微生物常規(guī)鑒定技術(shù)一.形態(tài)結(jié)構(gòu)和培養(yǎng)特性觀察微生物的形態(tài)結(jié)構(gòu)觀察主要是通過染色，在顯微鏡下對(duì)其形狀、大小、排列方式、細(xì)胞結(jié)構(gòu)（包括細(xì)胞壁、細(xì)胞膜、細(xì)胞核、鞭毛、芽匏等）及染色特性進(jìn)行觀察，直觀地了解細(xì)菌在形態(tài)結(jié)構(gòu)上特性，根據(jù)不同微生物在形態(tài)結(jié)構(gòu)上的不同達(dá)到區(qū)別、鑒定微生物的目的。細(xì)菌細(xì)胞在固體培養(yǎng)基表面形成的細(xì)胞群體叫菌落（colony）。不同微生物在某種培養(yǎng)基中生長(zhǎng)繁殖，所形成的菌落特征有很大差異，而同一種的細(xì)菌在一定條件下，培養(yǎng)特征卻有一定穩(wěn)定性。，以此可以對(duì)不同微生物加以區(qū)別鑒定。因此，微生物培養(yǎng)特性的觀察也是微生物檢驗(yàn)鑒別中的一項(xiàng)重要內(nèi)容。2.1細(xì)菌的培養(yǎng)特征包括以下內(nèi)容：在固體培養(yǎng)基上，觀察菌落大小、形態(tài)、顏色（色素是水溶性還是脂溶性）、光澤度、透明度、質(zhì)地、隆起形狀、邊緣特征及遷移性等。在液體培養(yǎng)中的表面生長(zhǎng)情況（菌膜、環(huán)）混濁度及沉淀等。半固體培養(yǎng)基穿刺接種觀察運(yùn)動(dòng)、擴(kuò)散情〉兄。瓊脂平皿上的生長(zhǎng)表現(xiàn)觀察并記錄不同的菌落：大小、形狀、邊緣、表面性狀、隆起度、顏色、透明度、硬度、溶血等。觀察瓊脂斜面上的生長(zhǎng)表現(xiàn)：菌苔的顏色及茂盛情況。觀察半固體瓊脂的生長(zhǎng)現(xiàn)象：絨毛狀、線狀等。細(xì)菌的培養(yǎng)特征：點(diǎn)狀圓形絲狀不規(guī)則形假根狀紡錘狀扁平隆起凸起墊狀臍狀邊緣整齊波狀裂片狀嚙蝕狀.絲狀卷發(fā)狀絲線狀刺毛狀串珠狀疏展?fàn)顦涓鶢罴俑鶢罱z狀串珠狀乳頭狀絨毛狀樹根狀量杯狀蘿卜狀漏斗狀囊狀層狀絮狀環(huán)狀蹼狀膜狀2.2霉菌酵母菌的培養(yǎng)特征：大多數(shù)酵母菌沒有絲狀體，在固體培養(yǎng)基上形成的菌落和細(xì)菌的很相似，只是比細(xì)菌菌落大且厚。液體培養(yǎng)也和細(xì)菌相似，有均勻生長(zhǎng)、沉淀或在液面形成菌膜。霉菌有分支的絲狀體，菌絲粗長(zhǎng)，在條件適宜的培養(yǎng)基里，菌絲無限伸長(zhǎng)沿培養(yǎng)基表面蔓延。霉菌的基內(nèi)菌絲、氣生菌絲和匏子絲都常帶有不同顏色，因而菌落邊緣和中心，正面和背面顏色常常不同，如青霉菌：匏子青綠色，氣生菌絲無色，基內(nèi)菌絲褐色。霉菌在固體培養(yǎng)表面形成絮狀、絨毛狀和蜘蛛網(wǎng)狀菌落。

二、生理生化試驗(yàn)微生物生化反應(yīng)是指用化學(xué)反應(yīng)來測(cè)定微生物的代謝產(chǎn)物，生化反應(yīng)常用來鑒別一些在形態(tài)和其它方面不易區(qū)別的微生物。因此微生物生化反應(yīng)是微生物分類鑒定中的重要依據(jù)之一。微生物檢驗(yàn)中常用的生化反應(yīng)有：過氧化氫酶的測(cè)定過氧化氫酶又稱接觸酶，能催化過氧化氫分解水和氧。試劑：3-10%過氧化氫(H2O2)菌種培養(yǎng)：將測(cè)試菌種接種于合適的培養(yǎng)基斜面上，適溫培養(yǎng)18-24h。試驗(yàn)方法：取一干凈的載波片，在上面滴1滴3-10%的HQ，挑取1環(huán)培養(yǎng)18-24h的菌苔，在HO溶液中涂抹，若有氣泡（氧氣）出現(xiàn)，，則為過氧化氫酶陽，性，無氣泡者為陰性。