基因定位或基因制圖(genemapping)：人類的基因定位或基因制圖(genemapping)是近年來(lái)發(fā)展最快的領(lǐng)域之一。它的目的在于決定不同的基因在染色體上的位置。一條染色體是一條獨(dú)立的DNA鏈，同一條染色體上的基因在該染色體上呈線性排列。人類的20000-25000個(gè)基因分布在24種染色體上，它們?cè)谌旧w上的位置可通過(guò)兩種制圖方法來(lái)表示：

1、物理圖譜(physicalmap)，即確定基因之間的絕對(duì)物理學(xué)距離，通常用Mb(百萬(wàn)堿基對(duì))或Kb(千堿基對(duì))來(lái)表示

2、遺傳圖譜(geneticmap)，即確定基因之間的遺傳學(xué)距離，用cM(Centimorgen分摩)表示。定義基因克?。夯蚩寺⊥ǔＩ婕暗綄?gòu)成某一基因的基因組DNA(genomicDNA,gDNA)或互補(bǔ)DNA(complementaryDNA,cDNA)插入某一載體內(nèi)，利用載體在宿主細(xì)胞(通常用大腸桿菌)中大量繁殖而獲得該基因的足夠量的拷貝，以便于進(jìn)行基因的結(jié)構(gòu)和功能的分析，廣義的基因克隆也包括任何使基因或DNA片段擴(kuò)增的操作?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)最重要的目的就是確定某一基因突變與某一疾病之間的因果關(guān)系，了解其致病機(jī)理，為疾病的診斷、預(yù)防和治療提供理論依據(jù)。而確定某一基因突變與某一疾病之間的因果關(guān)系的最重要的手段之一就是致病基因的克隆?；蚨ㄎ环椒?/p>

strategyforgenemapping染色體多態(tài)法（chromosomeheteromorphism）染色體畸變法(chromosomeabnormality)體細(xì)胞雜種法(somaticcellhybrids)染色體分類法(chromosomesorting)原位雜交法（FISH）劑量分析法(dosageananlysis)測(cè)序法（sequencing）家系分析法（pedigreeananlysis）染色體多態(tài)法僅限于X染色體上的定位，根據(jù)某些性狀或疾病在男女性別間的差異，結(jié)合系譜分析，將這些基因定位在X染色體上。Duffy血型基因定位于1號(hào)染色體上，這是人類第一次將某一特定的基因定位在常染色體上。染色體畸變法畸變常涉及兩個(gè)位點(diǎn)，如果這兩個(gè)位點(diǎn)之一正好是某一功能基因所在的位置，染色體的畸變則肯破壞該基因的正常功能而引起疾病，根據(jù)染色體畸變的位置和疾病發(fā)生的關(guān)系，則可將致病基因定位于染色體的某一特定位置上。如DMD基因的定位Xp21。染色體異常進(jìn)行基因定位---睪丸決定因子Testisdeterminingfactor體細(xì)胞雜種法體細(xì)胞雜種通常由人和鼠的體細(xì)胞融合而成。融合細(xì)胞在最初幾代培養(yǎng)過(guò)程中選擇性丟失人類染色體，而保留所有的鼠染色體。保留在融合細(xì)胞中的染色體可以是多條，也可能只有一條甚至某條染色體的一部分。根據(jù)研究的需要可將含有不同人類染色體的人鼠雜種細(xì)胞組合成人鼠雜種細(xì)胞板(hybridpanel)，結(jié)合雜種細(xì)胞板和PCR的方法或基因劑量分析，或蛋白質(zhì)表達(dá)分析，可將相應(yīng)的基因定位到特定的染色體或染色體片段上，該雜種細(xì)胞板在人類基因定位以及人類基因組計(jì)劃中發(fā)揮過(guò)重要的作用。原位雜交法（FISH）如果一個(gè)基因或基因的某一部分已經(jīng)被克隆，則可將該基因用同位素或熒光標(biāo)記和染色體原位的分子雜交，在染色體上恒定出現(xiàn)信號(hào)的區(qū)域即該基因在染色體上的位置。同一染色體上的多個(gè)不同的基因可用不同的熒光標(biāo)記來(lái)鑒別他們?cè)谌旧w上的相對(duì)位置，運(yùn)用這一方法在中期染色體上，可區(qū)分兩個(gè)相隔約2Mb的基因；在間期染色體上，據(jù)稱可鑒別僅相隔50kb的兩個(gè)基因。CONNEXIN31.1除性染色體外，每個(gè)人體內(nèi)的染色體都有兩份。一個(gè)人所擁有的一對(duì)等位位點(diǎn)的類型被稱作基因型（genotype）對(duì)SNP位點(diǎn)而言，一個(gè)人有三種可能性，分別是AA，AG或GG。這種基因型的差異叫做單核苷酸多態(tài)性（SNP）通過(guò)實(shí)驗(yàn)確定某個(gè)個(gè)體在某個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)的基因型，被稱作基因分型基因分型（Genotyping）幾種多態(tài)標(biāo)記:（1）RFLPs（2）STRPs（3）SNPs第一代標(biāo)記：RFLP（restrictionfragmentlengthpolymorphism）限制性內(nèi)切酶可在特定的核苷酸位置切割DNA。DNA序列的改變甚至是一個(gè)堿基的改變，都可能改變限制性內(nèi)切酶酶切片段的長(zhǎng)度，通過(guò)凝膠電泳可以方便地檢測(cè)這種長(zhǎng)度的“多態(tài)性”。RFLP在整個(gè)基因組中都存在，根據(jù)對(duì)RFLP片段的多態(tài)性分析，可對(duì)某些疾病進(jìn)行診斷并將與疾病有關(guān)的基因進(jìn)行定位。1980年，Botstein首次提出。使用特殊的外切酶切斷DNA中特殊位點(diǎn)1987年，第一張較完整的人基因連鎖圖，包含393個(gè)RFLP位點(diǎn)。缺點(diǎn)：數(shù)目少，信息量小；成本昂貴，操作繁瑣，不易發(fā)展到自動(dòng)化水平。第二代標(biāo)記：STR(shorttandemrepeatpolymorphism)

