傳統(tǒng)泡菜中乳酸菌的篩選鑒定及抗氧化特性分析

趙鑫，胡蝶，張素平，祁勇剛,3，吳勇超，高冰,3，柳志杰,3*(1.湖北工業(yè)大學生物工程與食品學院湖北省食品發(fā)酵工程技術研究中心，武漢430068；2.湖北聚匯農業(yè)開發(fā)有限公司，湖北荊門431821；3.湖北省發(fā)酵蔬菜企校聯(lián)合創(chuàng)新中心，湖北荊門431821)泡菜歷史悠久，從古至今在中國人的食譜中扮演了重要的角色。其由大白菜等生鮮蔬菜與中，低濃度鹽水浸泡腌制，經乳酸菌為主的益生菌發(fā)酵，形成獨特風味的腌漬食品[1-2]。因其酸咸適中、清香脆嫩、色澤誘人且富含有機酸、維生素、氨基酸等成分，獲得了世界各地人們的喜愛[3-4]。隨著食品工業(yè)的發(fā)展，對泡菜的研究愈發(fā)廣泛，如篩選應用發(fā)酵劑[5-6]、優(yōu)化發(fā)酵工藝[7-8]、分析香味成分等[9]。近幾年來，篩選出耐酸且兼具有益屬性的乳酸菌作為天然發(fā)酵劑已成為研究熱點。研究表明，一些乳酸菌具有清除活性氧，緩解氧化損失的作用[10]。羅強等[11]從20份自然發(fā)酵泡菜中篩選得到植物乳桿菌NR-11和LR-13、棒狀乳桿菌LR-43對人工模擬胃液有較強的耐受性，具有腸胃益生菌的潛力。梁小波等將分離篩選獲得的高抗氧化活性發(fā)酵乳桿菌ZN011接種發(fā)酵泡菜，縮短了2d左右的發(fā)酵周期，改善了風味。本實驗從傳統(tǒng)發(fā)酵泡菜中分離純化得到2株疑似乳酸菌，對其進行分子生物學鑒定，分析產酸、耐酸及抗氧化活性等生物學特性，以期為具有耐酸、較高抗氧化能力的乳酸菌制劑及在發(fā)酵食品中的應用提供理論參考。1材料與方法1.1材料1.1.1原料泡菜：采用傳統(tǒng)方法制作發(fā)酵而成，取自湖北聚匯農業(yè)開發(fā)有限公司泡菜車間，用無菌袋收集，于4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?.1.2培養(yǎng)基MRS液體培養(yǎng)基蛋白胨10.0g/L，牛肉膏8.0g/L，酵母粉4.0g/L，磷酸氫二鉀2.0g/L，檸檬酸氫二銨2.0g/L，乙酸鈉5.0g/L，葡萄糖20.0g/L，吐溫801.0g/L，硫酸鎂0.2g/L，硫酸錳0.04g/L。MRS固體培養(yǎng)基蛋白胨10.0g/L，牛肉膏8.0g/L，酵母粉4.0g/L，磷酸氫二鉀2.0g/L，檸檬酸氫二銨2.0g/L，乙酸鈉5.0g/L，葡萄糖20.0g/L，吐溫801.0g/L，硫酸鎂0.2g/L，硫酸錳0.04g/L，瓊脂粉15.0g/L。MRS鑒定培養(yǎng)基蛋白胨10.0g/L，牛肉膏8.0g/L，酵母粉4.0g/L，磷酸氫二鉀2.0g/L，檸檬酸氫二銨2.0g/L，乙酸鈉5.0g/L，葡萄糖20.0g/L，吐溫801.0g/L，硫酸鎂0.2g/L，硫酸錳0.04g/L，瓊脂粉15.0g/L，碳酸鈣0.02g/L。1.1.3主要試劑2×TaqMasterMix試劑(試劑中含有染料)：購于天根生化科技(北京)有限公司；細菌16SrDNA通用引物27F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)、1492R(5′-ACGGTTACCTTGTTACGACTT-3′)：均由蘇州金唯智生物科技有限公司合成；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)、硫酸亞鐵(FeSO4)、水楊酸(C7H6O3)、過氧化氫(H2O2)、二乙三胺五乙酸(C14H23N3O10)、三羥甲基氨基甲烷(Tris-HCl)、聯(lián)苯三酚(C6H6O3)、磷酸緩沖液(PBS)、鐵氰化鉀(K3[Fe(CN)6])、三氯乙酸(Cl3CCOOH)、三氯化鐵(FeCl3)：均為分析純，購于國藥集團化學試劑有限公司。1.1.4儀器與設備AR323CN電子天平奧豪斯儀器有限公司；ME54E微量天平、DELTA320pH計梅特勒-托利多有限公司；DK-S22恒溫水浴鍋上海精宏實驗設備有限公司；5424R臺式高速冷凍離心機Eppendorf公司；CR21N落地式高速冷凍離心機日本Hitachl公司；MS-H-ProT磁力攪拌器(大龍)；HCB-1300V垂直層流超凈工作臺(海爾)；MLS-3781L高壓蒸汽滅菌鍋日本Panasonic公司；ZXSR-1270恒溫培養(yǎng)箱上海智城分析儀器制造有限公司；DYY7C電泳儀北京市六一儀器廠；TC-96/G/H(b)CPCR儀杭州博日科技有限公司；95-0444-01凝膠成像儀上海苑勝儀器設備有限公司；UV-1601UV-Vis分光光度計北京瑞利分析儀器有限公司。