也可將過氧化氫溶液直接加入斜面上，觀察氣泡的產(chǎn)生。注意事項(xiàng)：過氧化氫酶是1種以正鐵血紅素作為輔基的酶，所以測(cè)試菌所生長(zhǎng)的培養(yǎng)基不可含有血紅素或紅血球。甲基紅（MR）試驗(yàn)?zāi)c桿菌科各菌屬都能發(fā)酵葡萄糖，在分解葡萄糖過程中產(chǎn)生丙酮酸，進(jìn)一步分解中，由于糖代謝的途徑不同，可產(chǎn)生乳酸，琥珀酸、醋酸和甲酸等大量酸性產(chǎn)物，可使培養(yǎng)基PH值下降至pH4.5以下，使甲基紅指示劑變紅。試驗(yàn)方法：挑取新的待試純培養(yǎng)物少許，接種于MR-VP生化鑒定管，于36通用培養(yǎng)基，培養(yǎng)于36±1°C或30°C（以30°C較好）3~5天，從第二天起，每日取培養(yǎng)液1ml，加甲基紅指示劑1~2滴，陽性呈鮮紅色，弱陽性呈淡紅色，陰性為黃色。迄至發(fā)現(xiàn)陽性或至第5天仍為陰性、即可判定結(jié)果。甲基紅為酸性指示劑，pH范圍為4.4~6.0，其pK值為5.0。故在pH5.0以下，隨酸度而增強(qiáng)黃色，在PH5.0以上，則隨堿度而增強(qiáng)黃色，在PH5.0或上下接近時(shí)，可能變色不夠明顯，此時(shí)應(yīng)延長(zhǎng)培養(yǎng)時(shí)間，重復(fù)試驗(yàn)。V-P試驗(yàn)?zāi)承┘?xì)菌在葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基中能分解葡萄糖產(chǎn)生丙酮酸，丙酮酸縮合，脫羧成乙酰甲基甲醇，后者在強(qiáng)堿環(huán)境下，被空氣中氧氧化為二乙酰，二乙酰與蛋白胨中的胍基生成紅色化合物，稱V-P（+）反應(yīng)。試驗(yàn)方法：O’Meara氏法：將試驗(yàn)菌接種于通用培養(yǎng)基，于36±1°C培養(yǎng)48h，培養(yǎng)液1ml加O’Meara試劑（加有0.3%肌酸Creatine或肌酸酐Creatinine的40%氫氧化鈉水溶液）1ml，搖動(dòng)試管1?2min，靜置于室溫或36±1°C恒溫箱，若4h內(nèi)不呈現(xiàn)伊紅、即判定為陰性。亦有主張?jiān)?8~50°C水浴放置2h后判定結(jié)果者。Barritt氏法:將試驗(yàn)菌接種于通用培養(yǎng)基，于36±1°C培養(yǎng)4天、培養(yǎng)液2.5ml先加入5°Ca萘酚（2-na-phthol）純酒精溶液0.6ml,再加40%氫氧化鉀水溶液0.2ml，搖動(dòng)2~5min，陽性菌常立即呈現(xiàn)紅色，若無紅色出現(xiàn)，靜置于室溫或36±1°C恒溫箱，如2h內(nèi)仍不顯現(xiàn)紅色、可判定為陰性?？焖俜ǎ簩?.5%肌酸溶液2滴放于小試管中、挑取產(chǎn)酸反應(yīng)的三糖鐵瓊脂斜面培養(yǎng)物一接種環(huán)，乳化接種于其中，加入5%a-萘酚3滴，40%氫氧化鈉水溶液2滴，振動(dòng)后放置5min，判定結(jié)果。不產(chǎn)酸的培養(yǎng)物不能使用。本試驗(yàn)一般用于腸桿菌科各菌屬的鑒別。在用于芽胞桿菌和葡萄球菌等其它細(xì)菌時(shí)，通用培養(yǎng)基中的磷酸鹽可阻礙乙酰甲基醇的產(chǎn)生，故應(yīng)省去或以氯化鈉代替。V.P試驗(yàn)?zāi)承┘?xì)菌在葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)液中能分解葡萄糖產(chǎn)生丙酮酸，丙酮酸縮合，脫羧成乙酰甲基甲醇，后者在強(qiáng)堿環(huán)境下，被空氣中氧，氧化為二乙酰，二乙酰與蛋白胨中的胍基生成紅色化合物，稱V-P（+）反應(yīng)。