單元三抗生素類藥物的發(fā)酵生產(chǎn)項(xiàng)目一抗生素基本知識(shí)任務(wù)二抗生素的分類（一）根據(jù)抗生素生物來源分類放線菌產(chǎn)生的抗生素真菌產(chǎn)生的抗生素細(xì)菌產(chǎn)生的抗生素其它生物（植物、動(dòng)物、海洋生物等）產(chǎn)生的抗生素1.放線菌產(chǎn)生的抗生素放線菌中以鏈霉菌屬產(chǎn)生的抗生素最多，諾卡菌屬較少。放線菌產(chǎn)生的抗生素主要有氨基糖苷類（鏈霉素、新霉素、卡那霉素等）、四環(huán)類（四環(huán)素、金霉素、土霉素等）、放線菌素類(放線菌素D等)、大環(huán)內(nèi)酯類（紅霉素、螺旋霉素、柱晶白霉素等）和多烯大環(huán)內(nèi)酯類等。2.真菌產(chǎn)生的抗生素真菌的四個(gè)綱中，藻菌綱及子囊菌綱產(chǎn)生的抗生素較少，擔(dān)子菌綱稍多，而不完全綱的曲霉菌屬、青霉菌屬、鐮刀菌屬和頭孢菌屬則產(chǎn)生一些較重要的抗生素。曲菌屬產(chǎn)生的有桔霉素等。青霉菌屬產(chǎn)生的有青霉素和灰黃霉素等。頭孢菌屬產(chǎn)生的有頭孢菌素等。3.細(xì)菌產(chǎn)生的抗生素細(xì)菌產(chǎn)生的抗生素主要來源是多粘桿菌、枯草桿菌（芽孢桿菌）、短芽孢桿菌等。如多粘菌素、桿菌肽、短桿菌素等，具有復(fù)雜的化學(xué)結(jié)構(gòu)，是環(huán)狀或鏈狀多肽類物質(zhì)，由肽鏈將多種不同氨基酸結(jié)合而成，含有自由氨基，其化學(xué)性質(zhì)一般為堿性。4.其它生物產(chǎn)生的抗生素

（植物、動(dòng)物、海洋生物等）植物產(chǎn)生的抗生素，如地衣酸、綠藻酸、蒜素、番茄素，常山堿、黃連素、白果酸及白果醇等。裸子植物如銀杏、紅杉等也能產(chǎn)生抗生物質(zhì)。植物產(chǎn)生的抗生素主要是雜環(huán)及脂環(huán)類物質(zhì)。動(dòng)物產(chǎn)生的抗生素，如魚素。（二）按醫(yī)療作用對(duì)象分類1、抗感染抗生素抗革蘭陽(yáng)性菌的抗生素：青霉素、紅霉素、新生霉素、桿菌肽?？垢锾m陰性菌的抗生素：鏈霉素、多黏菌素等。廣譜抗生素：四環(huán)素類、氯霉素類、第三代頭孢菌素等?？拐婢目股兀褐泼咕?、灰黃霉素、兩性霉素?？菇Y(jié)核分支桿菌的抗生素：鏈霉素、新霉素、環(huán)絲氨酸等?？共《?、噬菌體及原蟲的抗生素：魚素、蒜素、巴龍霉素等?？股氐目咕V（1）選擇性（2）最小的抑菌濃度（MIC：minimalinhibitoryconcentration）能夠抑制微生物生長(zhǎng)的最低抗生素濃度。如：強(qiáng)力霉素、四環(huán)素、土霉素對(duì)金色葡萄球菌有一定抑制作用，其MIC依次為8.75U/ml、60U/ml、100U/ml。（3）抗菌譜某種抗生素所能抑制或殺滅病原體的范圍。（二）按醫(yī)療作用對(duì)象分類2.抗腫瘤的抗生素：絲裂霉素、更新霉素、平陽(yáng)霉素。3.降血脂抗生素