例如基因組中兩個(gè)或兩個(gè)以上的核苷酸短串聯(lián)重復(fù)序列(CA)n，微衛(wèi)星標(biāo)記等，在不同個(gè)體中重復(fù)單位的數(shù)目變異非常大。微衛(wèi)星標(biāo)記熒光電泳圖STR廣泛存在于人基因組，占約5%，基本單位是2bp-6bp的串聯(lián)重復(fù)，其中以(CA)n，(GT)n常見。1996年建立了以6000多個(gè)STR為主體的遺傳圖譜，目前有10000個(gè)左右的位點(diǎn)。主要用于個(gè)體識(shí)別優(yōu)點(diǎn)：信息量大；易實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化。缺點(diǎn)：標(biāo)記數(shù)量不夠多第三代遺傳標(biāo)記：SNP（單核苷酸多態(tài)性）隨著人類基因組計(jì)劃、國(guó)際人類基因組單體型計(jì)劃（Hapmap計(jì)劃）的完成，大量的SNP被發(fā)現(xiàn)。利用先進(jìn)的高通量基因芯片技術(shù)，精確揭示重大疾病的基因變異，從而闡明疾病的遺傳學(xué)發(fā)病機(jī)制，是目前科學(xué)界公認(rèn)的最為有效的搜尋重大疾病易感基因的研究方法，被Science雜志評(píng)為2007年十大科學(xué)進(jìn)展之首。迄今已發(fā)現(xiàn)的SNP約900～1,000萬(wàn)個(gè)特點(diǎn)：數(shù)量豐富雙等位標(biāo)記，簡(jiǎn)單的+/-分析根據(jù)結(jié)果可以估算出某個(gè)等位基因在一個(gè)群體中的頻率易于實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化，快速篩查SNP作為遺傳標(biāo)記的優(yōu)勢(shì)家系分析法基本原理：連鎖分析(Linkageanalysis)RFLP、STR、SNP、等。基本的遺傳現(xiàn)象—染色體的交換重組在基因病研究中，常用遺傳分析都是建立在一種生物現(xiàn)象——染色體重組基礎(chǔ)之上的。染色體上的兩個(gè)位點(diǎn)間相距越遠(yuǎn)，重組幾率越大。我們可以根據(jù)標(biāo)記位點(diǎn)與疾病位點(diǎn)間的重組率估算出兩者間的遺傳距離及連鎖程度。在家系中，重組率是進(jìn)行連鎖分析的基礎(chǔ)；123Lodscore的計(jì)算Lod>3肯定連鎖，Lod<-2否定連鎖，