流程：培養(yǎng)液試管f標(biāo)記f接種f培養(yǎng)f觀察f記錄標(biāo)記試管取5支裝有葡萄糖蛋白胨培養(yǎng)液的試管，分別標(biāo)記大腸桿菌、產(chǎn)氣腸桿菌、普通變形菌、枯草芽匏桿菌和空白對(duì)照。接種培養(yǎng)以無菌操作分別接種少量菌苔至以上相應(yīng)試管中，空白對(duì)照管不接菌，置37C恒溫箱中，培養(yǎng)24-48h。觀察記錄取出以上試管，充分振蕩2min。每管分別加入40%Na0H溶液10-20滴，并加等量a-奈酚，振蕩試管，以使空氣中的氧溶入，置37C恒溫箱中保溫15—30min后，若培養(yǎng)液呈紅色，記錄為V.P.試驗(yàn)陽性反應(yīng)（用“+”表示）；若不呈紅色，記錄為V.P.試驗(yàn)陰性反應(yīng)（用“-”表示）。注意：原試管中留下的培養(yǎng)液用作甲基紅試驗(yàn)。硝酸鹽（Nitrate）還原試驗(yàn)有些細(xì)菌具有還原硝酸鹽的能力，可將硝酸鹽還原為亞硝酸鹽、氨或氮?dú)獾取喯跛猁}的存在可用硝酸試劑檢驗(yàn)。試驗(yàn)方法：臨試前將試劑的A（磺胺酸冰醋酸溶液）和B（a-萘胺乙醇溶液）試液各0.2ml等量混合、取混合試劑約0.1ml、加于液體培養(yǎng)物或瓊脂斜面培養(yǎng)物表面，立即或于10min內(nèi)呈現(xiàn)紅色即為試驗(yàn)陽，性，若無紅色出現(xiàn)則為陰，性。用a-萘胺進(jìn)行試驗(yàn)時(shí)，陽性紅色消退很快、故加入后應(yīng)立即判定結(jié)果。進(jìn)行試驗(yàn)時(shí)必須有未接種的培養(yǎng)基管作為陰性對(duì)照°a-萘胺具有致癌性、故使用時(shí)應(yīng)加注意。靛基質(zhì)（Imdole）試驗(yàn)?zāi)承┘?xì)菌能分解蛋白胨中的色氨酸，生成吲哚。吲哚的存在可用顯色反應(yīng)表現(xiàn)出來。吲哚與對(duì)二甲基氨基苯醛結(jié)合，形成玫瑰吲哚，為紅色化合物。試驗(yàn)方法：將待試純培養(yǎng)物小量接種于試驗(yàn)培養(yǎng)基管，于36±1C培養(yǎng)24h時(shí)后，取約2ml培養(yǎng)液，加入Kovacs氏試劑2~3滴，輕搖試管，呈紅色為陽性，或先加少量乙醚或二甲苯，搖動(dòng)試管以提取和濃縮靛基質(zhì)，待其浮于培養(yǎng)液表面后，再沿試管壁徐緩加入Kovacs氏試劑數(shù)滴，在接觸面呈紅色，即為陽性。實(shí)驗(yàn)證明靛基質(zhì)試劑可與17種不的靛基質(zhì)化合物作用而產(chǎn)生陽性反應(yīng)，若先用二甲苯或乙醚等進(jìn)行提取，再加試劑，則只有靛基質(zhì)或5-甲基靛基質(zhì)在溶劑中呈現(xiàn)紅色，因而結(jié)果更為可靠。吲哚試驗(yàn)有些細(xì)菌含有色氨酸酶，能分解蛋白胨中的色氨酸生成吲哚（靛基質(zhì)）。吲哚本身沒有顏色，不能直接看見，但當(dāng)加入對(duì)二甲基氨基苯甲醛試劑時(shí)，該試劑與吲哚作用，形成紅色的玫瑰吲哚。流程：標(biāo)記試管f接種f培養(yǎng)f觀察f記錄試管標(biāo)記取裝有蛋白胨水培養(yǎng)液的試管5支，分別標(biāo)記大腸桿菌、產(chǎn)氣腸桿菌、普通變形菌、枯草芽匏桿菌和空白對(duì)照。接種培養(yǎng)以無菌操作分別接種少量菌苔到以上相應(yīng)試管中，第5管作空白對(duì)照不接種，置37C恒溫箱中培養(yǎng)24-48h。