1.2實驗方法1.2.1乳酸菌的分離純化取泡菜發(fā)酵液樣品1mL，無菌生理鹽水10倍梯度稀釋，取各梯度100μL均勻涂布于MRS鑒定培養(yǎng)基上，貼封口膜置于37℃的恒溫箱中培養(yǎng)48h。觀察菌落形態(tài)并挑選產生溶鈣圈的菌種，在MRS固體平板上純化直至出現(xiàn)單菌落[12-13]。對篩選的單一菌進行生理生化實驗[14]，保存?zhèn)溆谩?.2.2乳酸菌的16SrDNA鑒定PCR擴增體系(50μL)：25μL2×PCR預混液，1μL菌液作為模板，2.5μL引物27F，2.5μL引物1492R，19μLddH2O。PCR擴增條件：94℃預變性1min，94℃變性10s，55℃退火30s，72℃延伸1min，共30次循環(huán)，72℃終延伸5min，4℃保溫備用。PCR擴增產物送至蘇州金唯智生物科技有限公司測序。將測序結果提交至NCBI(/)進行Blast同源性比對，選取同源性較高的模式菌株16SrDNA序列，采用MEGA6.0軟件中的鄰接法(neighborjoining，NJ)構建系統(tǒng)發(fā)育樹。1.2.3乳酸菌產酸能力測定取分離純化的200μL菌液接種至10mLMRS液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)24h，4000r/min離心10min，棄上清液，無菌水重懸調整菌液濃度為1×108CFU/mL(OD595nm=1.0)。37℃培養(yǎng)0，4，8，16，20，24h，測定發(fā)酵液的乳酸量[15]。1.2.4乳酸菌耐酸能力測定用鹽酸調節(jié)液體培養(yǎng)基至不同的pH(2.0，2.5，3.0，3.5，4.0，4.5，5.0，5.5，6.0)。吸取1mL菌液接種至上述不同pH的培養(yǎng)基中，37℃恒溫培養(yǎng)24h，測定OD600nm。1.2.5乳酸菌抗氧化性測定制備乳酸菌細胞懸浮液和無細胞提取物細胞懸浮液制備：取活化3代后的菌液，5000r/min離心10min，棄上清液，用無菌水洗滌3次，重懸調整菌液濃度為1×108CFU/mL(OD595nm=1.0)。無細胞提取物制備：對細胞懸浮液進行離心破碎處理，電鏡檢查無完整細胞，離心收集上清液。DPPH清除能力測定參考Lin等[16]的方法并略作改進：取樣品各2mL，加入1mL0.2mmol/LDPPH-無水乙醇溶液，充分混合并避光反應30min，9000r/min離心10min，取上清液在OD517nm處測吸光度。按式(1)計算DPPH自由基清除能力。DPPH清除能力(%)=[1-(A1-A10)/A0]×100%。式(1)式中：A1為樣品和DPPH-無水乙醇的吸光度；A10為無水乙醇代替DPPH-無水乙醇的吸光度；A0為同體積純水代替樣品的吸光度。羥基自由基清除能力測定參考He等[17]的方法并略作改進：取樣品2mL加入5mmol/L硫酸亞鐵溶液、5mmol/L水楊酸-乙醇溶液、3mmol/LH2O2各1mL，37℃水浴20min，測定OD510nm。按式(2)計算羥基自由基的清除能力。羥基自由基清除能力(%)=[1-(A1-A10)/A0]×100%。式(2)式中：A1為樣品組的吸光度；A10為同體積純水代替H2O2溶液的吸光度；A0為同體積純水代替樣品的吸光度。超氧陰離子清除能力測定參考張江巍等[18]的方法：取樣品0.5mL加入150mmol/LTris-HCl溶液(pH8.2)、1.2mmol/L鄰苯三酚溶液、3mmol/L二乙三胺五乙酸溶液各1mL。25℃水浴10min，測定OD325nm。按式(3)計算超氧陰離子的清除能力。超氧陰離子清除能力(%)=[1-(A11-A10)/(A01-A00)]×100%。式(3)式中：A11為含樣品和鄰苯三酚的吸光度；A10為含樣品，不含鄰苯三酚的吸光度；A01為不含樣品，含鄰苯三酚的吸光度；A00為不含樣品和鄰苯三酚的吸光度。還原能力測定參考劉洋等[19]的方法：取樣品0.5mL加入0.2mol/LPBS溶液(pH6.6)、1%鐵氰化鉀溶液各0.5mL混勻，50℃水浴20min，迅速冷卻后加入10%三氯乙酸0.5mL，4000r/min離心5min，取上清液、蒸餾水、0.1%三氯乙酸各1mL混勻，靜置反應10min，測定OD700nm。