第二章蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能

第一節(jié)蛋白質(zhì)的分子組成（凱氏）定氮法來推算樣品中蛋白質(zhì)的大致含量：每克樣品中所含蛋白質(zhì)的克數(shù)=每克樣品中的含氮量6.25。一、蛋白質(zhì)的元素組成主要元素含量碳50%55%氫6%7%氧19%24%氮13%19%（平均16%）硫0%4%人文視角三鹿奶粉事件發(fā)生時(shí)間：2008年6月原因：三鹿奶粉添加三聚氰胺，俗稱“蛋白精”。三聚氰胺的性狀：。危害：在體內(nèi)形成的三聚氰胺氰尿酸鹽，易在腎臟結(jié)晶沉淀，造成腎結(jié)石。為何添加：食品和飼料工業(yè)通常采用“凱氏定氮法”測定試樣中的含氮量。商人獲利：蛋白質(zhì)含量每增加一個(gè)百分點(diǎn)，用三聚氰胺的花費(fèi)只有真實(shí)蛋白原料的1/5。二、蛋白質(zhì)的基本組成單位—氨基酸

（一）氨基酸的結(jié)構(gòu)組成蛋白質(zhì)的編碼氨基酸有20種，除甘氨酸（無不對稱碳原子）外，均為L--氨基酸（二）氨基酸的分類根據(jù)氨基酸R基團(tuán)在中性溶液中的極性和解離狀態(tài)不同分為三類：中性氨基酸、酸性氨基酸、堿性氨基酸。1．中性氨基酸（1）非極性疏水性氨基酸（2）極性疏水性氨基酸2．酸性氨基酸3．堿性氨基酸（三）氨基酸的理化性質(zhì)1．等電點(diǎn)（isoelectricpoint，pI）氨基酸解離成陰、陽離子程度相同時(shí)溶液的pH。氨基酸的等電點(diǎn)（pI）計(jì)算：氨基酸解離時(shí)其兼性離子兩邊pK的算術(shù)平均值。以賴氨酸（Lys）為例：pI=1/2（pK2+pKR）=1/2（8.95+10.53）=9.74

2．氨基酸的紫外吸收芳香族氨基酸（Tyr、Trp、Phe）分子中含有共軛雙鍵，使得它們具有吸收紫外光的特性，最大吸收波長是在280nm。3．氨基酸與茚三酮的呈色反應(yīng)此反應(yīng)可用于氨基酸的定性和定量分析第二節(jié)蛋白質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)一、肽鍵與肽肽鍵（peptidebond）是一個(gè)氨基酸的-羧基和另一氨基酸的-氨基脫水縮合所形成的酰胺鍵。氨基酸以肽鍵相連接形成的化合物稱為肽。蛋白質(zhì)分子中的氨基酸之間即是以肽鍵相連。人體內(nèi)有一些生理活性物質(zhì)是由幾個(gè)至幾十個(gè)氨基酸殘基組成的肽，統(tǒng)稱為生物活性肽。某些生物活性肽的氨基酸組成與功能名稱氨基酸組成生理功能促甲狀腺素釋放激素焦谷?組?脯-NH2來自下丘腦，促進(jìn)腺垂體分泌促甲狀腺素甲硫氨酸腦啡肽H?酪?甘?甘?苯丙?甲硫?OH腦中抑制痛覺的阿片樣肽血管緊張素Ⅱ（牛）H?天?精?纈?酪?異?組?脯?苯丙?OH升高血壓，刺激腎上腺皮質(zhì)分泌醛固酮抗利尿激素（加壓素）

