傻瓜RT-PCR反應(yīng)體系（Easy-Go?RT-PCRPreMix）實(shí)驗(yàn)方法據(jù)下表將適當(dāng)濃度的模板RNA和反向引物混合在DEPC處理過(guò)的管中。模板RNA和引物在反應(yīng)體系中的濃度反應(yīng)體系20μl反應(yīng)體系模板RNA總RNA0.5-1.0μgPoly(A)RNA0.05-0.1μg引物引物10-30pmol2.DEPC處理水補(bǔ)足到20ul。3.通過(guò)振蕩將凍干物完全溶解，然后輕微離心。4.加少許礦物油（若使用帶加熱蓋的PCR儀，可省略此步驟）。5.根據(jù)下列推薦的條件進(jìn)行cDNA合成。42℃，60分鐘（94℃6.根據(jù)PCR反應(yīng)條件進(jìn)行PCR反應(yīng)（退火溫度及時(shí)間需要針對(duì)不同的引物/模板組合加以優(yōu)化）。常見(jiàn)問(wèn)題及參考意見(jiàn)RNA結(jié)構(gòu)特點(diǎn)及RNase的作用？RNA是由4種（2’未脫氧的）核苷酸A、U、G、C的單鏈構(gòu)成的聚合物。2’-OH對(duì)RNA分子的理化性能有重要影響：（1）RNase對(duì)RNA的降解作用通過(guò)2’-OH進(jìn)行，不再需要DNase必須的工作金屬離子的參與便可完成；（2）RNA分子在強(qiáng)堿條件下，通過(guò)2’-OH參與形成2’操作RNA注意事項(xiàng)？由于RNA酶的高穩(wěn)定性、廣泛存在性和RNA的不穩(wěn)定性，在有關(guān)RNA操作的實(shí)驗(yàn)中須十分小心。指定特定的區(qū)域作為操作RNA專用區(qū)，保持實(shí)驗(yàn)室低溫、清潔的環(huán)境，減少空氣流動(dòng)，實(shí)驗(yàn)前用RNA酶滅活劑和75%乙醇檫試實(shí)驗(yàn)臺(tái)。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中需戴口罩及一次性手套，接觸可能污染RNA酶的物品后要更換手套。對(duì)于內(nèi)源RNase的抑制，根據(jù)實(shí)驗(yàn)特點(diǎn)采取不同方法。如體外轉(zhuǎn)錄、合成cDNA第一鏈等實(shí)驗(yàn)，加入RNase的專一抑制劑（RNasin）；對(duì)于RNA的分離制備采用非特異的蛋白變性劑，如異硫氰酸胍-巰基乙醇聯(lián)合變性的方式等。對(duì)于外源RNase，凡不能用高溫烘烤的材料如塑料容器等，通常用0.1%的焦碳酸二乙酯（DEPC）水溶液37℃浸泡12小時(shí)以上，高溫滅菌并烘干后使用。DEPC是RNA酶的化學(xué)修飾劑，它和RNA酶的活性基團(tuán)組氨酸的咪唑環(huán)反應(yīng)而抑制酶活性。所用玻璃器皿需置于干燥烘箱中200℃烘烤2小時(shí)以上或?qū)嶒?yàn)所用試劑也可用DEPC處理，加入DEPC至0.1%濃度，然后劇烈振蕩10分鐘，再煮沸15分鐘或高壓滅菌以消除殘存的DEPC，否則DEPC也能和腺嘌呤作用而破壞mRNA活性。配制的溶液如不能高壓滅菌，可用DEPC處理水配制，并盡可能用未曾開(kāi)封的試劑。注意：DEPC與氨水溶液混合會(huì)產(chǎn)生致癌物，因而使用時(shí)需小心。DEPC能與胺和巰基反應(yīng)，因而含Tris和DTT的試劑不能用DEPC處理。用作RNA分析的電泳槽要用1%SDS清洗，用水沖洗后，然后用無(wú)水乙醇清洗，最后用3%雙氧水浸泡10分鐘。使用前再用DEPC處理水沖洗電泳槽。cDNA產(chǎn)量很低，為什么？可能的原因：（1）RNA模板質(zhì)量低；（2）對(duì)mRNA濃度估計(jì)過(guò)高；（3）反應(yīng)體系中存在反轉(zhuǎn)錄酶抑制劑或反轉(zhuǎn)錄酶量不足；（4）反應(yīng)體積過(guò)大，一般不應(yīng)超過(guò)50μl。進(jìn)行RT-PCR實(shí)驗(yàn)時(shí)，產(chǎn)生彌散條帶，為什么？