第四章植物組織與細(xì)胞培養(yǎng)1植物組織與器官培養(yǎng)2植物細(xì)胞培養(yǎng)3植物原生質(zhì)體培養(yǎng)1植物組織與器官培養(yǎng)1.1概述1.2植物組織培養(yǎng)的基本步驟1.3愈傷組織培養(yǎng)1.4植物器官培養(yǎng)1.5植物組織培養(yǎng)的應(yīng)用1.6人工種子1.7植物組織與器官的生物反應(yīng)器培養(yǎng)1.8植物組織與器官培養(yǎng)存在問題1.1.1植物組織培養(yǎng)植物組織培養(yǎng)是指在無菌條件下，將離體的植物器官、組織、細(xì)胞（體細(xì)胞、生殖細(xì)胞等）、胚胎、原生質(zhì)體等培養(yǎng)在人工配置的培養(yǎng)基上，給予適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)條件，誘發(fā)產(chǎn)生愈傷組織、潛伏芽，或者長成新的完整植株的一種實(shí)驗(yàn)技術(shù)。也被稱為植物離體培養(yǎng)或試管培養(yǎng)，由此培育的植物也可稱之為“試管植物”。1.1概述試管玫瑰、手指玫瑰組織培養(yǎng)與細(xì)胞培養(yǎng)的區(qū)別：組織培養(yǎng)是指從機(jī)體內(nèi)取出組織或細(xì)胞，模擬機(jī)體內(nèi)生理?xiàng)l件，在體外進(jìn)行培養(yǎng)使之生存或生長成組織。主要指用于植物快繁的組培技術(shù)。細(xì)胞培養(yǎng)是指植物細(xì)胞在體外條件下的存活或生產(chǎn)，此時(shí)細(xì)胞不再形成組織。主要是以生產(chǎn)次生代謝產(chǎn)物為目的的大規(guī)模細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)。組織培養(yǎng)分類：根據(jù)外植體的不同，組織培養(yǎng)可分為植株培養(yǎng)、器官培養(yǎng)（如植物的根、莖、葉、花藥、子房、胚珠、胚等）、組織培養(yǎng)（含愈傷組織）等。根據(jù)培養(yǎng)的操作方式不同，組織培養(yǎng)又可分為固體培養(yǎng)和液體培養(yǎng)。液體培養(yǎng)又可分為振蕩培養(yǎng)、旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)和靜止培養(yǎng)等。全能細(xì)胞是能夠表達(dá)生物體基因組的任何一種基因，并能分化出該生物體內(nèi)任何一種類型的細(xì)胞，進(jìn)而發(fā)育為一個(gè)完全相同的生物體。外植體是指植物組織培養(yǎng)中用來進(jìn)行離體無菌培養(yǎng)的離體材料，可以是器官、組織、細(xì)胞和原生質(zhì)體等。1.1.2幾個(gè)重要概念愈傷組織愈傷組織是由外植體組織增生的細(xì)胞產(chǎn)生的一團(tuán)不定型的疏散排列的薄壁細(xì)胞。細(xì)胞大小、形狀、液泡化程度、胞質(zhì)含量、細(xì)胞壁特性等具有很大的差異。愈傷組織細(xì)胞是分化的，但還沒有形成組織上的結(jié)構(gòu)，因此愈傷組織培養(yǎng)過程中沒有明顯的組織或器官上的分化。愈傷組織可以長期保存，也可以迅速增殖用作無性系；也可以用作原生質(zhì)體培養(yǎng)時(shí)原生質(zhì)體的來源。繼代培養(yǎng)是指愈傷組織在培養(yǎng)基上生長一段時(shí)間后，營養(yǎng)物枯竭，水分散失，并已經(jīng)積累了一些代謝產(chǎn)物，此時(shí)需要將這些組織轉(zhuǎn)移到新的培養(yǎng)基上，這種轉(zhuǎn)移稱為繼代培養(yǎng)或傳代培養(yǎng)。