觀察記錄在培養(yǎng)液中加入乙醚1-2ml，經(jīng)充分振蕩使吲哚萃取至乙醚中，靜置片刻后乙醚層浮于培養(yǎng)液的上面，此時(shí)沿管壁緩慢加入5一10滴吲哚試劑（加入吲哚試劑后切勿搖動(dòng)試管，以防破壞乙醚層影響結(jié)果觀察），如有吲哚存在，乙醚層呈現(xiàn)玫瑰紅色，此為吲哚試驗(yàn)陽性反應(yīng)，否則為陰性反應(yīng)，陽性用“十”、陰性用“-”表示。明膠（Gelatin）液化試驗(yàn)有些細(xì)菌具有明膠酶（亦稱類蛋白水解酶），能將明膠先水解為多肽，又進(jìn)一步水解為氨基酸，失去凝膠性質(zhì)而液化。試驗(yàn)方法：挑取18~24h待試菌培養(yǎng)物，以較大量穿刺接種于明膠高層約2/3深度或點(diǎn)種于平板培養(yǎng)基。于20?22C培養(yǎng)7?14天。明膠高層亦可培養(yǎng)于36±1C。每天觀察結(jié)果，若因培養(yǎng)溫度高而使明膠本身液化時(shí)應(yīng)不加搖動(dòng)、靜置冰箱中待其凝固后、再觀察其是否被細(xì)菌液化，如確被液化，即為試驗(yàn)陽，性。平板試驗(yàn)結(jié)果的觀察為在培養(yǎng)基平板點(diǎn)種的菌落上滴加試劑，若為陽，性，10?20min后，菌落周圍應(yīng)出現(xiàn)清晰帶環(huán)。否則為陰性。淀粉水解試驗(yàn)?zāi)承┘?xì)菌可以產(chǎn)生分解淀粉的酶，把淀粉水解為麥芽糖或葡萄糖。淀粉水解后，遇碘不再變藍(lán)色。試驗(yàn)方法：以18?24h的純培養(yǎng)物，涂布接種于淀粉瓊脂斜面或平板（一個(gè)平板可分區(qū)接種，試驗(yàn)數(shù)種培養(yǎng)物）或直接移種于淀粉肉湯中，于36±1°C培養(yǎng)24~48h，或于20。培養(yǎng)5天。然后將碘試劑直接滴浸于培養(yǎng)表面，若為液體培養(yǎng)物，則加數(shù)滴碘試劑于試管中。立即檢視結(jié)果，陽性反應(yīng)（淀粉被分解）為瓊脂培養(yǎng)基呈深藍(lán)色、菌落或培養(yǎng)物周圍出現(xiàn)無色透明環(huán)、或肉湯顏色無變化。陰性反應(yīng)則無透明環(huán)或肉湯呈深藍(lán)色。淀粉水解系逐步進(jìn)行的過程，因而試驗(yàn)結(jié)果與菌種產(chǎn)生淀粉酶的能力、培養(yǎng)時(shí)間，培養(yǎng)基含有淀粉量和pH等均有一定關(guān)系。培養(yǎng)基pH必須為中性或微酸性，以PH7.2最適。淀粉瓊脂平板不宜保存于冰箱，因而以臨用時(shí)制備為妥。硫化氫（H羅）試驗(yàn)有些細(xì)菌可分解培養(yǎng)基中含硫氨基酸或含硫化合物，而產(chǎn)生硫化氫氣體，硫化氫遇鉛鹽或低鐵鹽可生成黑色沉淀物。試驗(yàn)方法:在含有硫代硫酸鈉等指示劑的培養(yǎng)基中，沿管壁穿刺接種，于36±1C培養(yǎng)24~28h，培養(yǎng)基呈黑色為陽，性。陰，性應(yīng)繼續(xù)培養(yǎng)至6天。也可用醋酸鉛紙條法：將待試菌接種于一般營(yíng)養(yǎng)肉湯，再將醋酸鉛紙條懸掛于培養(yǎng)基上空，以不會(huì)被濺濕為適度；用管塞壓住置36±1C培養(yǎng)1?6天。紙條變黑為陽性。含碳化合物的利用細(xì)菌能否利用某些含碳化合物作為唯一碳源，反映該菌是否產(chǎn)生代謝這種化合物的有關(guān)酶系，因而作為鑒定依據(jù)。測(cè)定的基礎(chǔ)培養(yǎng)基配方很多，因種而異。現(xiàn)介紹1種合成的基礎(chǔ)培養(yǎng)基，有些細(xì)菌還可適當(dāng)補(bǔ)加各種維生素。培養(yǎng)基可制成液體，分裝試管，也可制成固體平板?？捎糜跍y(cè)定的底物種類很多，有單糖、雙糖、糖醇、脂肪酸、羥基酸及其他有機(jī)酸、醇、各種氨基酸類胺類以及碳?xì)浠衔锏?。糖的含量一般?%，醇類酚類等的含量一般為0.1-0.2%，氨基酸的含量一般為0.5%。