細(xì)胞增殖檢查操作SOP編號：SOP-ZL001-00頁碼：1\4版本號：01修訂號：00機(jī)密等級：秘密起草人起草日期頒發(fā)部門質(zhì)量管理部審核人審核日期批準(zhǔn)人批準(zhǔn)日期生效日期分發(fā)清單研發(fā)部[]質(zhì)量管理部[]綜合管理部[]生產(chǎn)管理部[]市場銷售部[]財(cái)務(wù)部[]目的為了規(guī)范細(xì)胞培養(yǎng)崗位人員在新生牛血清支持細(xì)胞增殖檢查過程中的標(biāo)準(zhǔn)操作。適用范圍本規(guī)程適用新生牛血清支持細(xì)胞增殖檢查。職責(zé)3.1．細(xì)胞培養(yǎng)崗位人員：負(fù)責(zé)嚴(yán)格按照本標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程進(jìn)行操作。3.2．細(xì)胞組長：檢查細(xì)胞組人員的生產(chǎn)操作情況，確保操作的正確性。3.3．質(zhì)量管理員：監(jiān)督、檢查本文件的執(zhí)行情況。術(shù)語無材料及設(shè)備5.1高壓蒸汽滅菌物品：250mL瓶、500ml瓶、3L瓶、10ml吸管、橡膠塞、分裝管道、C級潔凈服級口罩。5.2消毒劑：1﹪（ml/ml）來蘇兒、5﹪（ml/ml）來蘇兒、1‰（ml/ml）新潔爾滅、5‰（ml/ml）新潔爾滅。5.3無菌液體：0.25%胰蛋白酶、8.0%（g/ml）碳酸氫鈉、對照新生牛血清、待檢新生牛血清、3.0%谷氨酰胺、E-MEM培養(yǎng)基。5.4設(shè)備、設(shè)施：確認(rèn)設(shè)備、設(shè)施處于清潔完好狀態(tài)，并在驗(yàn)證有效期內(nèi)。5.5其他物品：止血鉗、斜面架、吸球、醫(yī)用手套。6內(nèi)容6.1第一次細(xì)胞傳代6.1.1生產(chǎn)前檢查6.1.1.1工作環(huán)境確認(rèn)：細(xì)胞制備間：在C級局部A級潔凈區(qū)內(nèi)進(jìn)行，溫度控制在15～26℃,相對濕度控制在30～70%，。確認(rèn)場地清場合格，無上批次生產(chǎn)遺留物，將清場合格證貼在本批次記錄內(nèi)。6.1.1.2設(shè)備、設(shè)施確認(rèn)：（1）按照《倒置顯微鏡使用、清潔、維護(hù)保養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程》確認(rèn)倒置顯微鏡處于完好狀態(tài)。（2）按照《培養(yǎng)箱管理標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程（使用、清潔消毒、維護(hù)、保養(yǎng)）》確認(rèn)培養(yǎng)箱運(yùn)行狀態(tài)良好。（4）按照《轉(zhuǎn)瓶機(jī)使用、清潔、維護(hù)保養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程》確認(rèn)轉(zhuǎn)瓶機(jī)處于完好狀態(tài)。（5）按照《潔凈工作臺(tái)使用、清潔、維護(hù)保養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程》確認(rèn)層流罩處于完好狀態(tài)。（6）確認(rèn)上述設(shè)備、設(shè)施均在清潔、消毒有效期內(nèi)。6.1.1.3文件記錄檢查確認(rèn)本操作標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程、輔助記錄和所用的標(biāo)簽、狀態(tài)卡已經(jīng)到位。6.1.1.4消毒劑確認(rèn)確認(rèn)1‰新潔爾滅、5‰新潔爾滅、1﹪來蘇兒水和5﹪來蘇兒水的批號和有效期。6.1.2操作前準(zhǔn)備：按照規(guī)程要求準(zhǔn)備相應(yīng)物品。6.1.2.1無菌液體確認(rèn)：從低溫冰箱中取出3.0%谷氨酰胺、對照新生牛血清、待檢新生牛血清、核實(shí)名稱、來源、批號、有效期后放入液體融化間待用；8.0%（g/ml）碳酸氫鈉、E-MEM培養(yǎng)基核對名稱，批號，有效期；所有無菌液體瓶用1‰（ml/ml）新潔爾滅或1﹪（ml/ml）來蘇兒水擦外表面，經(jīng)緩沖間進(jìn)入C級區(qū)。