神經(jīng)垂體分泌，促進(jìn)腎保留水

血漿緩激肽（牛）H?精?脯?脯?甘?苯丙?絲?脯?苯丙?精?OH血管舒張肽P物質(zhì)H?精?脯?賴?脯?谷胺?苯丙?甘?亮?甲硫-NH2神經(jīng)遞質(zhì)胰高血糖素（牛）H?組?絲?谷胺?甘?蘇?苯丙?蘇?絲?天?酪?絲?賴?酪?亮?天?絲?精?精?丙?谷胺?天?苯丙?纈?谷胺?色?亮?甲硫?天胺?蘇-OH胰島細(xì)胞分泌的激素，具有升高血糖的作用二、蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)分子中多肽鏈的氨基酸排列順序和二硫鍵的位置。一級結(jié)構(gòu)的化學(xué)鍵主要是肽鍵。二、蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)

（一）蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)指蛋白質(zhì)分子中多肽鏈局部肽段主鏈原子的空間分布狀態(tài)，不涉及其側(cè)鏈原子的空間排布。1．肽單元（peptideunit）或肽鍵平面形成肽鍵的C原子和N原子及與它們相連的兩個(gè)α碳原子、O原子和H原子共處于同一平面。2．蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)的主要構(gòu)象及特點(diǎn)常見的有-螺旋、-折疊、-轉(zhuǎn)角和無規(guī)卷曲。維系蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)的主要化學(xué)鍵是氫鍵。（1）-螺旋（-helix）（2）-折疊（-pleatedsheet）（3）-轉(zhuǎn)角或-回折（-turn或-bend）（4）無規(guī)卷曲（randomcoil）幾種蛋白質(zhì)中二級結(jié)構(gòu)的特征蛋白質(zhì)氨基酸數(shù)分子量α-螺旋數(shù)β-折疊數(shù)β-轉(zhuǎn)角數(shù)胰島素515733310核糖核酸酶A12413700362細(xì)胞色素C10413000506溶菌酶12914300666肌紅蛋凝乳蛋白2412163031217碳酸酐酶258280007134羧基肽酶A307346009813模體（motif）：是指蛋白質(zhì)分子中具有二級結(jié)構(gòu)的肽段相互靠近，形成具有特定功能的空間構(gòu)象，或者僅是一個(gè)具有特定功能的很短的肽段。模體結(jié)構(gòu)層次介于二級結(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu)之間，亦稱為超二級結(jié)構(gòu)（二）蛋白質(zhì)的三級結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)多肽鏈中所有原子（包括主鏈和側(cè)鏈）在三維空間的排布位置與它們的相互關(guān)系。由一條肽鏈構(gòu)成的蛋白質(zhì)分子發(fā)揮生物學(xué)功能必須具備完整的三級結(jié)構(gòu)穩(wěn)定蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)的力量主要是側(cè)鏈間的非共價(jià)鍵，如氫鍵、離子鍵（鹽鍵）、疏水作用、VanderWaals力等。這些非共價(jià)鍵統(tǒng)稱次級鍵結(jié)構(gòu)域（domain）：分子較大的蛋白質(zhì)分子中，多肽鏈在形成三級結(jié)構(gòu)時(shí)可形成一個(gè)或數(shù)個(gè)球狀或纖維狀的區(qū)域，折疊得較為緊密，各行其功能。（三）蛋白質(zhì)的四級結(jié)構(gòu)許多蛋白質(zhì)含有兩條以上具有獨(dú)立三級結(jié)構(gòu)的多肽鏈，這些多肽鏈通過非共價(jià)鍵相互相互作用形成的多聚體結(jié)構(gòu)。每條具有獨(dú)立三級結(jié)構(gòu)的多肽鏈則稱為此蛋白質(zhì)的亞基（subunit）。穩(wěn)定蛋白質(zhì)四級結(jié)構(gòu)的化學(xué)鍵是氫鍵、離子鍵、疏水作用和VanderWaals力等非共價(jià)鍵。具有四級結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)，只有完整的四級結(jié)構(gòu)才有活性，各單獨(dú)的亞基通常無生物活性。第三節(jié)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系

一、蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)是其空間結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)，通常一級結(jié)構(gòu)相似的蛋白質(zhì)其空間結(jié)構(gòu)也相似，功能也相似。