如新霉素、洛伐他汀等。（三）按作用性質(zhì)分類1.繁殖期殺菌的抗生素

如青霉素。頭孢菌素等。2.靜止期殺菌的抗生素

如鏈霉素、多黏菌素等。3.速效抑菌的抗生素

如四環(huán)素、紅霉素等。4.慢效抑菌的抗生素

如環(huán)絲氨酸等。（四）按應(yīng)用范圍分類1.醫(yī)用抗生素

如青霉素及其衍生物、頭孢菌素及其衍生物、紅霉素及其衍生物等。2.農(nóng)用抗生素

如春雷霉素、慶豐霉素、放線菌酮等。3.畜用抗生素

如四環(huán)素、土霉素等。4.食品保藏用抗生素。5.工農(nóng)業(yè)產(chǎn)品防霉防腐用抗生素。6.實(shí)驗(yàn)試劑用抗生素。（五）按作用機(jī)制分類抑制細(xì)菌細(xì)胞壁干擾蛋白質(zhì)合成作用機(jī)制

干擾核酸的復(fù)制作用細(xì)菌細(xì)胞膜大環(huán)內(nèi)酯類抗生素、四環(huán)類抗生素、氨基糖苷類抗生素多黏菌素類、制霉菌素、兩性霉素B利福霉素、博來霉素β-內(nèi)酰胺類、

桿菌肽、環(huán)絲氨酸等抑制細(xì)胞壁的功能：如青霉素、頭孢霉素等影響細(xì)胞膜的功能：如兩性霉素等（六）按抗生素獲得途徑分類1.天然抗生素（發(fā)酵工程抗生素）

四環(huán)類抗生素、大環(huán)內(nèi)酯類抗生素等。2.半合成抗生素

如氨芐西林，頭孢菌素等。3.生物轉(zhuǎn)化與酶工程抗生素。4.基因工程抗生素。（七）根據(jù)抗生素的生物合成途徑分類1.氨基酸、肽類衍生物2.糖類衍生物3.以乙酸、丙酸為單位的衍生物（八）按化學(xué)結(jié)構(gòu)分類 β-內(nèi)酰胺抗生素大環(huán)內(nèi)酯類抗生素四環(huán)素類抗生素氨基糖苷類抗生素多肽類抗生素1.-內(nèi)酰胺抗生素基本結(jié)構(gòu)：分子中含有由四個(gè)原子組成β-內(nèi)酰胺環(huán)★是該類抗生素發(fā)揮生物活性的必需基團(tuán)★和細(xì)菌作用時(shí)，內(nèi)酰胺環(huán)開環(huán)與細(xì)菌發(fā)生?；饔靡种萍?xì)菌的生長(zhǎng)?！镆颚?內(nèi)酰胺由四個(gè)原子組成，分子張力較大，化學(xué)性質(zhì)不穩(wěn)定易發(fā)生開環(huán)導(dǎo)致失活。分類根據(jù)β-內(nèi)酰胺環(huán)是否連接其它雜環(huán)及所連接雜環(huán)的化學(xué)結(jié)構(gòu)，β-內(nèi)酰胺抗生素又可被分為：

①青霉素類(Penicillins)②頭孢菌素類

③非典型的β-內(nèi)酰胺抗生素類碳青霉烯青霉烯氧青霉烷單環(huán)的β-內(nèi)酰胺經(jīng)典結(jié)構(gòu)藥物青霉素類(Penicillins)頭孢菌素(Cephalosporins)青霉素（青霉素鉀、鈉）氨芐西林

（氨芐青霉素）阿莫西林

（羥氨芐青霉素）非典型結(jié)構(gòu)藥物碳青霉烯青霉烯單環(huán)的β-內(nèi)酰胺氧青霉烷這類抗生素的化學(xué)結(jié)構(gòu)通常由1，3-二氨基肌醇（鏈霉胺、2-脫氧鏈霉胺，放線菌胺）為苷元與某些特定的氨基糖通過糖苷鍵相連而成。2.氨基糖苷類抗生素鏈霉素結(jié)構(gòu)特點(diǎn)：N-甲基葡萄糖+鏈霉糖+鏈霉胍含1個(gè)仲胺、2個(gè)胍基、1個(gè)醛基結(jié)構(gòu)3.大環(huán)內(nèi)酯類抗生素結(jié)構(gòu)特點(diǎn)：含有一個(gè)大環(huán)內(nèi)酯（十四元或十六元大環(huán)）配糖體，以苷鍵和1～3個(gè)分子的糖相連。作用機(jī)制：主要是抑制細(xì)菌蛋白質(zhì)的合成。結(jié)構(gòu)特點(diǎn)為14-16元環(huán)的大環(huán)內(nèi)酯結(jié)構(gòu)，酯環(huán)上的-OH與一些糖類以苷鍵相連。紅霉素紅霉素A是由紅霉內(nèi)酯與去氧氨基糖和紅霉糖縮合而成的堿性甙。阿奇霉素4.四環(huán)素類抗生素這類抗生素是以并四苯為母核，也稱為稠環(huán)類抗生素。