6.1.2.2細(xì)胞確認(rèn)：確認(rèn)細(xì)胞代次、瓶型、數(shù)量及日齡及生長情況。6.1.3生產(chǎn)操作6.1.3.1液體配制操作前30分鐘打開層流罩，日光燈。（1）消化液：以400ml體積裝量的濃度為0.25﹪胰蛋白酶為基質(zhì)液，加入2.0﹪（ml/ml）（8.0﹪碳酸氫鈉），蓋橡膠塞搖勻待用。（2）生長液：86.9﹪（ml/ml）E-MEM+10﹪（ml/ml）對照新生牛血清（或待檢新生牛血清）+0.9﹪（ml/ml）（3.0﹪谷氨酰胺）+2.2﹪（ml/ml）（8.0﹪碳酸氫鈉）。按配方計(jì)算出配置一定體積的復(fù)蘇液所需E-MEM、3.0﹪谷氨酰胺、8.0﹪碳酸氫鈉、對照新生牛血清及待檢新生牛血清的體積；用10ml吸管抽取對應(yīng)體積的各種液體加入E-MEN培養(yǎng)基中，蓋橡膠塞搖勻待用。6.1.3.2消化：棄3L瓶內(nèi)生長液，每3L瓶加20～30ml消化液，置轉(zhuǎn)瓶機(jī)上，調(diào)整轉(zhuǎn)數(shù)為70～90轉(zhuǎn)/小時(shí)，待細(xì)胞面呈松散狀時(shí)棄消化液。6.1.3.3傳代：將消化好的細(xì)胞加入生長液，每3L瓶加入200ml生長液懸浮細(xì)胞，搖動(dòng)3L瓶，使細(xì)胞從瓶壁上脫落懸入生長液中，按1：4分種率將細(xì)胞懸液分種于其它3L瓶中,每個(gè)3L瓶補(bǔ)加生長液至400ml～600ml。6.1.3.4培養(yǎng)：將3L瓶內(nèi)細(xì)胞懸液沿瓶壁搖勻，置轉(zhuǎn)瓶機(jī)上旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)，轉(zhuǎn)數(shù)20～30轉(zhuǎn)/小時(shí)，將轉(zhuǎn)瓶機(jī)置于37℃±0.5℃恒溫室培養(yǎng)，注明細(xì)胞代次、傳代日期、待檢血清和對照血清的批號及廠家。6.1.3.5操作過程中出現(xiàn)偏差的情況按照《偏差管理標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程》進(jìn)行處理。6.1.4清場：6.1.4.1在生產(chǎn)完成后清場操作前需在房間門上懸掛“待處理”標(biāo)志牌，關(guān)閉層流罩，日光燈。6.1.4.2按《生產(chǎn)區(qū)清場、清潔、消毒管理標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程》對操作區(qū)域進(jìn)行清潔、消毒。6.1.4.3集液槽用5‰（ml/ml）新潔爾滅或5﹪（ml/ml）來蘇兒溶液清洗消毒及液封。6.1.4.4廢棄物裝袋放固定位置送出。6.1.4.5按要求正確懸掛狀態(tài)標(biāo)識。6.1.5待檢血清培養(yǎng)細(xì)胞觀察觀察細(xì)胞形態(tài)是否為典型成纖維狀細(xì)胞、細(xì)胞是否貼壁、伸展連網(wǎng)、有無污染以及是否光亮透明。于傳代后第一天、第四天及第六天各觀察一次，并記載。6.1.6及時(shí)填寫《新生牛血清支持細(xì)胞增殖檢查記錄》。6.2第二次細(xì)胞傳代6.2.1生產(chǎn)前檢查6.2.1.1工作環(huán)境確認(rèn)：細(xì)胞制備間：在C級局部A級潔凈區(qū)內(nèi)進(jìn)行，溫度控制在15～26℃,相對濕度控制在30～70%，。確認(rèn)場地清場合格，無上批次生產(chǎn)遺留物，將清場合格證貼在本批次記錄內(nèi)。6.2.1.2設(shè)備、設(shè)施確認(rèn)：（1）按照《層流罩使用、清潔、維護(hù)保養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程》確認(rèn)層流罩處于完好狀態(tài)。（2）按照《倒置顯微鏡使用、清潔、維護(hù)保養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程》確認(rèn)倒置顯微鏡處于完好狀態(tài)。（3）按照《恒溫室管理標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程（使用、清潔消毒、維護(hù)、保養(yǎng)）》確認(rèn)恒溫室運(yùn)行狀態(tài)良好。