第十三章液相色譜法第十三章液相色譜法一、概述二、柱色譜法三、薄層色譜法第一節(jié)

概述一、色譜法的產(chǎn)生及發(fā)展二、色譜法的分類三、色譜法的基本原理四、色譜法的特點(diǎn)第一節(jié)

概述一、色譜法的產(chǎn)生及發(fā)展1、色譜法的出現(xiàn)2、色譜法的發(fā)展3、色譜法的現(xiàn)狀和未來(lái)第一節(jié)

概述一、色譜法的產(chǎn)生及發(fā)展1903年Tswett

（茨維特）研究植物葉子組成時(shí)發(fā)明了色譜法固定相：碳酸鈣流動(dòng)相：石油醚玻璃柱：色譜柱第一節(jié)

概述一、色譜法的產(chǎn)生及發(fā)展1931年

Kuhn等用氧化鋁和碳酸鈣分離了α-,β-,γ-胡蘿卜素等60多種植物色素1941年

Martin和Synge建立了液液分配色譜法并提出氣相色譜的設(shè)想1952年Martin等發(fā)明了氣液色譜法1952年Martin和Synge

獲得諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)1941年Consden等發(fā)展了紙色譜。第一節(jié)

概述一、色譜法的產(chǎn)生及發(fā)展1949年Macllean等在氧化鋁中加入淀粉粘合劑制作薄層板使薄層色譜法（TLC）得以實(shí)際應(yīng)用，而在1956年Stahl開(kāi)發(fā)出薄層色譜板涂布器之后，才使TLC得到廣泛地應(yīng)用。1957年Golay開(kāi)創(chuàng)了開(kāi)管柱氣相色譜法，習(xí)慣上稱為毛細(xì)管柱氣相色譜60年代末把高壓泵和化學(xué)鍵合固定相用于液相色譜，出現(xiàn)了高效液相色譜（HPLC）。80年代初毛細(xì)管超臨界流體色譜（SFC）得到發(fā)展，但在90年代后未得到較廣泛的應(yīng)用。80年代初由Jorgenson等集前人經(jīng)驗(yàn)而發(fā)展起來(lái)的毛細(xì)管電泳（CZE），在90年代得到廣泛的發(fā)展和應(yīng)用。同時(shí)集HPLC和CZE優(yōu)點(diǎn)的毛細(xì)管電色譜在90年代后期受到重視。第一節(jié)

概述一、色譜法的產(chǎn)生及發(fā)展1956年VanDeemter等在前人研究的基礎(chǔ)上發(fā)展了描述色譜過(guò)程的速率理論，1965年Giddings總結(jié)和擴(kuò)展了前人的色譜理論，為色譜的發(fā)展奠定了理論基礎(chǔ)。21世紀(jì)色譜科學(xué)在生命科學(xué)等前沿科學(xué)領(lǐng)域發(fā)揮不可代替的重要作用。第一節(jié)

概述二、色譜法的分類一）按兩相所處狀態(tài)分類流動(dòng)相固定相類型液相色譜液體固體液-固色譜液體液體液-液色譜氣體固體氣-固色譜氣體液體氣-液色譜氣相色譜第一節(jié)

概述二、色譜法的分類二）按操作的形式分平面色譜

紙色譜薄層色譜高分子薄膜色譜柱色譜

填充柱色譜

毛細(xì)管柱色譜

第一節(jié)

概述二、色譜法的分類三）按分離原理分分配色譜：利用分配系數(shù)的不同吸附色譜：利用物理吸附性能的差異離子交換色譜：利用離子交換原理空間排阻色譜：利用排阻作用力的不同第一節(jié)

概述三、色譜法的基本原理指被分離組分在兩相中的“分配”平衡過(guò)程以吸附色譜為例吸附→解吸→再吸附→再解吸→反復(fù)多次洗脫→被測(cè)組分分配系數(shù)不同→差速遷移→分離微小差異積累→較大差異→吸附能力弱的先出來(lái)，吸附能力強(qiáng)的組分后第一節(jié)

概述四、色譜法的特點(diǎn)特點(diǎn)：“三高”、“一快”、“一廣”高選擇性——可將性質(zhì)相似的組分分開(kāi)高效能——反復(fù)多次利用組分性質(zhì)的差異，產(chǎn)生很好分離效果高靈敏度——10-11～10-13g，適于痕量分析分析速度快——幾～幾十分鐘完成分離一次可以測(cè)多種樣品應(yīng)用范圍廣——?dú)怏w，液體、固體物質(zhì)，化學(xué)衍生化再色譜分離、分析

第二節(jié)