包括金霉素、土霉素和四環(huán)素等。作用機(jī)制：在核糖體水平抑制蛋白質(zhì)合成。四環(huán)素

6-甲基-4-(二甲氨基)-3,6,10,12,12a-五羥基-1,11-二氧代-1,4,4a,5,5a,6,11,12a-八氫-2-并四苯甲酰胺5.多肽類抗生素這類抗生素多由細(xì)菌，特別是產(chǎn)生芽孢的桿菌產(chǎn)生。它們含有多種氨基酸，經(jīng)肽鍵縮合成線狀、環(huán)狀或帶側(cè)鏈的環(huán)狀多肽類化合物。較重要的有多粘菌素、放線菌素和桿菌肽等。單元三抗生素類藥物的發(fā)酵生產(chǎn)項(xiàng)目一抗生素基本知識(shí)任務(wù)三抗生素的應(yīng)用（一）抗生素在醫(yī)療上的應(yīng)用1.控制細(xì)菌感染性疾病2.抑制腫瘤生長(zhǎng)3.調(diào)節(jié)人體生理功能4.器官移植5.控制病毒性感染（二）在農(nóng)業(yè)上的應(yīng)用1.用于植物保護(hù)用鏈霉素防治柑橘潰瘍??；鏈霉素與代森鋅（一種化學(xué)農(nóng)藥）合用防治白菜軟腐病、霜霉病和孤丁??；鏈霉素和硫酸銅混合使用防治黃瓜霜霉病2.促進(jìn)或抑制植物生長(zhǎng)可用作植物生長(zhǎng)激素，如赤霉素等；有些有選擇性除草作用，如茴香霉素、東洋卡霉素等。（三）在畜牧業(yè)上的應(yīng)用1.用于禽畜感染性疾病控制絕大部分醫(yī)用抗生素也能有效地用于治療禽畜的感染性疾病。2.用作飼料添加劑可刺激禽畜生長(zhǎng)（如四環(huán)素與大環(huán)內(nèi)酯類等抗生素），沙利霉素還用作抗雞球蟲病的飼料添加劑。（四）在食品保藏中的應(yīng)用用于肉、魚、蔬菜、水果等食品的保鮮；用作罐裝食品的防腐劑。（五）在工業(yè)上的應(yīng)用1.工業(yè)制品的防霉2.提高特定發(fā)酵產(chǎn)品的產(chǎn)量向谷氨酸發(fā)酵液中，加入適量青霉素，可提高細(xì)菌細(xì)胞膜的滲透性，有利于胞內(nèi)谷氨酸的滲出，提高谷氨酸發(fā)酵的產(chǎn)酸水平。（六）在科學(xué)研究中的應(yīng)用1.用作生物化學(xué)與分子生物學(xué)研究的重要工具2.用于建立藥物篩選與評(píng)價(jià)模型3.其他試驗(yàn)應(yīng)用

用于防止細(xì)胞培養(yǎng)、組織培養(yǎng)的污染；用于動(dòng)物精液、組織液等的保存等。單元三抗生素類藥物的發(fā)酵生產(chǎn)項(xiàng)目一抗生素基本知識(shí)任務(wù)四抗生素效價(jià)測(cè)定方法（一）抗生素的效價(jià)某種抗生素實(shí)際上是幾種相似成分的混合物抗生素不穩(wěn)定，產(chǎn)品中混雜著分解產(chǎn)物、異構(gòu)物抗生素生產(chǎn)過程產(chǎn)生的雜質(zhì)必須對(duì)抗生素的有效成分加以檢定。常用的抗生素效價(jià)單位有重量單位、類似重量單位、重量折算單位、特定單位。1.質(zhì)量單位

以抗生素的生物活性部分的質(zhì)量作為單位，1微克為1個(gè)單位（1μg=1U，1mg=1000U）

如硫酸鏈霉素、硫酸卡那霉素、硫酸慶大霉素等均以重量單位表示。雖然不同酸根的同一抗生素稱重不同，只要單位一樣則表示其有效部分的質(zhì)量是一樣的。（二）抗生素的效價(jià)單位表示方法２、類似質(zhì)量單位以純粹抗生素鹽類的質(zhì)量（包括無生物活性的鹽酸根在內(nèi)）作為效價(jià)單位。1μg定為1U，1mg即為1000U。