（4）按照《轉(zhuǎn)瓶機(jī)使用、清潔、維護(hù)保養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程》確認(rèn)轉(zhuǎn)瓶機(jī)處于完好狀態(tài)。（5）確認(rèn)上述設(shè)備、設(shè)施均在清潔、消毒有效期內(nèi)。6.2.1.3文件記錄檢查確認(rèn)本操作標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程、輔助記錄和所用的標(biāo)簽、狀態(tài)卡已經(jīng)到位。6.2.1.4消毒劑確認(rèn)6.2.2操作前準(zhǔn)備：按照規(guī)程要求準(zhǔn)備相應(yīng)物品。6.2.2.1無菌液體確認(rèn)：從低溫冰庫中取出3.0%谷氨酰胺、對照新生牛血清、待檢新生牛血清、核實(shí)名稱、來源、批號、有效期后放入液體融化間待用；8.0%（g/ml）碳酸氫鈉、E-MEM培養(yǎng)基核對名稱，批號，有效期；所有無菌液體瓶用1‰（ml/ml）新潔爾滅或1﹪（ml/ml）來蘇兒水擦外表面，經(jīng)緩沖間進(jìn)入C級區(qū)。6.2.2.2細(xì)胞種子確認(rèn)：確認(rèn)細(xì)胞代次、瓶型、數(shù)量及日齡及生長情況。6.2.3生產(chǎn)操作6.2.3.1液體配制操作前30分鐘打開層流罩，日光燈。（1）消化液：以400ml體積裝量的濃度為0.25﹪胰蛋白酶為基質(zhì)液，加入2.0﹪（ml/ml）（8.0﹪碳酸氫鈉），蓋橡膠塞搖勻待用。（2）生長液：86.9﹪（ml/ml）E-MEM+10﹪（ml/ml）對照新生牛血清（或待檢新生牛血清）+0.9﹪（ml/ml）（3.0﹪谷氨酰胺）+2.2﹪（ml/ml）（8.0﹪碳酸氫鈉）。按配方計(jì)算出配置一定體積的復(fù)蘇液所需E-MEM、3.0﹪谷氨酰胺、8.0﹪碳酸氫鈉、對照新生牛血清及待檢新生牛血清的體積；用10ml吸管抽取對應(yīng)體積的各種液體加入E-MEN培養(yǎng)基中，蓋橡膠塞搖勻待用。6.2.3.2消化：棄3L瓶內(nèi)生長液，每3L瓶加20～30ml消化液，置轉(zhuǎn)瓶機(jī)上，調(diào)整轉(zhuǎn)數(shù)為70～90轉(zhuǎn)/小時(shí)，待細(xì)胞面呈松散狀時(shí)棄消化液。6.2.3.3傳代：將消化好的細(xì)胞加入生長液，每3L瓶加入200ml生長液懸浮細(xì)胞，搖動(dòng)3L瓶，使細(xì)胞從瓶壁上脫落懸入生長液中，按1：4分種率將細(xì)胞懸液分種于其他3L瓶中，每個(gè)3L瓶補(bǔ)加生長液至400ml～600ml。6.2.3.4培養(yǎng)：將3L瓶內(nèi)細(xì)胞懸液沿瓶壁搖勻，置轉(zhuǎn)瓶機(jī)上旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)，轉(zhuǎn)數(shù)20～30轉(zhuǎn)/小時(shí)，將轉(zhuǎn)瓶機(jī)置于37℃±0.5℃恒溫室培養(yǎng)，轉(zhuǎn)瓶機(jī)上貼好標(biāo)簽，注明細(xì)胞代次、傳代日期、待檢血清和對照血清的批號及廠家。6.2.3.5操作過程中出現(xiàn)偏差的情況按照《偏差管理標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程》進(jìn)行處理。6.2.4清場：6.2.4.1在生產(chǎn)完成后清場操作前需在房間門上懸掛“待處理”標(biāo)志牌，關(guān)閉日光燈。6.2.4.2按《生產(chǎn)區(qū)清場、清潔、消毒管理標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程》對操作區(qū)域進(jìn)行清潔、消毒。6.2.4.3集液槽用5‰（ml/ml）新潔爾滅或5﹪（ml/ml）來蘇兒溶液清洗消毒及液封。6.2.4.4廢棄物裝袋放固定位置送出。6.2.4.5按要求正確懸掛狀態(tài)標(biāo)識。6.2.5待檢血清培養(yǎng)細(xì)胞觀察觀察細(xì)胞形態(tài)是否為典型成纖維狀細(xì)胞、細(xì)胞是否貼壁、伸展連網(wǎng)、有無污染以及是否光亮透明。于傳代后第一天、第四天及第六天各觀察一次，并作詳細(xì)記錄。