實(shí)驗(yàn)一醋酸纖維薄膜電泳分離血清蛋白第1頁(yè)，課件共16頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月原理電泳:帶電顆粒在電場(chǎng)中泳動(dòng)的現(xiàn)象

各種蛋白質(zhì)在同一pH條件下，因分子量和電荷數(shù)量等不同而在電場(chǎng)中的遷移率不同而得以分開(kāi)。不用支持物的利用支持物1）紙電泳2)淀粉凝膠電泳3)瓊脂糖凝膠電泳4）醋酸纖維薄膜電泳5）聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）第2頁(yè)，課件共16頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月影響泳動(dòng)速度的主要因素1）電場(chǎng)強(qiáng)度：（越大，移動(dòng)速度越快）常壓電泳：100-500V，2-10V/cm高壓電泳：500-10000V，20-200V/cm2）溶液的pH值：buffer。8.603）溶液的離子強(qiáng)度：（I越大，速度越慢；緩沖效果越好），0.02-0.2之間。0.073）電滲現(xiàn)象：液體在電場(chǎng)中相對(duì)于固體支持物的相對(duì)移動(dòng)。盡量避免有高電滲作用的支持物。第3頁(yè)，課件共16頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）Davis和Ornstein1959年人血清蛋白聚丙烯酰胺凝膠：由丙烯酰胺（Acr，單體）和N,N′-甲叉雙丙烯酰胺（Bis，交聯(lián)劑）共聚合而成（由過(guò)硫酸銨-四乙基乙二胺TEMED系統(tǒng)或核黃素-TEMED系統(tǒng)激發(fā)）。分子篩，可通過(guò)調(diào)節(jié)單體濃度或與交聯(lián)劑的比例來(lái)控制孔徑大小，達(dá)到不同的分離目的。凝膠可以是平板（垂直板型）或柱子（盤(pán)狀）第4頁(yè)，課件共16頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月第5頁(yè)，課件共16頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月第6頁(yè)，課件共16頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月SDS：十二烷基硫酸鈉CH3（CH2）11OSO3Na，陰離子去污劑，與蛋白質(zhì)結(jié)合，能破裂蛋白質(zhì)分子中的氫鍵和疏水作用，破壞蛋白質(zhì)的二級(jí)、三級(jí)、四級(jí)結(jié)構(gòu)。

1）先加還原劑如巰基乙醇打開(kāi)-S-S-；2）SDS破壞蛋白質(zhì)構(gòu)象，與氨基酸側(cè)鏈充分結(jié)合，形成蛋白質(zhì)亞基-SDS膠束。SDS是陰離子，使多肽鏈帶上負(fù)電荷，該電荷量遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)蛋白質(zhì)分子原有電荷量，掩蓋了不同蛋白質(zhì)之間的電荷差別。電泳遷移率主要取決于蛋白質(zhì)或亞基分子量的大小。SDS：十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳第7頁(yè)，課件共16頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月作用使蛋白質(zhì)成為亞基物質(zhì)，形成蛋白質(zhì)-SDS膠束，消除蛋白質(zhì)分子之間的電荷、形狀差異；橢圓棒狀，短軸均為1.8nm，長(zhǎng)軸正比于蛋白質(zhì)分子量。MW在15200kDa，電泳遷移率與分子量對(duì)數(shù)呈線性關(guān)系。logM=a-bRf，Rf為遷移率第8頁(yè)，課件共16頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月第9頁(yè)，課件共16頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月醋酸纖維薄膜電泳(CAME)以醋酸纖維薄膜(CAM)作支持物的一種區(qū)帶電泳技術(shù)，將血清樣品點(diǎn)樣于醋纖膜上，在pH8.6的緩沖液中電泳，血清蛋白質(zhì)均帶負(fù)電荷移向正極。由于血清中各蛋白組分等電點(diǎn)不同而使表面凈電荷量不等，加之分子大小和形狀各異，因而電泳遷移率不同，彼此得以分離。電泳后，CAM經(jīng)染色和漂洗，可清晰呈現(xiàn)清蛋白、α1、α2、β、γ—球蛋白5條區(qū)帶。第10頁(yè)，課件共16頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月人血清中常見(jiàn)蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)和分子量蛋白質(zhì)等電點(diǎn)分子量正常參考值（%）清蛋白4.886900057-68α1-球蛋白5.062000001.0-5.7α2-球蛋白5.063000004.9-11.2β-球蛋白5.1290000-1500007-13γ-球蛋白6.85-7.2156000-3000009.8-18.2負(fù)極正極γ—球蛋白/β-球蛋白/α2-球蛋白/α1-球蛋白/清蛋白第11頁(yè)，課件共16頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月器材1．醋酸纖維薄膜(8X2mm)

2．點(diǎn)樣器

3．染色皿，漂洗器，鑷子

4．電泳儀：電泳儀電源，水平電泳槽

第12頁(yè)，課件共16頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月試劑1．巴比妥緩沖液(pH8.6)：取巴比妥鈉12.76g，巴比妥1.66g，加蒸餾水加熱溶解后稀釋至1升。2．氨基黑10B染色液：取氨基黑10B0.5g，甲醇50ml，冰醋酸l0ml，加水至100ml。3．漂洗液：95％乙醇45ml、冰醋酸5ml、蒸餾水50ml

第13頁(yè)，課件共16頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月操作-準(zhǔn)備l．醋酸纖維薄膜(CAM)的準(zhǔn)備：薄膜放進(jìn)緩沖液中，自然浸潤(rùn)，約20分鐘。2．電泳槽的準(zhǔn)備：水平放置，將緩沖液注入電泳槽中，兩邊的緩沖液高度要一致，架上濾紙橋，蓋上電泳槽蓋3．點(diǎn)樣：將充分浸透(指膜上無(wú)白色斑痕)的薄膜取出，用濾紙吸去膜上過(guò)多緩沖液，粗糙面(無(wú)光澤面)用于點(diǎn)樣，載玻片蘸取血清，垂直印在CAM粗糙面上。第14頁(yè)，課件共16頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月操作-電泳4．加樣后，將薄膜條架于支架兩端，點(diǎn)樣面朝下，點(diǎn)樣側(cè)置于負(fù)極端。薄膜應(yīng)平直無(wú)彎曲，加上槽蓋平衡5分鐘后通電。5．連接電泳槽與電泳儀對(duì)應(yīng)的正負(fù)極，開(kāi)啟電源通電。電壓160V。電泳50分鐘，斷電。6．染色：用鑷子取出薄膜條投入染液8分鐘，染色過(guò)程中不時(shí)輕輕晃動(dòng)染色皿，使染色充分。7.漂洗:從染液中取出薄膜條并盡量瀝去染液，投入漂洗皿中反復(fù)漂洗，直至背景漂凈為止。此時(shí)清晰可見(jiàn)5條色帶，待干。第1