WesternBlotWesternBlot

WesternBlot中文一般稱為蛋白質(zhì)印跡。它是分子生物學、生物化學和免疫遺傳學中常用的一種實驗方法。其基本原理是通過特異性抗體對凝膠電泳處理過的細胞或生物組織樣品進行著色。通過分析著色的位置和著色深度獲得特定蛋白質(zhì)在所分析的細胞或組織中的表達情況的信息?；驹?/p>

WesternBlot采用的是聚丙烯酰胺凝膠電泳，被檢測物是蛋白質(zhì)，“探針”是抗體，“顯色”用標記的二抗。經(jīng)過電泳分離的蛋白質(zhì)樣品，轉(zhuǎn)移到固相載體（例如硝酸纖維素膜）上，固相載體以非共價鍵形式吸附蛋白質(zhì)，且能保持電泳分離的多肽類型及其生物學活性不變。以固相載體上的蛋白質(zhì)或多肽作為抗原，與對應的抗體起免疫反應，再與酶或同位素標記的第二抗體起反應，經(jīng)過底物顯色或放射自顯影以檢測電泳分離的特異性目的基因表達的蛋白成分?；驹砘静襟E準備蛋白樣品聚丙烯酰胺凝膠電泳轉(zhuǎn)膜一抗二抗反應顯影準備蛋白樣品單層貼壁細胞總蛋白的提?。ㄒ粤装鍨槔?、用移液器吸掉培養(yǎng)液，將培養(yǎng)液盡量吸干2、用4℃預冷的PBS輕輕洗兩次，然后將PBS盡量吸干3、每孔加入含蛋白酶抑制劑的裂解液0.1~0.2ml，置于冰上2~3min4、裂解完后，用干凈的刮棒將細胞刮于孔的一側(cè)，然后用移液器將細胞碎片和裂解液轉(zhuǎn)移至1.5ml離心管中（整個操作盡量在冰上進行）5、將離心管置于4℃，搖晃裂解20min6、在4℃下13200rpm離心15min7、將離心后的上清分裝轉(zhuǎn)移到預冷好的離心管中8、將樣品定量做westernblot，或者在-80℃保存根據(jù)檢測蛋白位置

選擇合適的裂解液蛋白位置推薦裂解液全細胞NP-40或RIPA胞漿（可溶性蛋白）Tris-HCl胞漿（骨架結(jié)合蛋白）Tris-Triton膜蛋白NP-40orRIPA核蛋白RIPAor核蛋白提取試劑盒線粒體蛋白RIPAor線粒體分離試劑盒樣品的變性和還原SDS-SodiumDodecylSulfate

SDS是陰離子去污劑，也是變性劑。氨基酸側(cè)鏈與SDS充分結(jié)合形成帶負電荷的蛋白質(zhì)-SDS膠束。蛋白質(zhì)-SDS膠束所帶的負電荷大大超過了蛋白質(zhì)分子原有的電荷量，消除了不同分子之間原有的電荷差異。與強還原劑一起使蛋白分子氫鍵、疏水鍵打開，使蛋白質(zhì)分子線性化。天然和非還原樣品有些抗體只能識別的表位是非連續(xù)氨基酸，這些氨基酸雖然在蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)中彼此不連續(xù)，但是在空間結(jié)構(gòu)中則是靠在一起的。這些抗體就只能識別靶蛋白的空間結(jié)構(gòu)狀態(tài)（抗體說明書中會有特殊說明）。對于這些樣品，緩沖液和凝膠中就不能含有SDS，并且不能夠?qū)Φ鞍走M行加熱變性。有些抗體只能識別蛋白的非還原狀態(tài)如氧化狀態(tài)，對此類樣品，就需要將緩沖液和凝膠中的還原劑DTT和beta-巰基乙醇去除PAGE：聚丙烯酰胺凝膠電泳

PolyacrylamideGelElectrophoresis聚丙烯酰胺凝膠(polyacrylamidegel)是由單體丙烯酰胺(acrylamide，簡稱Acr)和交聯(lián)劑(crosslinker)N,N’-亞甲基雙丙烯酰胺(N,N’-methylenebisacylamide，簡稱Bis)在催化劑（過硫酸胺，APS）和加速劑（四甲基乙二胺，TEMED）作用下聚合交聯(lián)而成的三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的凝膠。凝膠濃度和目的蛋白分子量的關(guān)系蛋白分子量（kDa）凝膠（分離膠）濃度%4-402012-451510-7012.515-1001025-2008不連續(xù)電泳凝膠層的不連續(xù)性：濃縮膠和分離膠。濃縮膠的孔徑大，分離膠的孔徑小。緩沖液離子成分和pH的不連續(xù)性：在兩層凝膠中均有Tris和HCl。Tris的作用是維持溶液的電中性及pH。不連續(xù)系統(tǒng)的濃縮效應