四環(huán)素、新生霉素酸等以此為效價(jià)單位。３、質(zhì)量折算單位以特定的純抗生素鹽的某一質(zhì)量作為效價(jià)單位。如青霉素國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)品（1952年）青霉素G鈉稱重0.5988μg為1單位，即1mg=1670單位。４、特定單位以特定的抗生素樣品的某一質(zhì)量定為一單位。桿菌肽國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)品，第一批桿菌肽國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)品為55U/mg；第二批桿菌肽國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)品為74U/mg；制霉素，第一批標(biāo)準(zhǔn)品1mg=3000U。（三）抗生素效價(jià)測(cè)定1.微生物檢定法：以抗生素對(duì)微生物的殺傷或抑制程度為指標(biāo)來衡量抗生素效價(jià)的一種方法。優(yōu)點(diǎn)靈敏度高、需用量小，測(cè)定結(jié)果直觀；測(cè)定原理與臨床應(yīng)用要求一致，更能確定抗生素的醫(yī)療價(jià)值；適用范圍廣；對(duì)同一類型的抗生素不需分離，可一次測(cè)定其總效價(jià)缺點(diǎn)操作步驟多，測(cè)定時(shí)間長(zhǎng)，誤差大等缺點(diǎn)。（三）抗生素效價(jià)測(cè)定2.理化方法：根據(jù)抗生素的分子結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，利用其特有的化學(xué)或物理化學(xué)性質(zhì)及反應(yīng)而進(jìn)行的。優(yōu)點(diǎn)對(duì)于提純的產(chǎn)品以及化學(xué)結(jié)構(gòu)已確定的抗生素、能較迅速、準(zhǔn)確地測(cè)定其效價(jià)，并具有較高的專屬性缺點(diǎn)

一定要運(yùn)用其化學(xué)結(jié)構(gòu)上官能團(tuán)的特殊化學(xué)反應(yīng)，對(duì)含有具相同官能團(tuán)的雜質(zhì)的供試品就不適用。單元三抗生素類藥物的發(fā)酵生產(chǎn)項(xiàng)目一抗生素基本知識(shí)任務(wù)五抗生素微生物檢定法（一）標(biāo)準(zhǔn)品抗生素標(biāo)準(zhǔn)品是與供試品同質(zhì)的純度較高的抗生素，用作效價(jià)測(cè)定時(shí)的標(biāo)準(zhǔn)，每1mg含有一定的單位。分為國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)品與國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品。經(jīng)國(guó)際協(xié)議，每1mg標(biāo)準(zhǔn)品中含有一定的單位，其單位稱為國(guó)際單位（IU）。在某些品種第一次定國(guó)際單位時(shí)，一般其效價(jià)單位的含義是由主觀決定的，如定為1mg=1000U。國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)品制備量有限，主要供各國(guó)在檢定國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品時(shí)作對(duì)照用，不宜用于常規(guī)檢驗(yàn)和具體科研工作中。我國(guó)的標(biāo)準(zhǔn)品由國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局下設(shè)單位中國(guó)藥品生物制品檢定所統(tǒng)一負(fù)責(zé)選樣、分裝、協(xié)作標(biāo)定、確定效價(jià)單位等，并統(tǒng)一向全國(guó)各使用單位分發(fā)。國(guó)際上已制備的國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)品的品種，在制備國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品時(shí)，均與國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)品比較而定出效價(jià)，對(duì)于我國(guó)特有的品種則根據(jù)一定的原則自定效價(jià)單位。（二）檢定用菌種檢定抗生素效價(jià)時(shí)要選擇合適的抗生素敏感菌作為試驗(yàn)菌。不同的抗生素其敏感菌不一樣?！吨袊?guó)藥典》2010年版規(guī)定檢定抗生素效價(jià)的菌種有8種?？莶菅挎邨U菌