-2<Lod<1則還需增加樣本資料。遺傳病致病基因克隆目標(biāo)：現(xiàn)階段的所謂致病基因的克隆實(shí)質(zhì)上已不是傳統(tǒng)意義上的基因克隆而主要是致病基因的鑒定，即將某一特定基因的突變與某一特定的疾病聯(lián)系起來(lái)。

策略：表達(dá)克隆(expressioncloning)、CpG島(CpGisland)、外顯子捕獲(exontrapping)、gDNA或cDNA消減雜交(gDNAorcDNAsubtractivehybridization)、Zooblot、同源序列(homologoussequence)、染色體顯微切割與顯微克隆(microdissectionandmicrocloning)、雜交篩選(functionalcloning)、等位基因補(bǔ)救(allelicrescue)、候選基因(candidategene)和位置克隆法(positionalcloning)位置克?。耗壳白畛Ｓ玫姆椒?，將某一疾病的致病基因用連鎖分析的方法定位在某一染色體的特定位置上或區(qū)域內(nèi)，然后在該位置上或區(qū)域內(nèi)鑒定其致病基因。候選克?。焊鶕?jù)基因的功能、結(jié)構(gòu)及已有的研究發(fā)現(xiàn)，預(yù)測(cè)可能與目的新基因有關(guān)的疾病，然后在相應(yīng)患者中檢測(cè)該基因的突變情況?；蚣易濉钸x疾病基因克隆策略：是利用人類基因組研究所提供的資料，根據(jù)生物進(jìn)化的觀點(diǎn)，首先在計(jì)算機(jī)上利用各種生物信息學(xué)軟件和數(shù)據(jù)庫(kù)完成基因的模擬克隆，然后用實(shí)驗(yàn)證明并克隆出該基因。遺傳性多發(fā)性外生性骨疣病致病基因克隆遺傳性多發(fā)性外生性骨疣患者膝關(guān)節(jié)遺傳性多發(fā)性外生性骨疣患者膝關(guān)節(jié)X光檢查EXT1的克隆EXT1被定位于8q24.1發(fā)現(xiàn)了1個(gè)染色體異常的家系縮小了EXT1的定位區(qū)間找出區(qū)間內(nèi)的基因突變檢測(cè)EXT2的克隆EXT1基因同源分析發(fā)現(xiàn)了相似序列位于Chr11文庫(kù)篩選、RACE技術(shù)克隆EXT2基因在HME家系中進(jìn)行突變檢測(cè)發(fā)現(xiàn)致病突變M0309的EXT2基因的PCR檢測(cè)患者M(jìn)0661和M0662的EXT2基因的PCR-SSCP檢測(cè)一個(gè)常染色體顯性遺傳