因碳?xì)浠衔锊蝗苡谒?，可在液體培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)，或加入到45C的固體培養(yǎng)基中，振蕩后立即倒成平板。有些底物不宜用高壓滅菌，可用過濾法滅菌后加入已滅菌的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，某些醇類和酚類不必滅菌。接種和觀察結(jié)果：菌種最好做成懸液，避免帶入少量碳源干擾試驗(yàn)結(jié)果。平板培養(yǎng)用接種環(huán)點(diǎn)種，液體培養(yǎng)則用直針接種。每一測(cè)定菌必須接種未加碳水化合物的空白基礎(chǔ)培養(yǎng)基作對(duì)照。適溫培養(yǎng)2、5、7天后觀察，凡測(cè)定菌在有碳水化合物的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)情況，明顯超過空白培養(yǎng)基的生長(zhǎng)量為陽性，否則為陰性。假若兩種培養(yǎng)基上生長(zhǎng)情況差別不明顯，開在同一培養(yǎng)基上連續(xù)移種3次，如差別仍不明顯則以陰性論。葡萄糖的氧化發(fā)酵試驗(yàn)在細(xì)菌鑒定中，糖類發(fā)酵產(chǎn)酸是1項(xiàng)重要依據(jù)。細(xì)菌對(duì)糖類的利用有2種類型：1種是從糖類發(fā)酵產(chǎn)酸，不需要以分子氧作為最終受氫體，稱發(fā)酵型產(chǎn)酸；另一種則以分子氧作為最終受氫體，稱氧化型產(chǎn)酸。前者包括的菌種類型為多數(shù)。氧化型產(chǎn)酸量較少，所產(chǎn)生的酸常常被培養(yǎng)基中的蛋白胨分解時(shí)所產(chǎn)生的胺所中和，而不表現(xiàn)產(chǎn)酸。為此，Hugh和Leifson提出一種含有低有機(jī)氮的培養(yǎng)基，用以鑒定細(xì)菌從糖類產(chǎn)酸是屬氧化型產(chǎn)酸或發(fā)酵型產(chǎn)酸。這一試驗(yàn)廣泛用于細(xì)菌鑒定。一般用葡萄糖作為糖類代表。也可利用這一基礎(chǔ)培養(yǎng)基來測(cè)定細(xì)菌從其他糖類或醇類產(chǎn)酸的能力。接種：以18-24h的幼齡菌種，穿刺接種在上述培養(yǎng)基中，每株菌接4管，其中2管用油封蓋（凡士林：液體石蠟=1:1混合后滅菌），約加0.5-1厘米厚，以隔絕空氣為閉管。另2管不封油為開管，同時(shí)還要有不接種的閉管作對(duì)照。適溫培養(yǎng)1、2、4、7天觀察結(jié)果。結(jié)果觀察：氧化型產(chǎn)酸--僅開管產(chǎn)酸，氧化作用弱的菌株往往先在上部產(chǎn)堿（1-2d），后來才稍變酸。發(fā)酵型產(chǎn)酸則開管及閉管均產(chǎn)酸，如產(chǎn)氣，則在瓊脂柱內(nèi)產(chǎn)生氣泡。糖或醇類發(fā)酵試驗(yàn)不同微生物分解利用糖類的能力有很大差異，或能利用或不能利用，能利用者，或產(chǎn)氣或不產(chǎn)氣?？捎弥甘緞┘鞍l(fā)酵管檢驗(yàn)。試驗(yàn)方法：以無菌操作，用接種針或環(huán)移取純培養(yǎng)物少許，接種于發(fā)酵液體培養(yǎng)基管，若為半固體培養(yǎng)基，則用接種針作穿刺接種。接種后，置36±1.0°C培養(yǎng)，每天觀察結(jié)果，檢視培養(yǎng)基顏色有無改變（產(chǎn)酸），小倒管中有無氣泡，微小氣泡亦為產(chǎn)氣陽，性，若為半固體培養(yǎng)基，則檢視沿穿刺線和管壁及管底有無微小氣泡，有時(shí)還可看出接種菌有無動(dòng)力，若有動(dòng)力、培養(yǎng)物可呈彌散生長(zhǎng)。