短小芽孢桿菌金葡菌藤黃微球菌大腸埃希菌啤酒酵母菌肺炎克雷伯菌支氣管炎博德特菌（三）抗生素微生物檢定法

抗生素微生物檢定法是利用抗生素抑制或殺死細(xì)菌或真菌的程度作為客觀指標(biāo)來衡量抗生素有效成分的效力的一種方法。依據(jù)試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理的不同，抗生素微生物檢定法一般分為管碟法、濁度法和稀釋法?！吨袊?guó)藥典》2010年版采用管碟法和濁度法。1.管碟法又稱杯碟法，是利用抗生素在瓊脂培養(yǎng)基內(nèi)的擴(kuò)散作用，比較標(biāo)準(zhǔn)品與供試品兩者對(duì)接種的試驗(yàn)菌產(chǎn)生抑菌圈的大小，以測(cè)定供試品效價(jià)的一種方法。我國(guó)藥典抗生素微生物檢定的第一法。固體培養(yǎng)基凝固前接種試驗(yàn)菌，培養(yǎng)基凝固后，將供試品用不同的設(shè)計(jì)方法加在接種有試驗(yàn)菌的培養(yǎng)基上，適宜的溫度下培養(yǎng)一段時(shí)間后，由于抗生素向培養(yǎng)基中擴(kuò)散，凡抑菌濃度所能到達(dá)之處，細(xì)菌不能生長(zhǎng)而呈現(xiàn)出透明的抑菌范圍，一般呈圓形，稱為抑菌圈。將供試品的抑菌圈與標(biāo)準(zhǔn)品抑菌圈進(jìn)行比較，計(jì)算出供試品的效價(jià)。2.濁度法利用抗生素在液體培養(yǎng)基中對(duì)試驗(yàn)菌生長(zhǎng)的抑制作用，通過測(cè)定培養(yǎng)后細(xì)菌濁度值的大小，比較標(biāo)準(zhǔn)品與供試品對(duì)試驗(yàn)菌生長(zhǎng)抑制的程度，以測(cè)定供試品效價(jià)的一種方法。采用分光光度計(jì)來測(cè)定吸光度，渾濁程度越高，光吸收越好，通過的光線也就越少。3.稀釋法

依據(jù)抗生素最低抑菌濃度而設(shè)計(jì)的方法稱為稀釋法。通過監(jiān)測(cè)等量的試驗(yàn)菌菌液在不同濃度的抗生素液體培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)情況，觀察含不同濃度抗生素的液體培養(yǎng)基中有無細(xì)菌生長(zhǎng)，從而測(cè)定抗生素最低抑菌濃度（MIC）的方法。常用于新藥的研制及藥敏試驗(yàn)等方面。（四）管碟法1.原理－抑菌圈的形成將不銹鋼小管（俗稱牛津杯）放置在攤布試驗(yàn)菌的瓊脂培養(yǎng)基雙碟上，在小管內(nèi)加入抗生素溶液后，將培養(yǎng)基置于試驗(yàn)菌生長(zhǎng)的適宜條件下，兩種互動(dòng)作用：一種是抗生素溶液向培養(yǎng)基內(nèi)呈球面狀擴(kuò)散作用；另一種是試驗(yàn)菌的生長(zhǎng)作用。當(dāng)培養(yǎng)到一定時(shí)間，瓊脂培養(yǎng)基中的兩種互動(dòng)作用達(dá)到動(dòng)態(tài)平衡時(shí)，瓊脂培養(yǎng)基中便形成透明的抑菌圈。即：在抑菌圈中因抗生素濃度高于抑菌濃度，試驗(yàn)菌生長(zhǎng)受到抑制，此處瓊脂培養(yǎng)基成透明狀；在抑菌圈邊緣抗生素濃度恰好等于抗生素最低抑菌濃度。根據(jù)設(shè)計(jì)原理不同，管碟法分一劑量法（標(biāo)準(zhǔn)曲線法）、二劑量法（2.2法）和三劑量法（3.3法）三種常用方法。其中二劑量法使用最多。2.量-反應(yīng)直線式中，t為擴(kuò)散時(shí)間（h）；M為管中抗生素的量（μg或U）；r為抑菌圈的半徑（mm）；H為培養(yǎng)基的厚度（mm）；C′為抗生素最低抑菌濃度（μg/mm3或U/mm3）；D為擴(kuò)散系數(shù)（mm2/h）。2.量-反應(yīng)直線抗生素總量的對(duì)數(shù)(lgM)與所形成的抑菌圈半徑的平方(r2)呈直線關(guān)系，奠定了以抑菌圈的大小來測(cè)定抗生素抗菌活性物質(zhì)量的理論基礎(chǔ)。3.量-反應(yīng)平行線