按式(4)計算還原能力。還原能力(%)=(A1-A0)/A0×100%。式(4)式中：A1為樣品組的吸光度；A0為PBS緩沖液代替樣品的吸光度。1.3數(shù)據(jù)分析使用NCBI數(shù)據(jù)庫對比菌株的相似性，MEGA7.0繪制系統(tǒng)發(fā)育樹，Origin2019進行數(shù)據(jù)分析及作圖。2結果與分析2.1乳酸菌的生理生化實驗從泡菜發(fā)酵液中共分離出2株乳酸菌，將其命名為Z2、Z5。生理生化實驗見表1，2株菌均為G+，過氧化氫酶、明膠液化、產硫化氫、吲哚實驗均為陰性。表1乳酸菌的生理生化實驗2.2乳酸菌的16SrDNA鑒定采用試劑盒提取2株菌的DNA，PCR擴增后電泳，結果見圖1。圖1乳酸菌PCR產物電泳圖Fig.1PCRproductelectrophoretogramoflacticacidbacteria由圖1可知，對菌株DNA采取16SrDNAPCR擴增后，均得到條帶大小在1000～2000bp左右的產物，表明PCR擴增產物無雜質可進行測序，符合預期長度。將測序得到的結果提交到NCBI進行Blast同源性比對搜索，結果見表2。Z2與Limosilactobacillusfermentum的相似度為99.05%，Z5與Lactiplantibacilluspingfangensis的相似度為99.16%。表2乳酸菌16SrDNA序列鑒定結果Table2Theidentificationresultsof16SrDNAsequenceoflacticacidbacteria采用MEGA6.0軟件分析，鄰接法構建系統(tǒng)發(fā)育樹，Bootstrap自展1000次檢驗進化樹拓撲結構置信區(qū)間，結果見圖2。菌株Z2與發(fā)酵乳桿菌聚為一支，菌株Z5與植物乳桿菌聚為一支，親緣關系較近。圖2基于16SrDNA序列的乳酸菌系統(tǒng)進化樹Fig.2Phylogenetictreeoflacticacidbacteriabasedon16SrDNAsequence2.3乳酸菌的產酸能力產酸力是乳酸菌的重要特性之一。對獲得的2株乳酸菌在37℃培養(yǎng)24h進行產酸能力測定，結果見圖3。由圖3可知，發(fā)酵24h時，相對于發(fā)酵乳桿菌Z2，植物乳桿菌Z5的菌液pH明顯較低，酸度高，產酸能力明顯較強。在0～20h內，2株菌的產酸量都在逐漸增加，20～24h內，產酸量逐漸趨于平緩或下降。其中，菌株Z5的產酸速度最快，產酸量最高，達到1.393g/L。這與趙山山等[20]從貴州泡菜中分離出的植物乳桿菌產酸量結果相近。2.4乳酸菌的耐酸能力對2株乳酸菌的耐酸能力進行測定，結果見圖4。圖4乳酸菌的耐酸性Fig.4Theacidtoleranceabilityoflacticacidbacteria由圖4可知，隨著培養(yǎng)基酸度的增強，2株乳酸菌的生長都受到抑制。在pH值<5.0時，菌體濃度下降幅度大，在pH值為4.0時，2株菌的生長差異最為明顯，Z5的耐酸能力最強。2.5乳酸菌的抗氧化性圖5菌株對DPPH自由基的清除能力(a)、羥基自由基的清除能力(b)、超氧陰離子的清除能力(c)、還原能力的測定(d)2.5.1清除DPPH自由基能力的測定由圖5中a可知，菌株的完整細胞懸浮液對DPPH自由基的清除率平均在(50.615±0.329)%，最高的為Z2，清除率達到(59.294±0.294)%。菌株的無細胞提取物的清除率平均在(33.180±0.580)%，最高的為Z2，清除率達到(41.990±0.364)%。乳酸菌的細胞懸浮液和無細胞提取物的清除能力也有所差異，細胞懸浮液的清除能力均高于無細胞提取物。Z2對DPPH自由基的清除能力最高，即抗氧化性最高。2.5.2清除羥基自由基能力的測定由圖5中b可知，兩株乳酸菌的無細胞提取物和細胞懸浮液都表現(xiàn)出一定的羥基自由基清除能力，但清除能力有所差異。Z2的細胞懸浮液清除效果最強，清除率達到(52.244±0.311)%。Z5的無細胞提取物清除能力較強于Z2，清除率達到(37.944±0.794)%。2.5.3超氧陰離子清除能力的測定由圖5中c可知，細胞懸浮液對超氧陰離子的平均清除率為(10.912±0.589)%，其中Z2的清除率最高，達到(11.370±0.492)%。無細胞提取物的平均清除率為(6.901