阪崎腸桿菌檢驗(yàn)

GB4789.40--2010

Enterobactersakazakii(ES)2內(nèi)容第一部分：一般特征第二部分：致病性第三部分：ES的檢驗(yàn)3阪崎腸桿菌(E．sakazakii)是人和動(dòng)物腸道內(nèi)寄生的一種革蘭陰性無(wú)芽孢桿菌，屬腸桿菌科腸桿菌屬，是腸道正常菌叢中的一種，在一定條件下可引起人和動(dòng)物致病。阪崎腸桿菌能引起嚴(yán)重的新生兒腦膜炎、小腸結(jié)腸炎和菌血癥，死亡率高達(dá)50%以上。目前，微生物學(xué)家尚不清楚阪崎腸桿菌的污染來(lái)源，但許多病例報(bào)告表明嬰兒配方粉是目前發(fā)現(xiàn)的主要感染渠道。第一部分：一般特征培養(yǎng)特征生化反應(yīng)抵抗力增殖能力與其他常見(jiàn)腸桿菌相似5一、培養(yǎng)特征阪崎腸桿菌兼性厭氧，營(yíng)養(yǎng)要求不高，能在營(yíng)養(yǎng)瓊脂、血平板、麥康凱(MacConkey，MAC)瓊脂、伊紅美藍(lán)瓊脂、脫氧膽酸瓊脂等多種培養(yǎng)基上生長(zhǎng)繁殖。ES在VRBGA平板上首次劃線分離時(shí)，37℃培養(yǎng)24h可生成2種不同的形態(tài)學(xué)特征：干燥或粘液狀、圓鋸齒狀（凹口或鋸齒），用金屬環(huán)接觸時(shí)可發(fā)現(xiàn)堅(jiān)韌或有彈力，即粘貼金屬環(huán)的菌量很少，并且菌落可很快恢復(fù)。傳代培養(yǎng)后可能會(huì)轉(zhuǎn)變?yōu)榈湫偷墓饣?。光滑、易于用金屬環(huán)從菌落移取細(xì)胞。

6本實(shí)驗(yàn)室大多數(shù)分離株呈流蠟樣，粉紫色、圓形、光滑、凸起、飽滿(mǎn)，并散發(fā)出特殊氣味；干燥、頂端發(fā)白的粉紫色菌落；從配方粉中初次分離到的該菌在VRBGA平板上過(guò)夜培養(yǎng)后呈現(xiàn)特殊的菌落形態(tài)：菌落干燥、邊緣有褶皺，極富彈性。傳代后，菌落皺褶減少，延長(zhǎng)培養(yǎng)時(shí)間，可見(jiàn)皺褶逐漸增加。7二、生化反應(yīng)

8DNASE-脫氧核糖核酸酶10注：＋：90-100％；(＋)：75-89%；V：25-74％；(－)：10-24％；－：0-9％三、抵抗力耐熱性滲透壓干燥不同菌株的耐熱性存在明顯的差別，但標(biāo)準(zhǔn)的巴氏消毒過(guò)程能有效的滅活ES。

ES對(duì)滲透壓的耐受性使該菌能夠成為環(huán)境中的優(yōu)勢(shì)株，增加PIF（嬰兒配方奶）加工后污染的危險(xiǎn)性，使其在PIF（嬰兒配方奶）

中長(zhǎng)期存活。11四、增殖能力

6℃，21℃，37℃分別是13.7h，1.7h，19－21min研究發(fā)現(xiàn)，與本底相比，25℃放置6h該菌的相對(duì)危險(xiǎn)性可增加30倍；25℃放置10h可增加30000倍。2004年2月FAO/WHO在日內(nèi)瓦召開(kāi)的PIF中ES專(zhuān)家研討會(huì)上提出PIF中微量的ES（＜3CFU/100g）污染也能導(dǎo)致感染的發(fā)生。12第二部分：致病性易感人群主要感染渠道配方粉中ES的污染狀況PIF中ES的來(lái)源及中毒發(fā)生的原因13一、易感人群嬰兒：腦膜炎壞死性小腸結(jié)腸炎菌血癥嚴(yán)重的神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥高危人群：主要是嬰兒，新生兒、尤其是早產(chǎn)兒、低出生體重等免疫力低下的嬰兒。死亡率：50%，20-50%成人：局部感染、菌血癥、術(shù)后骨髓炎等14二、主要感染渠道！??！乳品安全標(biāo)準(zhǔn)（報(bào)批稿）《嬰兒配方食品》《特殊醫(yī)學(xué)用途配方食品》0-6個(gè)月齡15第三部分