細(xì)胞分化和形態(tài)建成植物通過細(xì)胞或組織培養(yǎng)達(dá)到再生目的要經(jīng)過以下兩個(gè)步驟：培養(yǎng)的植物細(xì)胞或組織的脫分化，形成愈傷組織。由新形成的愈傷組織形成一些分生細(xì)胞團(tuán)，隨后由其分化成不同的器官原基。1.2植物組織培養(yǎng)的基本過程（1）培養(yǎng)材料的采集從理論上講，植物具有全能性的細(xì)胞有三類：受精卵；發(fā)育中的分生組織細(xì)胞；雌雄配子及單倍體細(xì)胞；快繁中，最常用的培養(yǎng)材料是莖尖，通常0.5cm左右。無病毒苗莖尖0.1mm以下。（2）

培養(yǎng)材料的消毒自來水—蒸餾水—無菌紗布或吸水紙—消毒刀片切成小塊。無菌環(huán)境，70％灑精中浸泡30-60s。漂白粉飽和液或0.01％升汞(HgCI2)水中消毒l0min。取出后用無菌水沖洗3-4次。（3）

制備外植體在無菌的環(huán)境下，將已消毒的材料用無菌刀、剪、鑷等，剝?nèi)パ康镊[片、嫩枝的外皮或種皮胚乳（葉片則不需剝皮）。然后切成0.2—0.5cm厚的小片。嚴(yán)禁用手觸摸材料。（4）

接種和培養(yǎng)接種：將切好的外植體立即接種在培養(yǎng)基上，4-10個(gè)/瓶。封口：瓶、管用無菌藥棉或蓋封口，培養(yǎng)皿用無菌膠帶。溫度：25℃左右，因花卉種類及材料部位的不同區(qū)別對(duì)待。增殖：在新梢等形成后需要繼代培養(yǎng)。把材料分株或切段轉(zhuǎn)入增殖培養(yǎng)基中，增殖1個(gè)月左右后，可視情況繼代。（5）根的誘導(dǎo)繼代培養(yǎng)形成的不定芽和側(cè)芽一般沒有根，必須轉(zhuǎn)到生根培養(yǎng)基上進(jìn)行生根。培養(yǎng)1個(gè)月后即可獲得健壯根系。（6）

組培苗的練苗移栽培養(yǎng)容器打開，室內(nèi)3天，取出小苗，用自來水沖洗根系上的營養(yǎng)基，栽入基質(zhì)。移栽前要適當(dāng)遮蔭，加強(qiáng)水分管理，保持較高的空氣濕度。1.3.1愈傷組織培養(yǎng)的基本過程1.3.2愈傷組織培養(yǎng)的應(yīng)用舉例1.3愈傷組織培養(yǎng)（1）愈傷組織的形成啟動(dòng)期（或誘導(dǎo)期）：主要是指細(xì)胞或原生質(zhì)體準(zhǔn)備分裂的時(shí)期。誘導(dǎo)劑如NAA,IAA,2,4一D等或細(xì)胞分裂素。分裂期：即開始分裂并不斷增生子細(xì)胞的過程。分化期：細(xì)胞內(nèi)部開始發(fā)生一系列形態(tài)和生理上的變化，分化出形態(tài)和功能不同的細(xì)胞。1.3.1愈傷組織培養(yǎng)的基本過程（2）愈傷組織的生長（3）愈傷組織的分化和形態(tài)的發(fā)生自身?xiàng)l件（如遺傳性狀、來源部位、年齡等等）、培養(yǎng)基（如是固體還是液體、生長素、激動(dòng)素、其他營養(yǎng)等）培養(yǎng)條件（如溫度、光質(zhì)與光照強(qiáng)度、光周期、通氣量）蘆薈組織培養(yǎng)快速繁殖（1）材料和培養(yǎng)基：蘆薈幼苗，10-15cm高；愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基：MS+(1-6mg/L)BA+(0.1-0.5mg/L)NAA；分化培養(yǎng)基：MS+(2-4mg/L)BA＋(0.1-0.5mg/L)NAA；生根培養(yǎng)基：MS＋(0.1-0.5mg/L)IBA十2-5mg/L）PP333。