子與離子交換劑上離子化的基團的親和力和結合條件不同，洗脫液流過時，樣品中的離子按結合力的弱強先后洗脫。在生物化學和分子生物學領域此法常用于分離蛋白質、核酸等生物大分子。67蛋白質一級結構的測定方法支持物是人工交聯(lián)的帶有能解離基團的有機高分子，如離子交換樹脂、離子交換纖維素、離子交換凝膠等。帶陽離子基團的，如磺酸基（—SO3H）、羧甲基（—CH2COOH）和磷酸基等為陽離子交換劑。帶陰離子基團的，如DEAE—（二乙基胺乙基）和QAE—（四級胺乙基）等為陰離子交換劑。離子交換層析只適用于能在水中解離的化合物，包括有機物和無機物。對于蛋白質、核酸、氨基酸及核苷酸的分離分析有極好的分辨力。離子交換基團在水溶液中解離后，能吸引水中被分離物的離子，各種物質在離子交換劑上的離子濃度與周圍溶液的離子濃度保持平衡狀態(tài)，各種離子有不同的交換常數，K值愈高，被吸附愈牢。洗脫時，增加溶液的離子強度，如改變pH，增加鹽濃度，離子被取代而解吸下來。洗脫過程中，按K值不同，分成不同的區(qū)帶。68蛋白質一級結構的測定方法蛋白質分離純化（細分級）的方法都可以用。對角線法：雙向電泳和雙向層析，第一相電泳后不作任何處理進行第二相電泳，得到對角線圖譜說明肽段純度高。改良對角線技術可以確定二硫鍵的存在。高效液相色譜：目前已經成為純化蛋白質和多肽的有力工具。層析和電泳游離末端鑒定純度鑒定：69蛋白質一級結構的測定方法4.肽的順序分析

1）化學法Edman降解法

（一）Edman化學降解法：分析短肽最基本、最有效的方法Edman試劑：異硫氰酸苯酯（PITC或PTC）降解過程：（1）耦聯(lián)反應：PITC與肽段N末端氨基酸的α－氨基（游離）在堿性條件下發(fā)生耦聯(lián)反應，生成PTC－肽。（2）斷裂反應：在強酸作用下，離PTC－肽最近的氨肽鍵斷裂，形成2－苯胺－5噻唑啉酮衍生物（PTZ）,原來的肽段少一個氨基酸殘基。（3）轉化（環(huán)化）：PTZ不穩(wěn)定，在酸性條件下，自發(fā)環(huán)化轉變成3－苯基－2－乙內酰脲（PTH－AA）。70蛋白質一級結構的測定方法利用Edman試劑降解一次最多可以測出多少殘基，關鍵在于，肽片段轉變?yōu)镻TC－肽及隨后的Edman降解反應的產率。一般來說，反應產率逐漸降低。71蛋白質一級結構的測定方法Edman化學降解的圖示耦聯(lián)斷裂轉化72蛋白質一級結構的測定方法1）化學法Edman降解法PTH－氨基酸的鑒定改進A.1967年Edman及Begg介紹了一種Edman降解的液相自動分析裝置，使順序分析開始走向自動化。將樣品先在反應杯內旋轉成薄膜，使之固定。然后與PITC試劑反應。再用有機溶劑多次抽提除去過剩試劑，因而樣品易丟失，且儀器昂貴，使用受到限制。73蛋白質一級結構的測定方法1）化學法Edman降解法PTH－氨基酸的鑒定改進B.1970年Laursen改進為固相氨基酸順序儀。此法樣品用量少，檢出靈敏，可分析超過2000肽，其原理是將肽共價結合到惰性支持物上，固定后裝柱再行Edman降解。74蛋白質一級結構的測定方法（三）減數Edman序列分析法這也是Edman降解的改良技術。分析用Edman試劑降解后肽段的氨基酸組成，每一次丟失的氨基酸就是N末端的氨基酸。優(yōu)點：快速、準確、樣品需要量少。需要有氨基酸自動分析儀。（四）DABITC/PITC雙耦聯(lián)法DABITC（4－N，N－二甲氨基偶氮苯－4‘－異硫氰酸苯酯）是改進的Edman試劑。N末端的氨基酸從肽段上裂解下來后，生成的顏色明顯的DABITH—AA。在聚酰胺薄膜上層析分離，鹽酸蒸汽熏，顯示紅色斑點，雜質顯藍紫色。其原理與Edman降解法相同。76蛋白質一級結構的測定方法（五）酶降解法進行肽段序列分析1氨肽酶法：各種氨肽酶的專一性2羧肽酶法：

3二肽酶法：每次切下兩個氨基酸殘基，進行分析測定。77蛋白質一級結構的測定方法自動序列分析蛋白質序列儀（一）液相序列儀：自旋式反應器，使用微量樣品測定大片斷，不適于小肽片段。（二）固相序列儀：用聚苯乙烯作固相載體，近年來用微孔玻璃球，球表面連接丙氨基側鏈，在丙氨基側鏈后面再連接反應基團與肽片段結合，肽片段的類型（羧基端不同）不同與其連接的反應基團不同。（三）氣相序列儀：也稱氣相－固相序列儀。再氣態(tài)條件下完成Edman降解，反應室內引入攜帶體polybrene與多肽片段結合，防止樣品流失。優(yōu)點：靈敏度高，效率高，試劑和溶劑消耗量低。儀器價格昂貴78蛋白質一級結構的測定方法用自動序列分析儀測序儀器原理：Edman法。1967液相測序儀自旋反應器，適于大肽段。1971固相測序儀表面接有丙氨基的微孔玻璃球，可耦連肽段的Ｃ端。1981氣相測序儀用Polybrene反應器。（聚陽離子）四級銨鹽聚合物液相：5nmol20-40肽97%氣相：5pmol60肽98%79蛋白質一級結構的測定方法Polybrene：Abbott公司商標俗名：hexadimethrinebromide。化學名：1，5－dimethyl－1，5－diazaundecamethylenepolymethobromide1，5－二甲基－1，5－二氮十一亞甲基聚甲溴化物用途：哺乳動物細胞感染，蛋白質自動測序，肝素拮抗劑。80蛋白質一級結構的測定方法四由已知序列肽段建立蛋白質一級結構重疊肽：分子量較大的肽段，通過多種方式的專一性切割，分析小肽段的氨基酸排列順序。

1多肽鏈斷裂成多個肽段，可采用兩種或多種不同的斷裂方法將多肽樣品斷裂成兩套或多套肽段或肽碎片，并將其分離開來。

2測定每個肽段的氨基酸順序。