胰島素分子中氨基酸殘基的差異部分來源A8A9A10B30人ThrSerIleThr豬ThrSerIleAla狗ThrSerIleAla兔ThrSerIleSer牛AlaSerValAla羊AlaGlyValAla馬ThrGlyIleAla抹香鯨ThrSerIleAla由于蛋白質(zhì)分子中氨基酸的變異所導(dǎo)致的疾病被稱為“分子病”。例如，鐮狀紅細(xì)胞性貧血研究不同種屬之間同一蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)的差異，有助與人們了解物種進(jìn)化之間的相互關(guān)系。二、蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系成人HbA1由兩個(gè)α亞基和兩個(gè)β亞基組成的的四聚體（α2β2）蛋白，它們通過8個(gè)離子鍵相連血紅蛋白（Hb）分子有緊張態(tài)（T態(tài)）和松弛態(tài)（R態(tài)）兩種構(gòu)象變化。O2與Hb結(jié)合的正協(xié)同效應(yīng)Hb的一個(gè)亞基上的Fe2+與O2結(jié)合后，F(xiàn)e2+落入卟啉環(huán)內(nèi)，這樣又帶動(dòng)F8組氨酸向卟啉環(huán)移位，同時(shí)也帶動(dòng)了-螺旋F的相應(yīng)移位。

-螺旋F的相應(yīng)移位這一微小的構(gòu)象變化首先引起α1/α2亞基之間鹽鍵的斷裂，使α1/β1和α2/β2的長軸形成15o的夾角，結(jié)構(gòu)顯得相對松弛（R態(tài)），增加與O2的親和力由于蛋白質(zhì)發(fā)生錯(cuò)誤折疊導(dǎo)致的疾病稱為蛋白質(zhì)構(gòu)象病。例如，瘋牛?。╩adcowdisease）（α-螺旋為36.1%，β-折疊為11.9%)(α-螺旋為30%，β-折疊為43%)開放性討論題：朊病毒及其致病機(jī)制提示：1．朊（病毒）蛋白（PrP）表達(dá)的組織細(xì)胞2．細(xì)胞朊（病毒）蛋白（PrPc）具有哪些生理功能？3．異常的朊（病毒）蛋白（PrPsc）即朊病毒是如何形成的？4．PrPsc與PrPc在結(jié)構(gòu)和理化性質(zhì)上有哪些不同？5．朊病毒（PrPsc）致病作用如何？6．朊病毒的傳播方式7.攝入朊病毒顆粒，它能逃避消化？第四節(jié)蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)

一、蛋白質(zhì)的兩性解離和等電點(diǎn)

二、蛋白質(zhì)的膠體性質(zhì)維持蛋白質(zhì)膠粒在溶液中穩(wěn)定的兩大因素:①蛋白質(zhì)分子之間相同電荷的相斥作用;②蛋白質(zhì)表面水化膜的相互隔離作用.三、蛋白質(zhì)的變性、沉淀與凝固