1.3.2愈傷組織培養(yǎng)的應(yīng)用舉例（2）愈傷組織培養(yǎng)：清水沖洗，取莖尖部分，再?zèng)_洗1-2次，淋干。超凈臺(tái)上，75％的乙醇浸泡30-60s，升汞浸5-10min，無菌水沖洗數(shù)次。用解剖刀取出包括莖尖生長點(diǎn)的組織切塊，接種到愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上。培養(yǎng)條件：每天光照10-12h，光照度為1000～20001x,溫度25士2℃。15-25天后，試管中外植體膨大，形成愈傷組織。1周后將愈傷組織轉(zhuǎn)管進(jìn)行繼代培養(yǎng)或分化培養(yǎng)。（3）繼代培養(yǎng)：取出愈傷組織，剔除附著在愈傷塊上的培養(yǎng)基，無菌水反復(fù)清洗數(shù)次愈傷塊上無殘留培養(yǎng)基。用解剖刀將愈傷塊切成數(shù)個(gè)小塊，再接種到裝有愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基的三角瓶中，在與誘導(dǎo)愈傷組織相同的培養(yǎng)條件下繼續(xù)培養(yǎng)。幾天后，三角瓶中的小愈傷塊即可逐漸長大。（4）分化培養(yǎng)：將愈傷組織取出，用無菌水洗凈，切成小接種塊接種到裝有分化培養(yǎng)基的三角瓶中，環(huán)境條件同愈傷組織培養(yǎng)。30-50天后，愈傷組織分化出芽并繼續(xù)長出小葉片。（5）生根培養(yǎng)：當(dāng)三角瓶中的幼苗葉片長到3cm左右時(shí)，將幼苗取出，放入裝有生根培養(yǎng)基的三角瓶中培養(yǎng)。半個(gè)月后，幼苗生根。（6）煉苗：幼苗根長到一定長度，形體已顯健壯時(shí)，取出并在清水中洗除附著在根上的培養(yǎng)基。將洗凈的幼苗排好，用清水噴濕，在15～250C,濕度60％～80％的條件下煉苗24h，也可視情況縮短為12h。（7）移栽：煉苗后，將幼苗移栽人由蛭石組成的馴化苗圃中馴化，每天定期給幼苗噴施馴化培養(yǎng)液和清水，大約15一20天后（視幼苗長勢）即可移栽到苗圃中。注意事項(xiàng)精確稱取試劑。蔗糖-白糖。121℃,30min。對(duì)接種室進(jìn)行甲醛熏蒸和紫外線滅菌。培養(yǎng)過程中出現(xiàn)雜菌污染，應(yīng)立即將該污染試管或三角瓶中的培養(yǎng)物倒掉并將試管或三角瓶洗凈，烘干備用。煉苗后也可先將試管苗浸泡在有生根粉清水中1一2h，再移栽到馴化苗圃中。馴化過程中，除要注意環(huán)境濕度、溫度和光照外，還要注意防止各種病蟲害的發(fā)生。紅蜘蛛和蚜蟲，可噴施40％的氧化樂果乳油1200倍液。黑斑病，噴施50％多菌靈可濕性粉劑1000倍液。海帶愈傷組織培養(yǎng)海藻是一類生長于海洋的低等植物。多含有人類需要的生理活性物質(zhì)，因此大多具有重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。傳統(tǒng)的海藻養(yǎng)殖多采用天然水域的人工養(yǎng)殖或人工捕撈手段，但是易受季節(jié)、氣候、污染、地域等條件限制。因此，開展相關(guān)海藻人工組織培養(yǎng)具有重要意義。海藻組織培養(yǎng)最早可以追溯到20世紀(jì)50年代。我國在20世紀(jì)80年代開始藻體離體培養(yǎng)的研究，到了20世紀(jì)90年代，海帶、紫菜、石花菜、裙帶菜等一些海藻的組織培養(yǎng)已獲得了實(shí)際應(yīng)用。藻體為褐色，帶狀，有光澤，長達(dá)2～3米，基部有固著用的假根。海帶產(chǎn)于太平洋沿岸，我國遼寧、山東沿海都有分布。藻體可供食用或藥用，是制碘工業(yè)的原料。