食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗(yàn)阪崎腸桿菌檢驗(yàn)本標(biāo)準(zhǔn)修改采用ISO/TS22964（1stedition2006-02-01）Milkandmilkproducts—DetectionofEnterobactersakazakiiFDAJuly2002;RevisedAugust2002IsolationandEnumerationofEnterobactersakazakiifromDehydratedPowderedInfantFormula17第一法：阪崎腸桿菌的檢驗(yàn)

第二法：阪崎腸桿菌的計(jì)數(shù)

18第一法

阪崎腸桿菌的檢驗(yàn)19阪崎腸桿菌檢驗(yàn)程序報(bào)告生化鑒定挑取黃色菌落DFI瓊脂36℃±1℃，24h±2h挑取藍(lán)綠色菌落1mL+mLST-Vm10mL44℃±0.5℃，24h±2h檢樣100g/mL+BPW稀釋液900mL36℃±1℃，18h±2h前增菌選擇性增菌選擇性分離生化鑒定TSA25℃±1℃，48h±4h5.1前增菌和增菌BPW（合適時(shí)可選擇無(wú)菌水）左圖：未混合；右圖：混合后。21mLST-VmmLST-Vm，即在大腸菌群增菌肉湯LST中另加入適量的NaCl和Vm。研究證明與其他腸桿菌科細(xì)菌（如沙門(mén)菌屬、大腸埃希氏菌等）相比，ES具有較高的耐滲透壓能力。加入0.5M的NaCl在保證ES良好生長(zhǎng)的同時(shí)，可以有效地抑制上述其他細(xì)菌的生長(zhǎng)。Vm可有效地抑制G+菌的生長(zhǎng)。而較高的生長(zhǎng)溫度可以進(jìn)一步抑制其他細(xì)菌的生長(zhǎng)。225.2分離顯色培養(yǎng)基的基本原理相似，二者都是根據(jù)ES能產(chǎn)生α-葡萄糖苷酶，分解底物XaGlc產(chǎn)生有色菌落。23顯色培養(yǎng)基對(duì)ES的選擇性較好，ES形成的特征性菌落易于辨認(rèn)，以DFI為例：硫化氫指示劑可以區(qū)分ES和產(chǎn)生少量α-葡萄糖苷酶但H2S陽(yáng)性菌株（如普通變形桿菌）。ES都可以在該平板上生長(zhǎng)并產(chǎn)生藍(lán)綠色菌落其他常見(jiàn)菌在DFI平板的菌落顏色白色菌落：肺炎克雷伯氏菌、陰溝腸桿菌、大腸埃希氏菌、泛菌屬的多種菌等黃色菌落：赫氏埃希氏菌黑褐色、粉色或中心藍(lán)綠菌落：少量菌種ESIA:藍(lán)色，1-3mm國(guó)產(chǎn)顯色培養(yǎng)基2426TSA：25℃培養(yǎng)后典型ES：黃色陰性對(duì)照E.coliATCC25922：白色菌落27黃色素5.3鑒定（生化反應(yīng)）29商業(yè)生化鑒定系統(tǒng)的應(yīng)用推薦使用的ES生化鑒定方法有很多，主要有API20E，ID32E，BiologGN2MicroPlate，VITEKGNI+等。上述方法都比較成熟，穩(wěn)定性較好，已被許多國(guó)家和組織的標(biāo)準(zhǔn)采用。在腸桿菌的生化鑒定中使用最廣泛的是API20E和VitekGNI+。30API20E生化鑒定板典型生化反應(yīng)圖示31第二法

阪崎腸桿菌的計(jì)數(shù)323管MPN法337.1樣品的稀釋7.1.1固體和半固體樣品：無(wú)菌稱(chēng)取樣品100g、10g、1g各三份，加入已預(yù)熱至44℃分別盛有900mL、90mL、9mLBPW中，輕輕振搖使充分溶解，制成1:10樣品勻液，置36℃±1℃培養(yǎng)18h±2h。分別移取1mL轉(zhuǎn)種于10mLmLST-Vm肉湯，44℃±0.5℃培養(yǎng)24h±2h。7.1.2液體樣品：以無(wú)菌吸管分別取樣品100mL、10mL、1mL各三份，加入已預(yù)熱至44℃分別盛有900mL、90mL、9mLBPW中，輕輕振搖使充分混勻，制成1:10樣品勻液，置36℃±1℃培養(yǎng)18h±2h。分別移取1mL轉(zhuǎn)種于10mLmLST-Vm肉湯，44℃±0.5℃培養(yǎng)24h±2h。7.2分離、鑒定:同5.2，5.3。8結(jié)果與報(bào)告綜合菌落形態(tài)、生化特征，根據(jù)證實(shí)為阪崎腸桿菌的陽(yáng)性管數(shù)，查MPN檢索表，報(bào)告每100g（mL）樣品中阪崎腸桿菌的MPN值（見(jiàn)附錄Ｂ中表B.1