產(chǎn)前診斷人才細(xì)胞的細(xì)胞原位培養(yǎng)

1973年，steele等人。1材料和方法1.1產(chǎn)前診斷指征選擇2010年6-12月于廣東省婦幼保健院優(yōu)生門診進(jìn)行羊水產(chǎn)前診斷者1274人。產(chǎn)前診斷指征包括唐氏篩查高風(fēng)險(xiǎn)、高齡、不良生育史等。使用新型載片培養(yǎng)瓶(簡稱載片瓶)對1274例進(jìn)行羊水培養(yǎng),同時(shí)使用載片培養(yǎng)皿(簡稱載片皿)培養(yǎng)作為對照,即本實(shí)驗(yàn)室原培養(yǎng)法1.2方法1.2.1l棄去除除在超聲定位、無菌條件下抽取羊水,最初2ml棄去后收集25ml,按照10、10、5m分裝于3支無菌離心管。前2支隨機(jī)分為研究組和對照組培養(yǎng),第3支用于QF-PCR快速診斷。1.2.2實(shí)驗(yàn)材料Chang氏培養(yǎng)基,固定液,載片瓶(9cm1.2.3風(fēng)導(dǎo)率的制備將2支10ml羊水1000r/min離心8min后,棄上清,加入Chang氏培養(yǎng)基8ml,搖勻后分別加入2個(gè)載片瓶,于37℃、5%CO1.2.4配套撬片器撬片時(shí)間g加入20μg/ml秋水仙素20μl,3h后去掉培養(yǎng)基,加入1%枸櫞酸鈉3ml,低滲時(shí)間按表1調(diào)整。預(yù)固定(甲醇:冰醋酸為3∶1)10min,后固定30min,共4次后即使用配套撬片器撬片,室內(nèi)自然干片。60℃烤片過夜,次日G顯帶分析。對照組接種與收獲按原方法進(jìn)行1.2.5核分析根據(jù)產(chǎn)前診斷羊水染色體分析標(biāo)準(zhǔn)1.3統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,非正態(tài)分布或末端無確定數(shù)值變量用中位數(shù)表示平均水平,組間比較采用χ2結(jié)果2.1成功培訓(xùn)2.2培養(yǎng)周期研究組培養(yǎng)時(shí)間5～8d,平均6.7d;對照組6～10d,平均8.9d,兩組培養(yǎng)天數(shù)比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2.3細(xì)胞克隆數(shù)研究組每個(gè)載片培養(yǎng)瓶細(xì)胞克隆數(shù)平均11.5個(gè),對照組6.0個(gè),兩組細(xì)胞克隆數(shù)比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2.4核型號的分析研究組每個(gè)克隆可分析核型數(shù)平均6.23個(gè),對照組為6.27個(gè),兩組可分析核型數(shù)比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2.5d患者選擇學(xué)習(xí)時(shí),其符合以下情況核型分析1274例,正常1225例,占96.15%;異常49例,占3.85%。鑲嵌體34例,Ⅰ級水平25例,Ⅱ級水平7例,Ⅲ級水平2例(表5),其中真性鑲嵌體3例。3個(gè)單、雙體-單、循環(huán)在產(chǎn)前診斷的表現(xiàn)—討論本研究對同一樣本進(jìn)行兩組原位培養(yǎng),成功率均達(dá)100%。但研究組在培養(yǎng)時(shí)間和細(xì)胞克隆數(shù)上優(yōu)于對照組,可能原因?yàn)?