（1）在PCR反應(yīng)體系中第一條鏈產(chǎn)物的含量過(guò)高；（2）引物的用量過(guò)高；（3）沒(méi)有優(yōu)化PCR反應(yīng)條件及循環(huán)參數(shù)；（4）在用DNase處理被DNA污染的RNA樣品時(shí)，其產(chǎn)生的寡核苷酸片段會(huì)產(chǎn)生非特異性擴(kuò)增，一般會(huì)顯示為彌散背景。進(jìn)行RT-PCR實(shí)驗(yàn)時(shí)，在瓊脂糖凝膠分析中看到少量或沒(méi)有RT-PCR產(chǎn)物，為什么？可能原因建議解決方法RNA被降解在變性膠上驗(yàn)證RNA的完整性使用無(wú)污染技術(shù)分離RNA將組織從動(dòng)物體取出后立即處理在100%甲酰胺中儲(chǔ)存RNA如果使用胎盤RNase抑制劑，不要加熱超過(guò)45℃或pH超過(guò)8.0，否則抑制劑會(huì)稀釋所有結(jié)合的RNA中包含逆轉(zhuǎn)錄抑制劑通過(guò)乙醇沉淀RNA，然后用70%（v/v）乙醇對(duì)RNA沉淀進(jìn)行漂洗。逆轉(zhuǎn)錄抑制劑包括：SDS、EDTA、甘油、焦磷酸鈉、亞精胺、甲酰胺和胍鹽將對(duì)照RNA同樣品混合，與對(duì)照RNA反應(yīng)比較產(chǎn)量以檢測(cè)抑制劑多糖同RNA共沉淀使用氯化鋰沉淀RNA以除去多糖用于合成cDNA第一鏈的OligoDNA沒(méi)有很好退火確定退火溫度是否適合您的OligoDNA。對(duì)于隨機(jī)六聚體，建議在反轉(zhuǎn)錄保溫之前先在25℃對(duì)于基因特異性O(shè)ligoDNA（GSP），可以試用一下其他GSP，或換用oligo(dT)或隨機(jī)六聚體確定GSP是反義序列起始RNA量不夠增加RNA量對(duì)于<50ng的RNA樣品，可以在第一鏈cDNA合成中使用0.1μg到0.5μg乙酰BSARNA模板二級(jí)結(jié)構(gòu)太多將RNA和OligoDNA在不含鹽及緩沖液條件下變性、退火提高逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)溫度靶序列在分析的組織中不表達(dá)嘗試其他靶序列或組織PCR沒(méi)有起作用對(duì)兩步法RT-PCR，不要在PCR步驟中使用超過(guò)1/5的逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)產(chǎn)物PCROligoDNA設(shè)計(jì)較差避免在OligoDNA3’避免可以形成內(nèi)部發(fā)卡結(jié)構(gòu)的序列設(shè)計(jì)Tm值接近的OligoDNA目的序列不在目的RNA上重新設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)，或嘗試用其它來(lái)源的目的RNA模板GC含量太高對(duì)于GC含量>50%的模板，使用改善GC含量的優(yōu)化劑模板濃度太低使用103拷貝的靶序列，以在25到30個(gè)循環(huán)中獲得信號(hào)鎂離子濃度太低從1mM到3mM間隔0.5mM進(jìn)行一系列反應(yīng)，確定對(duì)于每個(gè)模板和OligoDNA對(duì)的最佳鎂離子濃度。注意：對(duì)于RealTimePCR，使用3mM到退火溫度太高將退火溫度設(shè)定為低于Tm值5℃進(jìn)行PCROligoDNA濃度太低最佳OligoDNA濃度介于0.1μM到0.5μM之間特異OligoDNA（GSP）設(shè)計(jì)較差遵循OligoDNA設(shè)計(jì)原則6.進(jìn)行RT-PCR實(shí)驗(yàn)時(shí)，在瓊脂糖凝膠分析中看到非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物，為什么？反應(yīng)條件不是最佳優(yōu)化鎂離子濃度及退火溫度。使用鎂離子前將其震蕩混勻。引物設(shè)計(jì)不合理確認(rèn)引物無(wú)自身互補(bǔ)，或兩條引物不互補(bǔ)，尤其在近3’檢查PCR引物的長(zhǎng)度和Tm。避免在引物的3’體系被另一目的RNA/DNA污染加樣時(shí)使用正排式移液管