在量–反應(yīng)的指標(biāo)中，當(dāng)抗生素濃度的對(duì)數(shù)劑量和反應(yīng)呈直線關(guān)系，且供試品與標(biāo)準(zhǔn)品的作用性質(zhì)相同時(shí)，供試品與標(biāo)準(zhǔn)品的兩條量–反應(yīng)關(guān)系曲線相互平行。在抗生素效價(jià)測(cè)定時(shí)，為消除各種干擾因素的影響，采用標(biāo)準(zhǔn)品和供試品在相同的試驗(yàn)條件下進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，測(cè)得相對(duì)效價(jià)的比率，再由已知的標(biāo)準(zhǔn)品效價(jià)計(jì)算出供試品的效價(jià)。4.檢定的影響因素抑菌圈質(zhì)量的控制抑菌圈的形狀

抑菌圈大小的控制抑菌圈邊緣清晰度的控制標(biāo)準(zhǔn)品與供試品的同質(zhì)性斜率的控制直線截距的控制（1）抑菌圈質(zhì)量的控制a.抑菌圈的形狀：實(shí)驗(yàn)中抑菌圈常多有破裂、不圓、甚至無圈的現(xiàn)象，原因：在滴加抗生素溶液時(shí)藥液濺出、毛細(xì)滴管碰到鋼管壁使抗生素溶液漏出，抑菌圈出現(xiàn)不圓；雙碟、鋼管、鋼管放置器內(nèi)有殘留抗生素污染，出現(xiàn)細(xì)菌不生長(zhǎng)，或者有多余的抑菌圈產(chǎn)生，或者抑菌圈非正常的變大；試驗(yàn)菌菌齡過老、菌層培養(yǎng)基加菌液時(shí)培養(yǎng)基溫度過高，將檢定菌燙死等，會(huì)導(dǎo)致細(xì)菌不生長(zhǎng)；稀釋抗生素溶液所用緩沖液的pH值和鹽濃度也可影響抑菌圈的圓整。（1）抑菌圈質(zhì)量的控制b.抑菌圈大小的控制

M=C0V

當(dāng)抗生素最低抑菌濃度C′不變時(shí)，lgM與r2呈直線關(guān)系。故鋼管中滴加抗生素的量應(yīng)保持一致，且應(yīng)嚴(yán)格限定鋼管的大小。抑菌圈質(zhì)量的控制b.抑菌圈大小的控制抑菌圈大小受t值（抗生素?cái)U(kuò)散時(shí)間，即細(xì)菌剛生長(zhǎng)到顯示抑菌圈所需的時(shí)間）增減的影響，故預(yù)先延長(zhǎng)抗生素的擴(kuò)散時(shí)間可使抑菌圈變大。一組雙碟加樣時(shí)，應(yīng)盡量縮短加樣間隔時(shí)間，并保持加樣速度的均勻性，以減少誤差。抑菌圈的大小還受抗生素?cái)U(kuò)散系數(shù)D的影響，若在緩沖液中加入3%的氯化鈉或在培養(yǎng)基中加一定量的鹽或吐溫，可增加抗生素的擴(kuò)散能力，使抑菌圈增大。b.抑菌圈大小的控制（1）抑菌圈質(zhì)量的控制c.抑菌圈邊緣清晰度的控制在抑菌圈形成過程中抗生素的擴(kuò)散系數(shù)紊亂、不均一，不符合動(dòng)力學(xué)公式中各項(xiàng)之間的關(guān)系或各擴(kuò)散系統(tǒng)交叉所致。如試驗(yàn)菌種放置時(shí)間過長(zhǎng)，菌群中個(gè)體的生長(zhǎng)周期不同，對(duì)抗生素的敏感度不同，往往使抑菌圈形成雙圈或多圈，使邊緣模糊不清。培養(yǎng)基原材料的成分及質(zhì)量、pH值、鹽濃度及培養(yǎng)時(shí)間均可影響抑菌圈邊緣的清晰度。多組分抗生素中，各組分抗菌活性的不同，擴(kuò)散系數(shù)也不同，其交叉作用影響抑菌圈邊緣的清晰度。