（1）選擇合適的培養(yǎng)用外植體：海帶的藻體分為葉片、柄、假根三部分，葉狀體下部細(xì)胞分裂旺盛，具有較高的形成愈傷組織的能力，因此一般選用這部分切塊后作為組織培養(yǎng)用的外植體。（2）無菌處理：將切割獲得的外植體洗干凈后用酒精消毒處理。（3）愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)：前面步驟獲得的外植體放人培養(yǎng)器中培養(yǎng)。培養(yǎng)愈傷組織和保存無性系－固體培養(yǎng)基，擴(kuò)培和使愈傷組織分化－液體培養(yǎng)基。海藻培養(yǎng)用培養(yǎng)基主要成分－海水。激素。1.4.1概念1.4.2植物器官培養(yǎng)的應(yīng)用舉例1.4植物器官培養(yǎng)植物器官培養(yǎng)是指將植株上的各種器官從母體上分離出來，放在無菌的人工環(huán)境中讓其進(jìn)一步發(fā)育，最終長成幼苗的過程。器官培養(yǎng)不僅是研究器官生長、營養(yǎng)代謝、生理生化、組織分化和形態(tài)形成等的很好方法在生產(chǎn)實(shí)際中也具有重要的應(yīng)用價(jià)值?？焖俳⒃嚬苊?，實(shí)現(xiàn)名、特、優(yōu)等珍貴品種快速繁殖；利用莖尖培養(yǎng)可以得到脫毒植株，解決馬鈴薯、甘蔗、大蒜、草萄、康乃馨等品種的退化問題；將植物器官做誘變處理，得到突變株，進(jìn)行突變育種等。1.4.1概念以馬鈴薯莖尖脫毒培養(yǎng)為例，簡單介紹植物器官培養(yǎng)的應(yīng)用。1.4.2植物器官培養(yǎng)的應(yīng)用舉例圖1-1脫（無）毒試管苗生產(chǎn)程序試管苗繁殖

試管苗切斷到試管薯繁殖過程試管薯和微型薯比較(Atlantic和Favorita）不同光周期下形成的試管薯克新1號(hào)（0，8，12，16h）荷蘭無花（0，8，12，16h）圖4-2不同濃度IAA與GA（A）、GA+BAP（B）互作對(duì)試管苗生長及試管薯形成的影響

Fig.4-2DetailsoftheinteractionofvariousIAAconcentrationswithGA3（A）andGA3+BAP

（B）onthegrowthandmicrotuberizationofpotatoexplants.

不同濃度茉莉酸對(duì)試管苗生長影響Favorita（0，0.2，2，20，50mg/L）荷蘭無花（0，0.2，2，20，50mg/L）茉莉酸通氣條件和硝酸銀對(duì)試管苗的影響

（從左向右：密封，密封＋硝酸銀，通氣，通氣+硝酸銀）Favorita；蘭芽硝酸銀鹽脅迫下試管苗的生長020406080mM020406080mM1.5.1無性系快速繁殖技術(shù)1.5.2獲得無病毒植株1.5.3新品種選育1.5.4在遺傳、生理生化和病理等研究上的應(yīng)用1.5.5種質(zhì)資源的保存1.5.6產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)前景1.5植物組織培養(yǎng)的應(yīng)用由于試管繁殖周期短、繁殖系數(shù)高、不受季節(jié)限制，便于工廠化生產(chǎn)，20世紀(jì)80年代初，在世界范圍內(nèi)，植物組織、細(xì)胞培養(yǎng)形成了一個(gè)新興的產(chǎn)業(yè)，如美國的蘭花試管苗，荷蘭的花卉試管苗等。