凝膠層的不連續(xù)性：濃縮膠的孔徑大，分離膠的孔徑小。在電場的作用下，蛋白質(zhì)顆粒在大孔膠中遇到的阻力小，移動快。而在小孔膠中遇到的阻力大，移動慢。因此，在兩層凝膠的交界處，由于凝膠孔徑的不連續(xù)性使樣品遷移受阻而壓縮成很窄的區(qū)帶。緩沖液離子成分和pH的不連續(xù)性：HCl易解離出Cl-，它在電場中遷移率大，走在最前面，故稱為快離子或前導離子。電極緩沖液中的甘氨酸在pH6.8的緩沖液中解離度很小，僅為0.1-1%，因而在電場中遷移率很小，稱為慢離子或尾隨離子。蛋白質(zhì)均帶負電荷，在電場中均移向正極，其有效遷移率介于快慢離子之間，于是蛋白質(zhì)就在快慢離子間形成的界面處，被濃縮成極窄的區(qū)帶。當進入pH8.8的分離膠時，甘氨酸解離度增加，其有效遷移率超過蛋白質(zhì)，因此氯離子和甘氨酸離子沿著離子界面繼續(xù)前進。蛋白質(zhì)分子由于分子量大，被留在后面，然后分離成多個區(qū)帶。SDS(聚丙烯酰胺凝膠)電泳1、將玻璃板清洗干凈，對齊后放入夾中卡緊，然后垂直卡在架子上準備灌膠；2、按配方配好分離膠，加入TEMED后立即搖勻灌膠。然后膠上加一層水（或者酒精）；3、當水和膠之間有一條折射線時，說明膠已凝了。再等一會使膠充分凝固就可倒去膠上層水并用吸水紙將水吸干；4、按配方配好濃縮膠，加入TEMED后立即搖勻灌膠。將剩余空間灌滿濃縮膠然后將梳子插入濃縮膠中；5、將配好的膠放入電泳槽，加入緩沖液后將梳子緩緩拔出；6、將定好量的蛋白樣品與上樣緩沖液混合好，沸水煮10分鐘后4℃下12000rpm離心5min；7、準備好樣品后，用微量進樣器上樣；8、接通電源后電泳。

向上的“微笑”現(xiàn)象說明凝膠的不均勻冷卻，中間部分冷卻不好，所以導致凝膠中分子有不同的遷移率所致，這種情況在用較厚的凝膠以及垂直電泳中時常發(fā)生，向下的“皺眉”現(xiàn)象常常是由于垂直電泳時電泳槽的裝置不合適引起，特別是當凝膠和玻璃板組成的“三明治”底部有氣泡或靠近隔片的凝膠聚合不完全便會產(chǎn)生這種現(xiàn)象。常見情況分析常見情況分析“拖尾”現(xiàn)象是電泳中最常見的現(xiàn)象。這常常是由于樣品溶解不佳引起的，克服的辦法是在加樣前離心，選用合適的樣品緩沖液和凝膠緩沖液,加增溶輔助試劑。另一方法是降低凝膠濃度。