（2）標(biāo)準(zhǔn)品與供試品的同質(zhì)性用于制備標(biāo)準(zhǔn)品溶液和供試品溶液的緩沖溶液pH、鹽濃度的差異，導(dǎo)致供試品溶液與標(biāo)準(zhǔn)品溶液表現(xiàn)為非同質(zhì)。供試品（尤其是制劑）較標(biāo)準(zhǔn)品中含有額外的維生素、氨基酸、無機(jī)鹽及糖類等生長(zhǎng)物質(zhì)?？稍跇?biāo)準(zhǔn)品中加入相同量的添加劑或賦形劑，以抵消此影響。對(duì)化學(xué)穩(wěn)定性較差的抗生素，易降解。對(duì)光敏感的多烯類抗生素（如制霉菌素、兩性霉素B等），試驗(yàn)過程中應(yīng)注意避免光線直射；對(duì)有差向異構(gòu)特性的抗生素，尤其應(yīng)注意pH、鹽濃度、溫度和光照對(duì)抗生素差向化的影響。（3）斜率的控制

由公式中斜率來推算：斜率越小，直線越平緩，抗生素效價(jià)的微弱差別，可導(dǎo)致抑菌圈大小的差別較大，使得測(cè)定結(jié)果更精確。要使斜率小，則應(yīng)使D值、t值變大，即抗生素在培養(yǎng)基中的擴(kuò)散系數(shù)D要大，試驗(yàn)菌的生長(zhǎng)時(shí)間t要長(zhǎng)。D值又與抗生素的分子量、培養(yǎng)基成分、試驗(yàn)菌以及pH、鹽濃度、瓊脂含量多少等因素有關(guān)。增大t值的辦法，可在滴加抗生素溶液后，將雙碟置室溫中放置1～2h，然后再置培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。（4）截距的影響相同濃度的抗生素，截距小的抑菌圈大，效價(jià)測(cè)定的靈敏度高。截距的大小取決于數(shù)值，除擴(kuò)散時(shí)間、擴(kuò)散系數(shù)和抗生素最低抑菌濃度對(duì)截距有影響外，培養(yǎng)基厚度H也是影響因素之一。培養(yǎng)基厚度越薄，截距減小，抑菌圈增大。所以在制備雙碟時(shí)，相同的試驗(yàn)組內(nèi)，每只雙碟中底層和菌層培養(yǎng)基的厚度應(yīng)保持一致性和均勻性。二劑量法是將標(biāo)準(zhǔn)品（S）和供試品（T）各稀釋成高、低兩種劑量，在同一含試驗(yàn)菌的瓊脂平板上進(jìn)行比較，根據(jù)2種劑量4種溶液所產(chǎn)生的抑菌圈的大小，計(jì)算出供試品的效價(jià)。（五）二劑量法試驗(yàn)準(zhǔn)備：雙碟、鋼管、毛細(xì)滴管、吸管的清洗及滅菌；容量瓶、定量吸管的清洗；培養(yǎng)基、緩沖液的準(zhǔn)備、半無菌間的紫外消毒等。1.操作方法雙碟的挑選內(nèi)徑約90mm，硬質(zhì)玻璃或塑料培養(yǎng)平皿，水平透明，無色斑氣泡內(nèi)徑（6.0±0.1）mm，高（10.0±0.1）mm，外徑（7.8±0.1）mm，重量差異不超過±0.01g，光潔平坦鋼管的挑選主要是吸潮和防止細(xì)菌蔓延的作用，厚薄一致，表面光滑、平坦，吸水性強(qiáng)。不需要洗滌，140℃干烤1h消毒、降溫后拿出。陶瓦蓋（1）菌懸液的制備按照抗生素檢定實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)表選擇相應(yīng)的試驗(yàn)菌，培養(yǎng)制備菌懸液?？股仡悇e試驗(yàn)菌培養(yǎng)基滅菌緩沖液PH值抗生素濃度范圍（單位/ml）培養(yǎng)條件編號(hào)PH值溫度/℃時(shí)間/小時(shí)鏈霉素枯草芽孢桿菌[CMCCB（B）63501Ⅰ7.8～8.07.80.6～1.635～3714～16卡那霉素枯草芽孢桿菌[CMCCB（B）63501Ⅰ7.8～8.07.80.9～4.535～3714～16巴龍霉素枯草芽孢桿菌[CMCC（B）63501]Ⅰ7.8～8.07.80.9～4.535～3714～16妥布霉素枯草芽孢桿菌[CMCCB（B）63501Ⅰ7.8～8.07.81～435～3714～16羅紅霉素枯草芽孢桿菌[CMCCB（B）63501Ⅱ7.8～8.07.85～1035～3716～18慶大霉素短小芽孢桿菌[CMCC（B）63202]Ⅰ7.8～8.07.82.0～12.035～3714～16（2）供試品、標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備：標(biāo)準(zhǔn)品的使用與保存，應(yīng)遵循標(biāo)準(zhǔn)品使用說明書的規(guī)定。