本試驗(yàn)主要是檢查細(xì)菌對(duì)各種糖、醇和糖苷等的發(fā)酵能力，從而進(jìn)行各種細(xì)菌的鑒別，因而每次試驗(yàn)，常需同時(shí)接種多管。一般常用的指示劑為酚紅、溴甲酚紫，溴百里藍(lán)和An-drade指示劑。注：對(duì)于糖醇類發(fā)酵現(xiàn)在一般用糖、醇類細(xì)菌微量生化鑒定管在36C18-24h即可出結(jié)果。酪素水解試驗(yàn)（酪蛋白水解）牛奶平板的制備：取5g脫脂奶粉加入50mL蒸餾水中（或用50mL脫脂牛奶），另稱1.5g瓊脂溶于50mL蒸餾水中，將兩液分開滅菌。待冷至45-50C時(shí)，將兩液混勻倒平板，即成牛奶平板。將平板倒置過夜，使表面水分干燥，然后將菌種點(diǎn)接在平板上，每皿可點(diǎn)接3-5株菌。適溫培養(yǎng)1、3、5天，記錄菌落周圍和下面酪素是否已被分解而呈透明。配制該培養(yǎng)基時(shí)，切勿將牛奶和瓊脂混合滅菌，以防牛奶凝固。酪氨酸水解將L-酪氨酸0.5g懸浮于10mL蒸餾水中，8磅20分鐘滅菌，然后于100mL無菌的營(yíng)養(yǎng)肉湯瓊脂混合，傾倒平板，待凝固后，將測(cè)試菌接種于平皿上，培養(yǎng)7到14d，記錄酪氨酸結(jié)晶是否被水解而變透明。耐鹽性試驗(yàn)本試驗(yàn)是觀察滲透壓對(duì)細(xì)菌生長(zhǎng)的影響。由于不同菌類耐鹽性不同，故常以此作為鑒別特征。一般可根據(jù)不同種類的菌株，選擇其適合生長(zhǎng)的培養(yǎng)基，在其中加入不同量的NaCl，接種后觀察其生長(zhǎng)與否，以判斷其耐鹽，性。以肉湯培養(yǎng)液根據(jù)鑒定需要，配成不同濃度的NaCl，如2%、3.5%、5%、7%、10%等。培養(yǎng)基要求十分澄清，接種時(shí)應(yīng)采用幼齡菌液，直針接種，適溫培養(yǎng)3-7d，與未接種的對(duì)照管對(duì)比，目測(cè)生長(zhǎng)情況。卵磷脂酶的測(cè)定菌體如存在有卵磷脂酶，就能使卵磷脂分解生成脂肪和水溶性的磷酸膽堿。接種與觀察結(jié)果:將測(cè)試菌的菌液，環(huán)接在有卵黃的試管和不加卵黃的對(duì)照管中，適溫培養(yǎng)1、3或5天觀察。假若與對(duì)照管相比較，在卵黃胰胨液中或表面，形成白色沉淀者，則為陽性反應(yīng)，表示卵磷脂被分解，生成脂肪和水溶性的磷酸膽堿，說明有卵磷酶的存在。另一種方法：以無菌操作取出卵黃，放入滅菌的三角瓶中，加相當(dāng)于等量的生理鹽水搖勻后，取10mL卵黃液加入到溶化的約50-55C的200mL肉汁胨瓊脂培養(yǎng)基中，混合均勻后倒入培養(yǎng)皿，制成卵黃平板，過夜后即可使用。接種與觀察結(jié)果：將測(cè)試菌點(diǎn)接在卵黃平板上，每皿可分散點(diǎn)接4-5株菌、（芽匏桿菌以點(diǎn)接1-2株菌為宜）以不影響結(jié)果觀察為度，如測(cè)試厭氧菌，則須在上面加蓋無菌的蓋玻片。每株菌至少重復(fù)點(diǎn)接兩皿。適溫培養(yǎng)1-2d觀察，在菌落周圍形成乳白色混濁環(huán)，表示卵磷脂被分解，生成脂肪，說明該菌株有卵磷脂酶存在。15檸檬酸鹽或丙酸鹽的利用某些細(xì)菌能利用檸檬酸鹽或丙酸鹽作為碳源，及磷酸胺作為氮源，將檸檬酸分解為二氧化碳，則培養(yǎng)基中由于有游離鈉離子存在而呈堿性。接種與觀察結(jié)果：取幼齡菌種接種于斜面上，適溫培養(yǎng)3-7天，培養(yǎng)基呈堿性（藍(lán)色）者為陽性反應(yīng)，不變者則為陰性。丙二酸鹽利用試驗(yàn)丙二酸鹽是三羧酸循環(huán)中琥珀酸脫氫酶的抑制劑。能否利用丙二酸鹽，也是細(xì)菌鑒定中的一個(gè)鑒別性特征。