6.2.6及時(shí)填寫《新生牛血清支持細(xì)胞增殖檢查記錄》。6.3第三次細(xì)胞傳代6.3.1生產(chǎn)前檢查6.3.1.1工作環(huán)境確認(rèn)：細(xì)胞制備間（一）在C級局部A級潔凈區(qū)內(nèi)進(jìn)行，溫度控制在15～26℃,相對濕度控制在30～70%，相對壓差≥5Pa。確認(rèn)場地清場合格，無上批次生產(chǎn)遺留物，將清場合格證貼在本批次記錄內(nèi)。6.3.1.2設(shè)備、設(shè)施確認(rèn)：（1）按照《層流罩使用、清潔、維護(hù)保養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程》確認(rèn)層流罩處于完好狀態(tài)。（2）按照《倒置顯微鏡使用、清潔、維護(hù)保養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程》確認(rèn)倒置顯微鏡處于完好狀態(tài)。（3）按照《恒溫室管理標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程（使用、清潔消毒、維護(hù)、保養(yǎng)）》確認(rèn)恒溫室運(yùn)行狀態(tài)良好。（4）按照《轉(zhuǎn)瓶機(jī)使用、清潔、維護(hù)保養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程》確認(rèn)轉(zhuǎn)瓶機(jī)處于完好狀態(tài)。（5）確認(rèn)上述設(shè)備、設(shè)施均在清潔、消毒有效期內(nèi)。6.3.1.3文件記錄檢查確認(rèn)本操作標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程、輔助記錄和所用的標(biāo)簽、狀態(tài)卡已經(jīng)到位。6.3.1.4消毒劑確認(rèn)確認(rèn)1‰新潔爾滅、5‰新潔爾滅、1﹪來蘇兒水和5﹪來蘇兒水的批號和有效期。6.3.2操作前準(zhǔn)備：按照規(guī)程要求準(zhǔn)備相應(yīng)物品。6.3.2.1無菌液體確認(rèn)：從低溫冰庫中取出3.0%谷氨酰胺、對照新生牛血清、待檢新生牛血清、核實(shí)名稱、來源、批號、有效期后放入液體融化間待用；8.0%（g/ml）碳酸氫鈉、E-MEM培養(yǎng)基核對名稱，批號，有效期；所有無菌液體瓶用1‰（ml/ml）新潔爾滅或1﹪（ml/ml）來蘇兒水擦外表面，經(jīng)緩沖間進(jìn)入C級區(qū)。6.3.2.2細(xì)胞種子確認(rèn)：確認(rèn)細(xì)胞代次、瓶型、數(shù)量及日齡及生長情況。6.3.3生產(chǎn)操作液體配制6.3.3.1操作前30分鐘打開層流罩，日光燈。（1）消化液：以400ml體積裝量的濃度為0.25﹪的胰蛋白酶消化液為基質(zhì)液，加入2.0﹪（ml/ml）（8.0﹪碳酸氫鈉），蓋橡膠塞搖勻待用。（2）生長液：86.9﹪（ml/ml）E-MEM+10﹪（ml/ml）對照新生牛血清（或待檢新生牛血清）+0.9﹪（ml/ml）（3.0﹪谷氨酰胺）+2.2﹪（ml/ml）（8.0﹪碳酸氫鈉）。按配方計(jì)算出配置一定體積的復(fù)蘇液所需E-MEM、3.0﹪谷氨酰胺、8.0﹪碳酸氫鈉、對照新生牛血清及待檢新生牛血清的體積；用10ml吸管抽取對應(yīng)體積的各種液體加入E-MEN培養(yǎng)基中，蓋橡膠塞搖勻待用。6.3.3.2消化：棄3L瓶內(nèi)生長液，每3L瓶加20～30ml消化液，置轉(zhuǎn)瓶機(jī)上，調(diào)整轉(zhuǎn)數(shù)為70～90轉(zhuǎn)/小時(shí)，待細(xì)胞面呈松散狀時(shí)棄消化液。7.3.3.3傳代：將消化好的細(xì)胞加入生長液，每3L瓶加入200ml生長液懸浮細(xì)胞，搖動(dòng)3L瓶，使細(xì)胞從瓶壁上脫落懸入生長液中，按1：4分種率將細(xì)胞懸液分種于其他3L瓶中，每個(gè)3L瓶補(bǔ)加生長液至400ml～600ml。6.3.3.4培養(yǎng)：將3L瓶內(nèi)細(xì)胞懸液沿瓶壁搖勻，置轉(zhuǎn)瓶機(jī)上旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)，轉(zhuǎn)數(shù)20～30轉(zhuǎn)/小時(shí)，將轉(zhuǎn)瓶機(jī)置于37℃±0.5℃恒溫室培養(yǎng)，轉(zhuǎn)瓶機(jī)上貼好標(biāo)簽，注明細(xì)胞代次、傳代日期、待檢血清和對照血清的批號及廠家。