柱色譜法一、液-固吸附柱色譜法二、液-液分配柱色譜法三、離子交換駐色譜法四、凝膠柱色譜法一、液-固吸附柱色譜法一）吸附作用與吸附平衡二）吸附劑及其選擇三）流動(dòng)相的選擇一、液-固吸附柱色譜法一）吸附作用與吸附平衡各組分與流動(dòng)相分子爭(zhēng)奪吸附劑表面活性中心，利用吸附劑表面的活性吸附中心對(duì)不同組分的吸附能力差異而實(shí)現(xiàn)分離。K值越大，越容易被吸附，流出色譜柱越慢K值受吸附劑的活性、組分的性質(zhì)、流動(dòng)相性質(zhì)的影響一、液-固吸附柱色譜法二）吸附劑及其選擇1、吸附劑的種類及性狀常用吸附劑為多孔、微粒狀物質(zhì)硅膠氧化鋁聚酰胺二）吸附劑及其選擇硅膠結(jié)構(gòu)：內(nèi)部——硅氧交聯(lián)結(jié)構(gòu)→多孔結(jié)構(gòu)表面——有硅醇基→氫鍵作用→吸附活性中心特性活性和含水量有關(guān)，含水量越高，活性越低，級(jí)別越高。物質(zhì)極性越大，吸附能力越強(qiáng)，不易洗脫吸水→失活→105～110℃烘干30分鐘(可逆失水)→吸附力最大→500℃烘干(不可逆失水)→活性喪失，無(wú)吸附力適合分離酸性或中性物質(zhì)一、液-固吸附柱色譜法二）吸附劑及其選擇氧化鋁堿性氧化鋁pH9～10適于分析堿性、中性物質(zhì)中性氧化鋁pH＞7.5適于分析酸性堿性和中性物質(zhì)酸性氧化鋁pH4～5適于分析酸性、中性物質(zhì)特性：活性也和含水量有關(guān)，同硅膠聚酰胺氫鍵作用氫鍵能力↑強(qiáng)，組分越后出柱適用于天然產(chǎn)物有效成分的分離上一、液-固吸附柱色譜法二）吸附劑及其選擇2、吸附劑活性測(cè)定用柱色譜或薄層色譜測(cè)定取六種染料①偶氮苯②對(duì)甲氧基偶氮苯③蘇丹黃④蘇丹紅⑤對(duì)氨基偶氮苯⑥對(duì)羥基偶氮苯都配成0.04%的溶液，溶劑為石油醚：苯為4：1固定相：上述固定相流動(dòng)相：同溶劑讓六種染料通過(guò)色譜住，根據(jù)染料在色譜柱上的位置判斷活性一、液-固吸附柱色譜法三）流動(dòng)相的選擇1、流動(dòng)相的極性流動(dòng)相的極性↑，洗脫能力↑。根據(jù)“相似相容”原理，來(lái)選擇流動(dòng)相。極性大的選擇極性大的流動(dòng)相2、被分離組分的極性官能團(tuán)的極性大小烷烴＜烯烴＜醚類＜硝基化合物＜酯類＜酮類＜醛類＜硫醇＜胺類＜醇類＜羧酸①不飽和烴中雙鍵越多，極性越大②母體相同，官能團(tuán)的極性越大或越多，極性越大③空間排列對(duì)極性也有影響，一般有分子內(nèi)氫鍵，被吸附力減弱④同系物中分子量越大，極性越小一、液-固吸附柱色譜法三）流動(dòng)相的選擇3、吸附劑的選擇分離極性小的組分，用吸附能力大的吸附劑分離極性大的組分，用吸附能力小的吸附劑三者關(guān)系圖示：組分吸附劑流動(dòng)相極性活性小極性非(弱)極性活性大非極性或弱極性二、液-液分配柱色譜法1、分離原理2、載體3、流動(dòng)相與固定相二、液-液分配柱色譜法一）分離原理利用組分在流動(dòng)相和固定相間溶解度差別實(shí)現(xiàn)分離連續(xù)萃取過(guò)程二、液-液分配柱色譜法一）分離原理正相色譜：流動(dòng)相的極性比固定相弱反相色譜：流動(dòng)相的極性比固定相強(qiáng)分配系數(shù)K與組分的性質(zhì)、流動(dòng)相的性質(zhì)、固定相的性質(zhì)以及柱溫有關(guān)二、液-液分配柱色譜法二）載體三）流動(dòng)相與固定相要求：固定相→機(jī)械吸附在惰性載體上的液體流動(dòng)相→必須與固定相不為互溶（所以洗脫劑必須與固定液飽和）載體→惰性，性質(zhì)穩(wěn)定，不與固定相和流動(dòng)相發(fā)生化學(xué)反應(yīng)三、離子交換柱色譜法一）原理二）離子交換樹(shù)脂的分類三）離子交換平衡四）離子交換樹(shù)脂的性能三、離子交換柱色譜法一）原理分離機(jī)制：依據(jù)被測(cè)組分與離子交換劑交換能力（親和力）不同而實(shí)現(xiàn)分離交換能力弱的，遷移速度快固定相→離子交換樹(shù)脂流動(dòng)相→水為溶劑的緩沖溶液被分離組分→離子型的有機(jī)物或無(wú)機(jī)物三、離子交換柱色譜法二）離子交換樹(shù)脂的類型離子交換樹(shù)脂是一類具有網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的高分子聚合物。性質(zhì)穩(wěn)定，與酸、堿、某些有機(jī)試劑不反應(yīng)。常用的是聚苯乙烯型的，以苯乙烯為單體、二乙烯苯為交聯(lián)劑陽(yáng)離子型：在樹(shù)脂骨架上引入酸性基團(tuán)，如磺酸基（-SO3H）、羧基（-COOH）、酚羥基（-OH）