我國20世紀(jì)80年代初，投資完成了第一個(gè)甘蔗試管苗工廠。近年來，兩廣在試管繁殖香蕉方面也實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化，并出口國外，獲得較好經(jīng)濟(jì)效益。1.5.1無性系快速繁殖技術(shù)農(nóng)作物如馬鈴薯、甘草、草莓,大蒜等?；ɑ?，如康乃馨、菊花、郁金香、水仙、百合等不能通過種子途徑去除病毒。對(duì)于花卉而言會(huì)影響花卉的觀賞效果，對(duì)于經(jīng)濟(jì)作物也會(huì)影響產(chǎn)量。如：病毒常使馬鈴薯減產(chǎn)50%左右；蘋果減產(chǎn)14％～45%，而且品質(zhì)惡化、口感變差、不易儲(chǔ)藏。1.5.2獲得無病毒植株突變育種利用培養(yǎng)的細(xì)胞誘發(fā)和篩選突變體有很多優(yōu)點(diǎn)：首先，通過植物組織或細(xì)胞培養(yǎng)可以獲得大量的可供選擇的各種變異的群體，這些群體的生長容易控制。在很短時(shí)間內(nèi)完成突變體的篩選。在培養(yǎng)的細(xì)胞中選擇突變體有利于在分子水平上研究突變機(jī)制。1.5.3新品種選育不足之處是：在細(xì)胞水平上篩選的突變不一定都能在植株水平上表達(dá)。染色體不太穩(wěn)定，再生能力容易喪失。除原生質(zhì)體外，很難獲得完全單細(xì)胞的材料。與微生物相比，植物細(xì)胞群體增殖時(shí)間較長，細(xì)胞易積聚在一起。原生質(zhì)體融合和細(xì)胞雜交利用原生質(zhì)體培養(yǎng)系統(tǒng)分離和鑒定各種突變體使通過單細(xì)胞的誘變和篩選突變體成為可能。懸浮培養(yǎng)的原生質(zhì)體是比較均一的，可以在十分一致的條件下用誘變劑處理。并且還能以單細(xì)胞單位進(jìn)行分離?？梢钥朔h(yuǎn)源有性雜交中的不親和性，提供新的核質(zhì)組合，從而獲得新物種。不足之處是：在細(xì)胞水平上篩選的突變不一定都能在植株水平上表達(dá)。染色體不太穩(wěn)定，再生能力容易喪失。除原生質(zhì)體外，很難獲得完全單細(xì)胞的材料。與微生物相比，植物細(xì)胞群體增殖時(shí)間較長，細(xì)胞易積聚在一起?；ㄋ?、花粉培養(yǎng)與單倍體植株組成花藥的細(xì)胞有兩種：一是體細(xì)胞，包括花藥壁和隔組織的細(xì)胞；另一種是雄性性細(xì)胞，即小孢子。花粉是由花藥內(nèi)的花粉母細(xì)胞發(fā)育而來的，壁內(nèi)含有雄配子。由于花粉的染色體只有體細(xì)胞的一半，因此通過花藥培養(yǎng)的植株是單倍性的。單倍體植物沒有顯性基因的掩蓋作用，易于選擇，并能在很短時(shí)間內(nèi)獲得純合二倍體植株，因此在育種實(shí)踐中具有獨(dú)特的優(yōu)越性，花藥培養(yǎng)也成為染色體工程遺傳育種的一個(gè)有效途徑。組織培養(yǎng)由于能快速、大量地獲得性狀一致的實(shí)驗(yàn)材料，從而大大地推動(dòng)了植物遺傳、生理生化和病理等領(lǐng)域的研究進(jìn)程。如植物組織培養(yǎng)有助于了解植物營養(yǎng)問題、進(jìn)行光合作用理論研究、研究植物的抗病性、觀察染色體的變異等。通過組織培養(yǎng)，可縮短育種年限和世代，也有利于基因突變中隱性突變的分離。1.5.4在遺傳、生理生化等研究上的應(yīng)用利用植物組培和細(xì)胞低溫保存等方法保存種質(zhì)，可大大節(jié)省人力、物力，大大延長保存期。同時(shí)也便于種質(zhì)資源的交換和轉(zhuǎn)移，防止病害。