6.3.3.5操作過程中出現(xiàn)偏差的情況按照《偏差管理標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程》進(jìn)行處理。6.3.4清場：6.3.4.1在生產(chǎn)完成后清場操作前需在房間門上懸掛“待處理”標(biāo)志牌，關(guān)閉層流罩，日光燈。6.3.4.2按《生產(chǎn)區(qū)清場、清潔、消毒管理標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程》對操作區(qū)域進(jìn)行清潔、消毒。6.3.4.3集液槽用5‰（ml/ml）新潔爾滅或5﹪（ml/ml）來蘇兒溶液清洗消毒及液封。6.3.4.4廢棄物裝袋放固定位置送出。6.3.4.5按要求正確懸掛狀態(tài)標(biāo)識。6.3.5待檢血清培養(yǎng)細(xì)胞觀察觀察細(xì)胞形態(tài)是否為典型成纖維狀細(xì)胞、細(xì)胞是否貼壁、伸展連網(wǎng)、有無污染以及是否光亮透明。于傳代后第一天、第四天及第六天各觀察一次，并作詳細(xì)記錄。6.3.6及時(shí)填寫《新生牛血清支持細(xì)胞增殖檢查記錄》6.4第四次細(xì)胞計(jì)數(shù)6.4.1生產(chǎn)前檢查6.4.1.1工作環(huán)境確認(rèn)：細(xì)胞制備間（一）：在C級局部A級潔凈區(qū)內(nèi)進(jìn)行，溫度控制在15～26℃,相對濕度控制在30～70%，相對壓差≥5Pa。確認(rèn)場地清場合格，無上批次生產(chǎn)遺留物，將清場合格證貼在本批次記錄內(nèi)。6.4.1.2設(shè)備、設(shè)施確認(rèn)：（1）按照《層流罩使用、清潔、維護(hù)保養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程》確認(rèn)層流罩處于完好狀態(tài)。（2）按照《倒置顯微鏡使用、清潔、維護(hù)保養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程》確認(rèn)倒置顯微鏡處于完好狀態(tài)。（3）按照《恒溫室管理標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程（使用、清潔消毒、維護(hù)、保養(yǎng)）》確認(rèn)恒溫室運(yùn)行狀態(tài)良好。（4）確認(rèn)上述設(shè)備、設(shè)施均在清潔、消毒有效期內(nèi)。6.4.1.3文件記錄檢查確認(rèn)本操作標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程、輔助記錄和所用的標(biāo)簽、狀態(tài)卡已經(jīng)到位。6.4.1.4消毒劑確認(rèn)確認(rèn)1‰新潔爾滅、5‰新潔爾滅、1﹪來蘇兒水和5﹪來蘇兒水的批號和有效期。6.4.2操作前準(zhǔn)備：按照規(guī)程要求準(zhǔn)備相關(guān)物品。6.4.2.1無菌液體確認(rèn)：從低溫冰庫中取出3.0%谷氨酰胺、對照新生牛血清、待檢新生牛血清、核實(shí)名稱、來源、批號、有效期后放入液體融化間待用；8.0%（g/ml）碳酸氫鈉、E-MEM培養(yǎng)基核對名稱，批號，有效期；所有無菌液體瓶用1‰（ml/ml）新潔爾滅或1﹪（ml/ml）來蘇兒水擦外表面，經(jīng)緩沖間進(jìn)入C級區(qū)。6.4.2.2細(xì)胞種子確認(rèn)：確認(rèn)細(xì)胞代次、瓶型、數(shù)量及日齡及生長情況。6.4.3生產(chǎn)操作6.4.3.1液體配制操作前30分鐘打開層流罩，日光燈。（1）消化液：以400ml體積裝量的濃度為0.25﹪胰蛋白酶為基質(zhì)液，加入2.0﹪（ml/ml）（8.0﹪碳酸氫鈉），蓋橡膠塞搖勻待用。（2）生長液：86.9﹪（ml/ml）E-MEM+10﹪（ml/ml）對照新生牛血清（或待檢新生牛血清）+0.9﹪（ml/ml）（3.0﹪谷氨酰胺）+2.2﹪。（ml/ml）（8.0﹪碳酸氫鈉）按配方計(jì)