從冰箱中取出標(biāo)準(zhǔn)品，于室溫平衡后，以減量法精密稱取不少于20mg、一般為50mg的標(biāo)準(zhǔn)品，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)示效價(jià)單位加入稀釋液，制成濃度一般為1000U/ml的濃溶液，貯存于冰箱中備用。臨用時(shí)依據(jù)抗生素微生物檢定實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)表的規(guī)定，取標(biāo)準(zhǔn)品1000U/ml的濃溶液，用緩沖液稀釋成滴碟所用高、低兩濃度，作為標(biāo)準(zhǔn)品溶液。標(biāo)準(zhǔn)品和供試品高、低濃度的劑量比一般為2:1，當(dāng)高、低劑量所致的抑菌圈直徑差別較小時(shí)，可用高、低劑量之比為4:1的比率（3）雙碟的制備底層：每只雙碟加底層培養(yǎng)基約20ml，待培養(yǎng)基凝固，更換干燥的陶瓦蓋。菌層的制備在培養(yǎng)基中添加一定量的菌懸液，振搖混勻。注意菌層培養(yǎng)基溫度；根據(jù)預(yù)試驗(yàn)確定加入菌層培養(yǎng)基的菌液量。每只雙碟加入5ml菌層培養(yǎng)基。注意制備菌層的速度和平整度。（4）放置鋼管在每只雙碟中以等距離均勻安置不銹鋼小管4個(gè)（二劑量法），用陶瓦圓蓋覆蓋備用。注意使鋼管平穩(wěn)落在培養(yǎng)基上，各個(gè)鋼管下落的高度應(yīng)一致。鋼管放妥后，使雙碟靜置10min，鋼管在培養(yǎng)基內(nèi)稍下沉穩(wěn)定。（5）滴碟、培養(yǎng)每批供試品雙碟不少于4個(gè)，一般取4～10個(gè)在每個(gè)雙碟的4個(gè)鋼管中，對(duì)角的兩個(gè)鋼管分別滴加高濃度和低濃度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，其余兩個(gè)對(duì)角位置的鋼管分別滴加相應(yīng)的高、低濃度的供試品溶液。按SH→TH→SL→TL順序，分別滴加標(biāo)準(zhǔn)品和供試品高、低劑量溶液。雙碟的培養(yǎng)根據(jù)培養(yǎng)溫度的要求在培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)箱中水平疊放的雙碟數(shù)以不超過三層為宜。培養(yǎng)后的雙碟（6）抑菌圈的測(cè)量將培養(yǎng)好的雙碟取出，打開陶瓦蓋，將鋼管倒入1：1000新潔爾滅溶液或其他消毒液內(nèi)浸泡，檢查抑菌圈是否圓整，如有破圈或不圓整圈應(yīng)將碟棄去。抑菌圈測(cè)量?jī)x的使用：每組試驗(yàn)雙碟應(yīng)在相同的測(cè)量參數(shù)下進(jìn)行測(cè)量。手工測(cè)量：游標(biāo)卡尺測(cè)量抗生素微生物效價(jià)檢定操作流程圖2.二劑量法的效價(jià)計(jì)算P為供試品效價(jià)相當(dāng)于標(biāo)示值或估計(jì)效價(jià)的百分?jǐn)?shù)；S2為標(biāo)準(zhǔn)品高濃度溶液所致抑菌圈直徑（面積）的總和；S1為標(biāo)準(zhǔn)品低濃度溶液所致抑菌圈直徑（面積）的總和；T2為供試品高濃度溶液所致抑菌圈直徑（面積）的總和；T1為供試品低濃度溶液所致抑菌圈直徑（面積）的總和；I為高、低劑量之比的對(duì)數(shù)（常數(shù)），高、低劑量之比為2:1時(shí)，I=0.301；高、低劑量之比為