RSO3-H++X+→RSO3-X++H+

陰離子型：在樹(shù)脂骨架上引入堿性基團(tuán)，如季銨基（-N（CH3）3+OH-）、伯胺基（-NH2.H2O）

RN（CH3）3+OH-+X-

＝RN（CH3）3+X-+OH-三、離子交換柱色譜法三）離子交換平衡離子交換反應(yīng)用下列通式表示

R-B++A+=R-A++B+

R代表固定相，W代表流動(dòng)相相KA/B↑，對(duì)A離子結(jié)合牢固，B離子在前，A離子在后。與離子的電荷數(shù)、水合離子半徑、流動(dòng)相性質(zhì)三、離子交換柱色譜法四）離子交換樹(shù)脂的性能1、交聯(lián)度指離子交換樹(shù)脂中交聯(lián)劑的含量。交聯(lián)度↑，網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)緊密，選擇性好，速度慢陽(yáng)離子交換樹(shù)脂交聯(lián)度為8%，陰離子為4%2、交換容量在實(shí)驗(yàn)條件下，每克干樹(shù)脂真正參加交換的基團(tuán)數(shù)，可用酸堿滴定法測(cè)定。單位為mmol/g

一般為1～10mmol/g四、凝膠柱色譜法原理利用被測(cè)組分分子大小不同、在固定相上選擇性滲透實(shí)現(xiàn)分離固定相→多孔性凝膠流動(dòng)相→水——凝膠過(guò)濾色譜流動(dòng)相→有機(jī)溶劑——凝膠滲透色譜四、凝膠柱色譜法滲透平衡Kp僅取決于待測(cè)分子尺寸和凝膠孔徑大小與流動(dòng)相的性質(zhì)無(wú)關(guān)

總結(jié)四種色譜的分離機(jī)制各不相同，分別形成吸附平衡、分配平衡、離子交換平衡和滲透平衡K分別為吸附系數(shù)，狹義分配系數(shù)，選擇性系數(shù)和滲透系數(shù)除了凝膠色譜法中的K僅與待測(cè)分子大小尺寸、凝膠孔徑大小有關(guān)外，其他三種K值都受組分的性質(zhì)、流動(dòng)相的性質(zhì)、固定相的性質(zhì)以及柱溫的影響第三節(jié)

薄層色譜法（一）概述（二）定性參數(shù)（三）吸附劑的選擇（四）展開(kāi)劑的選擇（五）薄層板的制備（六）定性與定量分析第三節(jié)

薄層色譜法一、概述1、定義：將固定相均勻涂布在表面光滑的平板上，形成薄層而進(jìn)行色譜分離和分析的方法2、操作過(guò)程鋪板→活化→點(diǎn)樣→展開(kāi)→定位(定性)/洗脫(定量)3、分離機(jī)制：吸附、分配，離子交換，空間排阻4、特點(diǎn)：分析快速、靈敏、顯色方便5、應(yīng)用：藥物雜質(zhì)檢查、純度測(cè)定

第三節(jié)

薄層色譜法二、定性參數(shù)1、比移值Rf

Rf與組分性質(zhì)（溶解度）以及薄層板和展開(kāi)劑的性質(zhì)有關(guān)色譜條件一定，Rf只與組分性質(zhì)有關(guān)，是薄層色譜基本定性參數(shù)，說(shuō)明組分的色譜保留行為第三節(jié)

薄層色譜法二、定性參數(shù)1）K↑大，Rf↓小2）薄層板一定，對(duì)于極性組分展開(kāi)劑極性↑大，Rf↑大（容易洗脫）展開(kāi)劑極性↓小，Rf↓?。ú蝗菀紫疵摚?）Rf范圍：0<Rf

<1（組分遷移速度和距離小于展開(kāi)劑遷移速度和距離）

Rf=0.2——0.8（常用）

0.3——0.5（最佳）討論第三節(jié)

薄層色譜法二、定性參數(shù)2、相對(duì)比移值Rs討論參考物與被測(cè)組分在完全相同條件下展開(kāi)可以消除系統(tǒng)誤差，大大提高重現(xiàn)性和可靠性；參考物可以是后加入純物質(zhì)，也可是樣品中已知組分相對(duì)比移值Rs與組分、參考物性質(zhì)及色譜條件有關(guān)，范圍可以大于或小于1第三節(jié)

薄層色譜法三、吸附劑的選擇根據(jù)被測(cè)物極性和吸附劑的吸附能力

被測(cè)物極性強(qiáng)——弱極性吸附劑

被測(cè)物極性弱——強(qiáng)極性吸附劑第三節(jié)

薄層色譜法四、展開(kāi)劑的選擇同液固吸附色譜流