(1)研究組中載片瓶與細(xì)胞懸液接觸面積大,細(xì)胞容易分散生長;(2)載片瓶接種后無需加液,細(xì)胞更快更容易貼壁生長;而對照組接種后48h加液,細(xì)胞靜置生長延長;(3)載片瓶設(shè)計(jì)的特點(diǎn),加液速度快,收獲后直接成片;對照組需逐滴緩慢加液按照產(chǎn)前診斷羊水核型分析標(biāo)準(zhǔn)鑲嵌體是指同一個(gè)體里同時(shí)存在來源于同一個(gè)合子的2個(gè)或2個(gè)以上不同細(xì)胞系的現(xiàn)象關(guān)于鑲嵌體的研究,國外分為三級:Ⅰ級水平:單個(gè)核型異常,常被認(rèn)為是假性,不予報(bào)告。Ⅱ級水平:2個(gè)或以上核型發(fā)生相同異常,并局限在同一個(gè)原位培養(yǎng)皿,包括單個(gè)克隆的多個(gè)細(xì)胞異常,和2個(gè)克隆以上發(fā)生的異常,但這些異常在其他培養(yǎng)皿沒有發(fā)現(xiàn)。這種Ⅱ級水平異常通常也被認(rèn)為是假性鑲嵌體,通常也不予報(bào)告。原因可能為母體組織污染、單個(gè)細(xì)胞不分離或合子后發(fā)生異常、未能識別的雙卵雙胎中異常的胎兒發(fā)生早期死亡后其滋養(yǎng)細(xì)胞殘存等本研究產(chǎn)前診斷羊水鑲嵌體中,Ⅰ級水平25例,占總數(shù)1.96%;Ⅱ級水平7例,占0.55%;Ⅲ級水平2例,占0.157%;母體組織污染1例,占0.078%,均低于國外研究經(jīng)本研究發(fā)現(xiàn),Ⅱ級中單個(gè)克隆異常的有6例,孕中期超聲均未見異常;3個(gè)克隆相同異常的1例,結(jié)果為mos47,XXY[3]/46,XY[27],該例孕婦通過臍帶血染色體分析結(jié)果mos47,XXY[7]/46,XY[43],最后選擇引產(chǎn)。Ⅲ級的有2例,其中一結(jié)果為mos47,XY,+22[11]/46,XY[9],該例超聲發(fā)現(xiàn)胎兒異常,包括法洛氏四聯(lián)征、單臍動(dòng)脈等,該孕婦選擇引產(chǎn);另一例結(jié)果為mos45,X[22]/46,XY[2],超聲未見異常,建議進(jìn)行胎兒臍帶血分析,但最后孕婦由于個(gè)人因素還是選擇引產(chǎn)。通過本研究,認(rèn)為除了Ⅰ級與Ⅱ級中單個(gè)克隆異常不需報(bào)告以外,Ⅱ級中多個(gè)克隆異常與Ⅲ級均應(yīng)該報(bào)告,以提示臨床醫(yī)生予以警惕。本研究病例Ⅱ級中盡管只有3個(gè)克隆,但是已經(jīng)足夠代表胎兒染色體發(fā)生異常。根據(jù)以往的經(jīng)驗(yàn),如果發(fā)現(xiàn)真性鑲嵌體,應(yīng)該及時(shí)進(jìn)行超聲檢查。一般常染色體異常的多伴超聲異常,如果性染色體則超聲難以發(fā)現(xiàn)。此外由于羊水培養(yǎng)的細(xì)胞有限,不能診斷所有的真性鑲嵌體,因此為了防止漏診,應(yīng)該對所有的哪怕是只有一個(gè)克隆異常的Ⅱ級鑲嵌體保持警惕,因?yàn)檫@隨時(shí)可能是來源于真性鑲嵌體。對于這些假性鑲嵌體研究則有待更進(jìn)一步的追蹤與隨訪。但是不得不警惕就是因?yàn)榕囵B(yǎng)困難導(dǎo)致培養(yǎng)時(shí)間過長,細(xì)胞克隆數(shù)過少中由于母體滋養(yǎng)細(xì)胞的克隆化生長。本研究使用原位培養(yǎng)方法,目的是為了更好地解決羊水染色體中最讓人困惑的鑲嵌體問題。選擇不同的培養(yǎng)容器,為的是增加細(xì)胞克隆培養(yǎng),可以增加核型分析數(shù)量。當(dāng)前,在產(chǎn)前診斷中尤其是羊水培養(yǎng)中發(fā)現(xiàn)鑲嵌體的對策是重復(fù)抽取羊水,或者抽取胎兒臍帶血進(jìn)行染色體分析。國外曾有建議重復(fù)抽羊水進(jìn)行間期原位熒光雜交技術(shù),