許多微生物代謝有三羧酸循環(huán)，而琥珀酸脫氫是三羧酸循環(huán)的一個(gè)環(huán)節(jié)，丙二酸與琥珀酸競(jìng)爭(zhēng)琥珀酸脫氫酶，與丙二酸不被分解，所以琥珀酸脫氫酶被占據(jù)，不能釋放出來催化琥珀酸脫氫反應(yīng)，抑制了三羧酸循環(huán)。接種和觀察結(jié)果：用幼齡菌種接種測(cè)定培養(yǎng)基和空白培養(yǎng)基，于適溫培養(yǎng)1-2d，觀察培養(yǎng)基變色情〉兄。如測(cè)定培養(yǎng)基生長(zhǎng)并變藍(lán)色，表示可利用丙二酸鹽，為陽性結(jié)果。反之，如測(cè)定培養(yǎng)基未變色，而空白對(duì)照培養(yǎng)基生長(zhǎng)，則為陰，性，即不利用丙二酸鹽。對(duì)溶菌酶抗性的測(cè)定在100mL的三角瓶中，放入60-65mL無菌的0.01mol/LHCL，在其中加入0.1g溶菌酶，瓶上塞無菌棉花，在小火上煮沸20分鐘后，冷到室溫，加無菌的0.01mol/LHCL補(bǔ)足到100mL。取1mL溶菌酶溶液與99mL無菌的肉湯培養(yǎng)液混合，分裝無菌試管，每管2.5mL，在含有0.001%溶菌酶肉湯管子及無溶菌酶的營(yíng)養(yǎng)肉湯對(duì)照管中，各接種1環(huán)菌液，適溫培養(yǎng)5-7d，記錄兩管的生長(zhǎng)情況。在pH5.7營(yíng)養(yǎng)肉湯上的生長(zhǎng)本試驗(yàn)應(yīng)用于芽匏桿菌屬中種的鑒定。接種和觀察結(jié)果：取菌液一環(huán)，接種于上述培養(yǎng)基中，同時(shí)接種普通肉湯液（7.2pH）作對(duì)照。適溫培養(yǎng)1-3d后觀察生長(zhǎng)情況。該培養(yǎng)液要求十分澄清，pH必須準(zhǔn)確，最好用pH計(jì)調(diào)測(cè)。需氧性試樣若在培養(yǎng)基中加入還原劑，如疏基醋酸鈉和甲醛次硫酸鈉等，以除去培養(yǎng)基中的氧氣或氧化型物質(zhì)，使厭氧菌能在有氧情況下生長(zhǎng)。接種與觀察結(jié)果：用1小環(huán)（外徑1.5毫米的接種環(huán)）的肉湯菌液，穿刺接種到上述培養(yǎng)基中，必須穿刺到管底°30C培養(yǎng)，分別在3至7天觀察結(jié)果。如細(xì)菌在瓊脂柱表面上生長(zhǎng)者為好氧菌，如沿著穿刺線上生長(zhǎng)者為厭氧菌或兼性厭氧菌。生長(zhǎng)溫度的測(cè)定細(xì)菌生長(zhǎng)的最高、最適和最低溫度，常常是某些細(xì)菌鑒定的特征之一。測(cè)定細(xì)菌的生長(zhǎng)溫度，要求培養(yǎng)液十分清晰（如普通肉湯培養(yǎng)液），并采用液體菌種直針接種（不用接種環(huán)接種）。放置于恒溫水浴培養(yǎng)。指示溫度計(jì)應(yīng)放在同樣的試管和培養(yǎng)基內(nèi)，在指定溫度下培養(yǎng)2-5d，觀察生長(zhǎng)情況。在接近0C的低溫培養(yǎng)，則觀察時(shí)間可延長(zhǎng)至7-10d，甚至30d。觀察記錄結(jié)果：目測(cè)生長(zhǎng)情）兄，與未接種的空白培養(yǎng)基對(duì)比，注意混濁度、沉淀物和懸浮物等項(xiàng)，并分級(jí)記錄如下：“+“:表示生長(zhǎng)良好；與對(duì)照管相比，可清楚地判定是混濁的。“+-“:表示生長(zhǎng)差；與對(duì)照管相比，只有在某一觀察角度時(shí)方能看到明顯的混濁?！?“：表示不生長(zhǎng)；在適宜的角度下觀察，與對(duì)照無差異?？傊?