各種膜的比較PVDF膜NC膜尼龍膜背景低低較高蛋白結(jié)合能力100-200ug/cm280-100ug/cm2>400ug/cm2機械強度強干的膜很脆軟而結(jié)實溶劑抗性強差差使用前處理甲醛潤濕緩沖液潤濕緩沖液潤濕價格高較低低轉(zhuǎn)膜步驟1、準備1張和膠一樣大小的PVDF膜。將膜放在甲醇里浸泡1min，然后放在轉(zhuǎn)移緩沖液中浸泡10min；2、在加有轉(zhuǎn)移液的容器中里放入轉(zhuǎn)膜用的夾子、兩塊海綿墊、一支玻棒、濾紙和浸過的膜；3、將夾子打開使黑的一面保持水平。在上面墊一張海綿墊，在海綿墊上鋪兩層濾紙，用玻棒搟去其中的氣泡；4、將玻璃板撬掉，然后將濃縮膠輕輕刮去，小心剝下分離膠在轉(zhuǎn)移緩沖液中浸泡后，取出蓋于濾紙上，輕輕用玻棒搟去氣泡；5、將膜蓋于膠上，然后除氣泡。在膜上蓋2張濾紙并除去氣泡。最后蓋上另一個海綿墊，合起夾子；6、將夾子放入轉(zhuǎn)移槽槽中，要使夾的黑面對槽的黑面，在槽的一邊放一塊冰來降溫；7、接通電源，開始轉(zhuǎn)膜。轉(zhuǎn)膜注意事項注意事項：1.轉(zhuǎn)移單元無氣泡2.注意方向3.戴手套，防止蛋白污染4.膠和膜大小要一致，半干轉(zhuǎn)移要注意別短路轉(zhuǎn)膜轉(zhuǎn)膜時間一般為30-60分鐘，也可以用低電壓或小電流轉(zhuǎn)過夜。具體的轉(zhuǎn)膜時間要根據(jù)目的蛋白的大小而定，目的蛋白的分子量越大，需要的轉(zhuǎn)膜時間越長；目的蛋白的分子量越小，需要的轉(zhuǎn)膜時間越短。轉(zhuǎn)膜過程產(chǎn)生大量的熱，注意冷卻。轉(zhuǎn)膜后可用麗春紅對膜染色，同時使用考馬斯亮藍對凝膠進行染色，以檢測蛋白是否充分轉(zhuǎn)移?？梢酝ㄟ^預染Marker的轉(zhuǎn)移情況來判斷蛋白的轉(zhuǎn)移狀況。一抗二抗反應1、將膜用TBS浸濕后，移至含有封閉液的平皿中，室溫下脫色搖床上搖動封閉1小時；2、將一抗用含5%牛奶或BSA的TBST稀釋至適當濃度，4℃孵育過夜，然后取出用TBST洗三次，每次10分鐘；3、同上方法準備二抗稀釋液并室溫下孵育2小時，然后用TBST洗三次，每次10分鐘封閉為避免膜與作為檢測試劑的特異性第一抗體發(fā)生非特異性結(jié)合，使非特異性背景提高，需對膜上的潛在結(jié)合位點進行封閉處理。最常見的封閉劑是BSA、脫脂奶粉、酪蛋白、明膠和Tween-20（0.05-0.1%）稀溶液從成本上來說，奶粉是首選，而且BSA封閉的背景較高，而脫脂奶封閉的背景較低，如果對奶粉不放心，也可以買奶粉的主要封閉成分Casein奶粉中含有生物素，而且奶粉中的beta-Casein和alpha-Casein都是高磷酸化的蛋白，因此在使用生物素標記的抗體或磷酸化抗體時，需要優(yōu)先考慮BSATween-20Tween-20為司盤和環(huán)氧乙烷的縮合物，由于其分子中有較多的親水性基團一聚氧乙烯基，故親水性強，為一種非離子型去污劑。Tween-20有復性抗原的作用，可提高特異性的識別能力。在做westenblot時，用惰性蛋白質(zhì)或非離子去污劑封閉膜上的未結(jié)合位點可以降低抗體的非特異性結(jié)合。Tween這種非離子型去污劑在乳化蛋白時，不破壞蛋白的結(jié)構(gòu)，可減少對蛋白質(zhì)之間原有的相互作用的破壞。離子型去污劑如SDS則破壞蛋白的結(jié)構(gòu)。常用內(nèi)參內(nèi)參名稱分子量大小適用范圍Beta-actin43kDa胞漿和全細胞GAPDH30-40kDa胞漿和全細胞Tubulin55kDa胞漿和全細胞VCDA1/Porin31kDa線粒體COXIV16kDa線粒體LaminB166kDa細胞核TBP38kDa細胞核顯影酶促反應比同位素安全且快速，已經(jīng)成為WesternBlot的主流檢測方法。酶促反應可以搭配不同的底物從而實現(xiàn)不同的顯色方法：化學發(fā)光和底物顯色，前者靈敏度很高，已經(jīng)達到皮克級別，甚至還有飛克級別的，靈敏度超過了同位素；而后者由于直接顯色而操作簡便且成本低。大家最為熟悉熟悉當數(shù)辣根過氧化物酶HRP（HorseradishPeroxidase）和堿性磷酸酶AP（AlkalinePhosphatase）此外還有比較少見的葡萄糖氧化酶（GlucoseOxidase）和β半乳糖苷酶（β-Galactosidase）

辣根過氧化物酶（HRP）HRP是最常見的酶促發(fā)光或顯色的交聯(lián)酶，HRP由于特異性更強、分子量?。?0kD）、穩(wěn)定和作用底物范圍廣的優(yōu)點而得到廣泛使用。

HRP的底物種類有不少，主要可以分為化學發(fā)光底物和生色底物2大類。HRP的生色底物顯色有DAB、4-CN、CN/DAB、AEC和TMB等。HRP化學發(fā)光反應底物主要有Luminol、ECL和SuperSignal系列。HRP的生色底物底物DAB4-CNAECTMB學名3,3-diaminobenzidinetetrahydrochloride4-chloro-1-naphthol3-amino-9-ethylcarbazol3,3,5,5

tetramethylbenzidine分子量214.14178.58210.28240.4穩(wěn)定性好一般避光好靈敏度250pg

1ng1ng100pg背景

一般低高高產(chǎn)物成像性不能很好的成像容易成像容易成像容易成像顏色褐色介于藍色與藍紫色之間（可用于double-staining）棕紅色藍紫色毒性有致癌作用無有無HRP化學發(fā)光反應底物Luminol是經(jīng)典的HRP化學發(fā)光底物。GEHealthcare（原安瑪西亞）的ECL堪稱是經(jīng)典。后來推出的ECLPlus和ECLAdvance不單將檢測靈敏度提高了10—20倍，發(fā)光時間也長達24小時以上，兼容CCD成像系統(tǒng)的檢測，使得ECL系統(tǒng)繼續(xù)領(lǐng)導潮流。

Pierce公司推出的SuperSignal系列靈敏度高（有10-12g級，10-14g級，10-15g級選擇），發(fā)光持久（6-24小時），可反復曝光，穩(wěn)定性好（室溫貯藏6個月，4℃至少是12個月），節(jié)約抗體（由于靈敏度高，一抗二抗稀釋倍數(shù)是同