角膜環(huán)狀皮樣瘤家系

疾病基因的定位與克隆

角膜環(huán)狀皮樣瘤是一種先天性角膜良性腫瘤，呈常染色體顯性遺傳，以雙側(cè)眼球角膜緣處環(huán)形淡黃色腫塊為特征，可延伸到結(jié)膜，患者可出現(xiàn)視力的改變?nèi)缛跻?、斜視和散光。皮樣瘤由外胚層包括角化的上皮、毛發(fā)、皮脂腺和中胚層包括纖維組織、脂肪組織、血管組成中國(guó)湖南角膜環(huán)狀皮樣瘤家系圖共有4代，57人，患者21人DNA抽提利用STR引物多重PCRGenotype基因分型Linkage連鎖分析侯選基因，突變檢測(cè)定位基因基因組掃描流程使用PE公司一套覆蓋基因組22條常染色體、高雜合度的微衛(wèi)星位點(diǎn)引物，一共382對(duì)。采用Touchdown程序結(jié)合多重PCR反應(yīng)方法，將5-12種不同引物混合,放入同一管中進(jìn)行擴(kuò)增，總反應(yīng)體積5μl多重PCR以上結(jié)果說(shuō)明這個(gè)單體型在該家系中與疾病共分離，而這些重組事件的發(fā)生則將角膜環(huán)狀皮樣瘤疾病基因定位于4q24-26的D4S1572和D4S1522之間15.2cM范圍內(nèi)侯選基因的篩選進(jìn)行UCSC數(shù)據(jù)庫(kù)查詢D4S1572-D4S1522之間15.2cM的基因，結(jié)果顯示在這個(gè)區(qū)間總計(jì)有65個(gè)knowngenes,52個(gè)Referencegenes進(jìn)行候選基因篩選時(shí)，考慮到組織發(fā)生中皮樣瘤為異位到角膜的正常組織，推測(cè)角膜環(huán)狀皮樣瘤致病基因可能與胚層的移行、細(xì)胞的發(fā)育和分化密切相關(guān)侯選基因的篩選通過(guò)篩選，選取其中3個(gè)能與組織細(xì)胞的發(fā)育分化和移行有關(guān)并在眼睛表達(dá)的基因：CXXC4PITX2TM4SF9PITX2——是一個(gè)轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，與發(fā)育相關(guān)，有重要的功能XiaK,etal.JMedGenet(2004,41(12):e129)神經(jīng)性耳聾疾病基因GJB3的克隆GJB3基因的計(jì)算機(jī)克隆

3’RACE或者nested-PCR共獲得cDNA片段1059bp，其中ORF813bp，編碼的氨基酸270aa。該ORF與小鼠Gjb3在813bp的一致性為83.4%，與大鼠Gjb3在813bp的一致性為84.6%。推測(cè)的氨基酸與小鼠Gjb3在270aa的一致性為82.6%，與大鼠Gjb3在270aa的一致性為83%。蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu):4個(gè)跨膜區(qū)

2個(gè)胞外區(qū)

3個(gè)胞內(nèi)區(qū)1of5Humancx31comparetootherGJBprotein2of5Humancx31comparetootherGJBprotein3of5Humancx31comparetootherGJBprotein4of5Humancx31comparetootherGJBprotein5of5Humancx31comparetootherGJBproteinGJB3(connexin31)wasmappedto1p33-35byFISH定位在1p33-35的疾病有常染色體顯性遺傳的感覺神經(jīng)性耳聾（DFNA2）、CMT2A型的腓骨肌萎縮癥、變異性紅皮病和眼瞼下垂。我們?cè)谥袊?guó)遺傳病家系收集數(shù)據(jù)庫(kù)收集的神經(jīng)性耳聾和腓骨肌萎縮癥的病人中檢測(cè)突變，在兩個(gè)高頻聽力減退的浙江家系和湖南家系中分別發(fā)現(xiàn)錯(cuò)義和無(wú)義突變的雜合子，并選擇了非相關(guān)的150名個(gè)體進(jìn)行檢測(cè)，未檢測(cè)到錯(cuò)義和無(wú)義突變。KarenPSteel.NatureGenetics,20:320,1998關(guān)聯(lián)研究關(guān)聯(lián)指兩個(gè)或多個(gè)事件之間具有統(tǒng)計(jì)學(xué)依賴性等位基因關(guān)聯(lián)：等位基因頻率隨疾病性狀顯著增高或降低連鎖不平衡：緊密連鎖而產(chǎn)生的等位基因關(guān)聯(lián)當(dāng)特定標(biāo)記等位基因與疾病易感基因距離很近，經(jīng)過(guò)多代仍然共同傳遞，則人群中受累的無(wú)血緣關(guān)系的個(gè)體可能享有共同的等位基因。銀屑?。≒soriasis,MIM:177900）亦稱“牛皮癬”，是一種慢性炎癥性皮膚病出現(xiàn)特征性皮損：大小不等的紅斑樣丘疹，表面覆蓋著銀白色鱗屑，可發(fā)生于身體任何部位，好發(fā)于頭皮、軀干及四肢伸側(cè)。是一種常見且嚴(yán)重的皮膚病。銀屑病的主要臨床表現(xiàn)銀屑病在全世界的發(fā)病率約為0.6~4.8%Psoriasisoccursin0.6~4.8%oftheworld’spopulation在亞洲和美洲人的發(fā)病率在0.4%~0.7%;歐洲人中發(fā)表率略高，最高達(dá)到4.6%；據(jù)估計(jì)我國(guó)銀屑病患者已接近1，000萬(wàn)。銀屑病有2個(gè)發(fā)病高峰：