，培養(yǎng)5d，能生長(zhǎng)者均按生長(zhǎng)計(jì)，否則按不生長(zhǎng)計(jì)，凡培養(yǎng)5d仍屬可疑者或不生長(zhǎng)者必須重測(cè)，在重測(cè)時(shí)，可能出現(xiàn)有時(shí)生長(zhǎng)，有時(shí)不生長(zhǎng)的不穩(wěn)定現(xiàn)象，這可能有兩種原因：一種是水浴溫度不穩(wěn)定，培養(yǎng)時(shí)溫度波動(dòng)大；另一種原因可能是所測(cè)定的溫度，恰好是測(cè)定菌的臨界生長(zhǎng)溫度，在這種情況下，可用提高一度或降低一度的辦法肯定之。必須注意，當(dāng)測(cè)定的試管較多時(shí)，不可將試管捆成一捆浸于水浴中，這樣捆著的試管內(nèi)外溫度不一致，易出現(xiàn)誤差。最好用特制試管架放試管，所用溫度計(jì)應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)溫度計(jì)標(biāo)定過。尿素酶（Urease）試驗(yàn)有些細(xì)菌能產(chǎn)生尿素酶，將尿素分解、產(chǎn)生2個(gè)分子的氨，使培養(yǎng)基變?yōu)閴A性，酚紅呈粉紅色。尿素酶不是誘導(dǎo)酶，因?yàn)椴徽摰孜锬蛩厥欠翊嬖冢?xì)菌均能合成此酶。其活性最適pH為7.0。試驗(yàn)方法：挑取18?24h待試菌培養(yǎng)物大量接種于液體培養(yǎng)基管中，搖均，于36±1C培養(yǎng)10,60和120min，分別觀察結(jié)果。或涂布并穿刺接種于瓊脂斜面，不要到達(dá)底部，留底部作變色對(duì)照。培養(yǎng)2,4和24h分別觀察結(jié)果，如陰性應(yīng)繼續(xù)培養(yǎng)至4天，作最終判定，變?yōu)榉奂t色為陽/性。氧化酶（Oxidase）試驗(yàn)氧化酶亦即細(xì)胞色素氧化酶，為細(xì)胞色素呼吸酶系統(tǒng)的終末呼吸酶，氧化酶先使細(xì)胞色素C氧化，然后此氧化型細(xì)胞色素C再使對(duì)苯二胺氧化，產(chǎn)生顏色反應(yīng)。試驗(yàn)方法：在瓊脂斜面培養(yǎng)物上或血瓊脂平板菌落上滴加試劑1~2滴，陽性者Kovacs氏試劑呈粉紅色?深紫色，Ewing氏改進(jìn)試劑呈藍(lán)色。陰性者無顏色改變。應(yīng)在數(shù)分鐘內(nèi)判定試驗(yàn)結(jié)果。注意事項(xiàng)：鹽酸二甲基對(duì)苯撐二胺溶液容易氧化，溶液應(yīng)裝在棕色瓶中，并在冰箱內(nèi)保存，如溶液變?yōu)榧t褐色，即不宜使用。鐵、鐐鉻絲等金屬可催化二甲基對(duì)苯撐二胺呈紅色反應(yīng)，若用它來挑取菌苔，會(huì)出現(xiàn)假陽，性，故必須用白金絲或玻璃棒（或牙簽）來挑取菌苔。在濾紙上滴加試劑，以剛剛打濕濾紙為宜，如濾紙過濕，會(huì)防礙空氣與菌苔接觸，從而延長(zhǎng)了反應(yīng)時(shí)間，造成假陰性。三糖鐵（TSI）瓊脂試驗(yàn)試驗(yàn)方法：以接種針挑取待試菌可疑菌落或純培養(yǎng)物，穿刺接種并涂布于斜面，置36±1C培養(yǎng)18~24h，觀察結(jié)果。本試驗(yàn)可同時(shí)觀察乳糖和蔗糖發(fā)酵產(chǎn)酸或產(chǎn)酸產(chǎn)氣（變黃）；產(chǎn)生硫化氫（變黑）。葡萄糖被分解產(chǎn)酸可使斜面先變黃，但因量少，生成的少量酸，因接觸空氣而氧化，加之細(xì)菌利用培養(yǎng)基中含氮物質(zhì)，生成堿性產(chǎn)物，故使斜面后來又變紅，底部由于是在厭氧狀態(tài)下，酸類不被氧化，所以仍保持黃色。氨基酸脫羧酶的測(cè)定有些細(xì)菌含有氨基酸脫羧酶，使羧基釋出，生成胺類和二氧化碳。此反應(yīng)在偏酸的條件下進(jìn)行。當(dāng)培養(yǎng)基含胺類時(shí)呈堿性反應(yīng)，使指示劑變色。接種與觀察結(jié)果：用