（一）蛋白質(zhì)的變性（denaturation）蛋白質(zhì)變性破壞其空間結(jié)構(gòu)（次級鍵甚或二硫鍵斷裂），但一級結(jié)構(gòu)沒有被破壞，即肽鍵未斷裂。（二）蛋白質(zhì)沉淀若去除蛋白質(zhì)的水化膜和中和其電荷，蛋白質(zhì)便發(fā)生沉淀。蛋白質(zhì)溶液的pH接近于蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)時(shí)，蛋白質(zhì)易于沉淀。（三）蛋白質(zhì)的凝固在接近于蛋白質(zhì)等電點(diǎn)的條件下加熱可使蛋白質(zhì)變性凝固。沉淀的蛋白質(zhì)不一定變性；變性的蛋白質(zhì)也不一定沉淀。四、蛋白質(zhì)的光譜吸收與呈色反應(yīng)（一）蛋白質(zhì)溶液的紫外吸收由于蛋白質(zhì)分子中酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸殘基，因此蛋白質(zhì)在280nm有最大的紫外吸收峰?？捎眠@一性質(zhì)測定蛋白質(zhì)含量。（二）蛋白質(zhì)的呈色反應(yīng)蛋白質(zhì)分子中的肽鍵及側(cè)鏈上的各種特殊基團(tuán)可以和有關(guān)試劑呈現(xiàn)一定的顏色反應(yīng)，這些反應(yīng)長被用于蛋白質(zhì)的定性、定量分析。例如，雙縮脲呈色反應(yīng)、酚試劑呈色反應(yīng)、考馬斯亮藍(lán)顯色法第五節(jié)蛋白質(zhì)的分離、純化及結(jié)構(gòu)分析一、蛋白質(zhì)的分離與純化依據(jù)是不同的蛋白質(zhì)在理化性質(zhì)方面的差異，可采用不同的方法從一個(gè)樣品中分離純化蛋白質(zhì)。（一）依據(jù)蛋白質(zhì)溶解度差異的分離純化方法1．鹽析法利用高濃度的中性鹽將蛋白質(zhì)從溶液中析出的方法叫做鹽析（saltingout）。鹽析是蛋白質(zhì)和酶分離純化中最廣泛應(yīng)用的方法。鹽析的原理是親水性強(qiáng)的中性鹽離子可爭奪蛋白質(zhì)表面的水化膜，同時(shí)中和蛋白質(zhì)表面的電荷。2．有機(jī)溶劑沉淀法蛋白質(zhì)的提取純化也常使用與水互溶的有機(jī)溶劑．一方面，有機(jī)溶劑能降低溶液的介電常數(shù)，從而增加蛋白質(zhì)分子之間的相互吸引，導(dǎo)致溶解度下降；另一方面，有機(jī)溶劑與水作用，破壞蛋白質(zhì)表面水化膜，（二）依據(jù)蛋白質(zhì)分子大小差異的分離純化方法１離心技術(shù)離心（centrifugation）分離是利用機(jī)械的快速旋轉(zhuǎn)所產(chǎn)生的離心力，將不同密度的物質(zhì)分離開來的方法。超速離心法不僅用于分離純化蛋白質(zhì)，還可測定蛋白質(zhì)的相對分子質(zhì)量。2．凝膠過濾層析當(dāng)樣品中的各組分隨流動(dòng)相流經(jīng)多孔的凝膠固定相時(shí)，根據(jù)各組分的分子大小不同而分離。凝膠過濾層析還可用于測定未知蛋白質(zhì)的相對分子質(zhì)量。3．透析與超濾透析（dialysis）是利用具有半透膜性質(zhì)的透析袋將大分子的蛋白質(zhì)與小分子化合物分開的方法。超濾（ultrafiltration）是在一定壓力作用下，使蛋白質(zhì)溶液中的小分子物質(zhì)通過具有一定孔徑的超濾膜，而蛋白質(zhì)被截留的一種分離純化方法。（三）依據(jù)蛋白質(zhì)電荷差異的分離純化方法1．電泳技術(shù)（1）SDS（常用）按蛋白質(zhì)分子大小進(jìn)行分離用于測定蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量。2．等電聚焦電泳原理：蛋白質(zhì)在具有一定的pH梯度的電場中進(jìn)行電泳，蛋白質(zhì)按等電點(diǎn)的不同而分離。３．雙向電泳：先進(jìn)行等電聚焦電泳（第一相電泳）；再進(jìn)行SDS（平板電泳）（第二相電泳）2．離子交換層析利用離子交換劑上的可交換離子與周圍介質(zhì)中被分離的各種離子間的靜電引力不同，經(jīng)過交換平衡達(dá)到分離的一種層析方法法。（四）依據(jù)生物功能專一性差異的分離純化方法親和層析二、蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)分析（一）蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)分析1．多肽鏈氨基酸組成分析2．多肽鏈氨基酸序列測定Edman降解法、質(zhì)譜法、推演法。（二）蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)分析方法1．X射線衍