一次是在20-30歲，一次是50-60歲。銀屑病的發(fā)病率銀屑病的主要病理改變表皮增厚皮損和出血淋巴細(xì)胞炎性浸潤(rùn)銀屑病的病理機(jī)制研究目前發(fā)現(xiàn)的主要銀屑病易感基因均與免疫系統(tǒng)相關(guān)：主要組織相容性復(fù)合體(Themajorhistocompatibilitycomplex，MHC)組織相容性抗原(HistocompatibilityAntigens，HLA)HLA-Cw6HLA-B13,-B17,-B37,-Bw16T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)(T-lymphocyte-mediatedmechanism)初篩階段重復(fù)驗(yàn)證階段合并2個(gè)階段數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析芯片平臺(tái)：Illumina610k病例1139，對(duì)照1132（漢族）64個(gè)P<10-5SNPs病例5182，對(duì)照6516（漢族）提示3個(gè)可能的易感基因：MHC、IL12B、LCE發(fā)現(xiàn)6個(gè)關(guān)聯(lián)SNP，分別位于3個(gè)基因上病例539，對(duì)照824（維吾爾族）Sequenomiplex銀屑病全基因組關(guān)聯(lián)分析（GWAS）研究結(jié)果樣本選擇10-5研究結(jié)果：一、證實(shí)了兩個(gè)之前已被證實(shí)的易感位點(diǎn)：

MHC(rs1265181,P=1.93×10-208)

IL12B(rs3213094,Pcombined

=2.58×10-26)二、發(fā)現(xiàn)了一個(gè)新的銀屑病易感基因位點(diǎn)：LCEgenecluster——on1q21(rs4085613,Pcombined=6.6910-30)通過(guò)第一階段GWAS分析發(fā)現(xiàn)MHCregion與中國(guó)人群銀屑病發(fā)生顯著相關(guān)：

MHC區(qū)間位于chr.6:25～34Mb該研究共選擇了位于該染色體區(qū)間的2,087個(gè)SNPs——左圖顯示了關(guān)聯(lián)研究證實(shí)的：9個(gè)SNPs

7個(gè)已知基因其中紅色箭頭標(biāo)示——rs130065位于已知銀屑病易感基因PSORS1：CDSN附近；該基因

屬于HLA-C基因家族。通過(guò)GWAS連鎖分析發(fā)現(xiàn)——除MHC區(qū)域之外得到最強(qiáng)關(guān)聯(lián)的4個(gè)SNPs均位于1q21：LCE基因家族（rs4112788,rs4845454,rs4085613,rs1886734）。左圖顯示了LCE基因家族區(qū)域附近的基因和LD連鎖圖：—上圖顯示所有位于區(qū)間內(nèi)的基因—中圖和下圖分別顯示了根據(jù)中國(guó)人和歐洲人基因頻率繪制的LD連鎖圖左圖黃色箭頭顯示rs6701216位點(diǎn)，該SNP被其他研究重復(fù)與銀屑病相關(guān)。LCE基因家族與銀屑病?LCE家族編碼：角質(zhì)包膜蛋白——在表皮終末分化過(guò)程發(fā)揮了重要作用。