例如：胡蘿卜和煙草等植物細(xì)胞胞培養(yǎng)懸浮物可在－20℃～－196℃的低溫保存數(shù)月，而且還能恢復(fù)生長，再生成為植株。1.5.5種質(zhì)資源的保存花卉種苗產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)在花卉生產(chǎn)方面，種苗質(zhì)量在栽培效果中的重要性占50%以上。蔬菜、水果種苗脫毒馬鈴薯、食用百合、大蒜等蔬菜品種組培脫毒技術(shù)就可迅速恢復(fù)品種種性，提高生產(chǎn)力。瓜果組培苗產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)草莓易感染各種病毒病，感病果實(shí)畸形，品質(zhì)差，一般減產(chǎn)30％～80%。對(duì)草酶進(jìn)行熱處理——分生組織培養(yǎng)脫毒，去病毒苗品質(zhì)好。1.5.6產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)前景1.6.1概念1.6.2優(yōu)勢1.6.3制作流程1.6.4包埋介質(zhì)條件及包埋方法1.6人工種子人工種子就是最外面包裹一層有機(jī)薄膜的植物胚狀體。由人工種皮、人工胚乳和繁殖體組成。外層膠囊狀的固定化膜保護(hù)胚狀體中的水分并能防止外部力量沖擊，中間含有培養(yǎng)物所需的營養(yǎng)成分和某些植物激素，最內(nèi)則是被包裹的胚狀體或芽。1.6.1概念采用人工種子進(jìn)行快速繁殖便于運(yùn)輸和儲(chǔ)藏。人工胚乳中可加入植物激素、有益微生物或抗病、抗蟲成分等，優(yōu)于天然種子，生產(chǎn)效率更高。固定雜種優(yōu)勢，加速良種繁育。作為植物基因工程和遺傳工程的橋梁。保存珍貴品種。1.6.2采用人工種子的優(yōu)勢1.6.3人工種子的制作流程選取目標(biāo)植物從外植體誘導(dǎo)愈傷組織愈傷轉(zhuǎn)移到液體培養(yǎng)基愈傷在液體培養(yǎng)基中擴(kuò)增愈傷轉(zhuǎn)移到無激素培養(yǎng)基體細(xì)胞胚包裹人工種皮溫室播種獲得目標(biāo)植物對(duì)于人工胚乳，理想的包埋介質(zhì)應(yīng)該滿足：對(duì)所要包埋的材料無傷害。有足夠柔軟性，可保護(hù)繁殖體，并允許其發(fā)育。具有一定硬度，避免運(yùn)輸、操作過程中的傷害。具有穿透性，傳遞細(xì)胞生長所需的營養(yǎng)；并能容納其他附加成分，如防腐劑、殺蟲劑等。利于用現(xiàn)有的溫室或農(nóng)機(jī)機(jī)械進(jìn)行播種。1.6.4人工種子的包埋海藻酸鹽作為人工種子的包埋劑優(yōu)點(diǎn)：它具有成膠容易、操作條件溫和、使用方便、毒性極低、成本低廉等優(yōu)點(diǎn)。缺點(diǎn)：水性營養(yǎng)成分易流失、表面易結(jié)團(tuán)等。人工種子的包埋方法主要有以下四種復(fù)合凝聚：指兩種帶相反電荷的電解質(zhì)在水中相互作用形成多聚體包被溶液。界面聚合：在兩相界面處因溶解度低而成膜。離子交換凝膠：經(jīng)過離子交換而形成絡(luò)合物成為凝膠。代表物質(zhì)為海藻酸鹽包埋。變溫凝膠：高溫下為液體，低溫下為固體凝膠。因此可用各種模具塑造不同形狀的膠塊。1.7.1特點(diǎn)分析1.7.2生物反應(yīng)器1.7植物組織與器官的生物反應(yīng)器培養(yǎng)1.7.1特點(diǎn)分析毛狀根培養(yǎng)由于毛狀根呈現(xiàn)多分支狀態(tài)，易結(jié)團(tuán)，因此會(huì)對(duì)反應(yīng)