該研究假設(shè)由于LCE易感基因變異導(dǎo)致表皮角質(zhì)包膜異常、角質(zhì)細(xì)胞的分化異常，從而影響銀屑病發(fā)生。Follow–UPStudyofPsoriasisGWAS銀屑病二期GWAS研究?第二階段GWAS研究使用的樣本中國(guó)人：8312患者+12919對(duì)照；高加索人：3293患者+4188對(duì)照+254核心家系發(fā)現(xiàn)6個(gè)新的銀屑病易感位點(diǎn)參加的國(guó)家：美國(guó)、中國(guó)、瑞典、新加坡銀屑病GWAS后續(xù)研究策略——更大規(guī)模（不同人種）樣本驗(yàn)證生物信息學(xué)分析鑒定潛在的致病Alleles多層次的功能學(xué)驗(yàn)證分子水平、細(xì)胞水平、動(dòng)物模型...揭示銀屑病的分子致病機(jī)制通過(guò)GWAS研究提示與疾病關(guān)聯(lián)的SNPs...Millersyndrome米勒綜合癥(Millersyndrome)(MIM#263750)導(dǎo)致患者口、眼、耳、足等畸形的遺傳病嚴(yán)重小頜癥唇腭裂四肢末端發(fā)育不良或不發(fā)育眼瞼缺損多乳頭連鎖分析遺傳病家系已知基因篩選新一代測(cè)序共分離研究克隆致病基因驗(yàn)證LargefamilySmallfamilyNoYescandidateSeqknowngene(s)新一代測(cè)序（NextGenerationSequencing）84BackgroundDNAGenomicDNAFragment

&addlinkersHybridizeNimbleGenArrayWashEluteSequencingProbesTargetDNATargetDNAExon1Exon2Exon3Exon4Exon5Exon6AmplificationDenaturationwithNaOHbeforeaddingtoFCInitialextensionwithTaqPolymeraseDenaturationwithformamideSubsequentamplificationwithBstpolymerase35cyclesat60oC5’GTCAGTCAGTCAGT3’5’CAGTCATCACCTAGCGTA FirstbaseincorporatedCycle1: Addsequencingreagents Removeunincorporatedbases DetectsignalCycle2-n:AddsequencingreagentsandrepeatAllfourlabelednucleotidesinonereactionHighaccuracyBase-by-basesequencingNoproblemswithhomopolymerrepeatsSequencingBySynthesis(SBS)TTTTTTT

G

T…T

G

C

T

A

C

G

A

T…Theidentityofeachbaseofaclusterisreadofffromsequentialimages.123789456樣本選擇

3個(gè)多發(fā)家系，家系間無(wú)親緣關(guān)系，父母表型正常，均有兩個(gè)患病的后代正常對(duì)照為8個(gè)Hapmap個(gè)體3個(gè)家系之間沒有親緣關(guān)系研究方法與結(jié)果方法

3個(gè)家系的4個(gè)受累個(gè)體（家系1-A，家系1-B，家系2，家系3）外顯子組測(cè)序。結(jié)果獲得數(shù)據(jù)平均5.1Gb/人，捕獲的26.6Mb外顯子區(qū)域其覆蓋率達(dá)到40倍，覆蓋了該區(qū)域97%的序列

如何過(guò)濾和篩選數(shù)據(jù)？?jī)蓚€(gè)模型Dominantmodel

至少應(yīng)有1個(gè)位于同一基因的NS/SS/I突變，且覆蓋率應(yīng)為40倍以上Recessivemodel至少應(yīng)有2個(gè)位于同一基因的NS/SS/I突變且覆蓋率應(yīng)>500倍

無(wú)義突變（NS）剪接位點(diǎn)突變（SS）插入/缺失(indels;I)過(guò)濾和篩選數(shù)據(jù)家系1中1-A，1-B中過(guò)濾掉dbSNP和HapMap中的常見的突變

Dominantmodel：228Recessivemodel：9家系1與家系2和3（均過(guò)濾dbSNP和HapMap）比較

Dominantmodel：26Recessivemodel：onlyasinglegene,DHODH

過(guò)濾和篩選數(shù)據(jù)NS/SS/I突變是否有危害Recessivemodel中DHODH并未入選Dominantmodel中DHODH

在家系1中發(fā)現(xiàn)G605A（與疾病無(wú)關(guān)），但G454A可能與疾病相關(guān)。但每個(gè)個(gè)體DHODH

的新發(fā)突變均為復(fù)合雜合子，且6個(gè)突變中的5個(gè)可能與疾病相關(guān)，因此仍考慮該疾病為Recessivemodel。過(guò)濾和篩選數(shù)據(jù)---結(jié)果SarahBNgetal.Sanger測(cè)序驗(yàn)證候選基因的突變

方法

篩查另外3個(gè)沒有親緣關(guān)系的該疾病家系的病人及家系2中的另一個(gè)患病個(gè)體的DHODH，及正常對(duì)照200人。結(jié)果