地奧血瘀康膠囊的研制

地奧李家康是中國科學(xué)院成都生物研究所開發(fā)的一種預(yù)防和治療心血管疾病的天然藥物。其活性成分是黃山藥根的提取物，后來通過龍甘薯粉添加藥物。地奧心血康具有活血化瘀、行氣止痛、擴張冠脈血管和改善心肌缺血等功效,可用于預(yù)防和治療冠心病、心絞痛以及瘀血內(nèi)阻之胸痹、眩暈、氣短、心悸、胸悶等病癥。地奧心血康的活性物質(zhì)基礎(chǔ)為甾體皂苷本次實驗主要是通過地奧心血康的腸內(nèi)菌離體代謝,用薄層色譜的分析方法并結(jié)合甾體類化合物的特定顯色反應(yīng)來快速簡便的鑒定其代謝產(chǎn)物,目的是尋找和發(fā)現(xiàn)新的有活性的代謝產(chǎn)物。在發(fā)現(xiàn)該代謝產(chǎn)物有活性后,可以為新藥開發(fā)提供線索,以新的活性成分為前體進行結(jié)構(gòu)修飾篩選出高效藥物,為尋找創(chuàng)新藥物增加新的機會和途徑。1實驗材料和設(shè)備1.1膠囊、國藥地奧心血康膠囊(成分:甾體總皂苷;性狀:本品為硬膠囊,內(nèi)容物為淺棕黃色的粉末,味微苦;國藥準(zhǔn)字Z10910051;產(chǎn)品批號0608027,代號451),成都地奧制藥集團有限公司研制。1.2動物大鼠:雄性,體重162~198g,由藥理教研室提供。1.3試劑和儀器甲醇(分析純),天津市富宇精細化工有限公司;三氯甲烷(分析純),天津市廣成化學(xué)試劑有限公司;乙酸乙酯(分析純)天津市富宇精細化工有限公司;石油醚(60~90℃)(分析純),汕頭市西隴化工廠;正丁醇(分析純),廣東光華化學(xué)廠有限公司;乙醇(分析純),天津市富宇精細化工有限公司;鹽酸(化學(xué)純),汕頭市光華化學(xué)廠;硫酸(分析純),新光化工試劑廠;HG/T235492H薄層層析硅膠(化學(xué)純):青島海洋化工有限公司;無水碳酸鈉(化學(xué)純),汕頭市西隴化工廠;磷酸氫二鉀(分析純),天津市福晨化學(xué)試劑廠;磷酸二氫鉀(分析純),汕頭市光華化學(xué)廠;氯化鈉(分析純),天津市福晨化學(xué)試劑廠;硫酸銨(化學(xué)純),汕頭市光華化學(xué)廠;無水氯化鈣(分析純),天津市福晨化學(xué)試劑廠;硫酸鎂(分析純),天津市福晨化學(xué)試劑廠;對二甲氨基苯甲醛(分析純),廣州化學(xué)試劑廠;磷鉬酸(分析純),國藥集團化學(xué)試劑有限公司;L-抗壞血酸(分析純),天津市天新精細化工開發(fā)中心;牛肉浸膏(生化試劑),北京雙旋微生物培養(yǎng)基制品廠;蛋白胨(生化試劑),北京雙旋微生物培養(yǎng)基制品廠;營養(yǎng)瓊脂(生化試劑),廣東環(huán)凱微生物科技有限公司;鹽酸-L-半胱氨酸(生化試劑),上海潤捷化學(xué)試劑有限公司;厭氧產(chǎn)氣劑注:(1)厭氧產(chǎn)氣劑與氧氣接觸就能生成CO1.4酶設(shè)計DT系列電子天平(規(guī)格Max=3000g,d=0.1g;量制蘇字00000176號),中國江蘇常熟長青儀器儀表廠;FA1004型電子天平(規(guī)格Max=100g,d=0.1mg;滬制00000191號),上海良平儀器儀表有限公司;馬頭牌JYT-2架盤藥物天平(規(guī)格Max=200g,d=0.2g;滬制00000271號),上海光正醫(yī)療儀器有限公司;LD4-2A低速離心機(規(guī)格Max=5000r/min;京藥管城(準(zhǔn))字2001第2410227號),北京醫(yī)用離心機廠;GZX-9240MBE電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱,上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠;HSGⅡB-4電熱恒溫水浴鍋,上海儀表(集團)供銷公司;AG0252.5L厭氧培養(yǎng)罐(帶12皿支架),廣州雷得生物技術(shù)有限公司。2實驗方法2.1氨基苯甲醛的制備1%對二甲氨基苯甲醛鹽酸試劑的制備:稱取0.5g對二甲氨基苯甲醛,加入37.5mL甲醇溶解,再緩慢加入12.5mL鹽酸,搖勻即可。5%磷鉬酸乙醇試劑的制備:稱取2.5g磷鉬酸加入50mL乙醇溶解,搖勻即可。2.2cmc-na溶液稱取5gCMC-Na(羧甲基纖維素鈉)加入1000mL蒸餾水加熱溶解,冷卻后得5‰CMC-Na溶液。取適量硅膠H加入適量用棉花過濾得到的5‰CMC-Na溶液,研磨成沒有氣泡并具一定稠度的糊狀物,然后用手動鋪板器鋪成0.5mm厚的硅膠H薄層板,晾干,放入烘箱中在105~110℃溫度下烘0.5~1h,取出即可。2.3稀鹽酸溶液的配制稱取3.9gK稱取2.35gKH稱取8gNa稱取2.5gL-抗壞血酸溶于10mL蒸餾水中得到25%L-抗壞血酸溶液。量取1mL濃鹽酸加入20mL蒸餾水得到稀鹽酸。量取37.5mL溶液A、37.5mL溶液B、50mL溶液C、2mL25%L-抗壞血酸溶液、0.5g鹽酸-L-半胱氨酸、1g牛肉浸膏、1g蛋白胨、1g營養(yǎng)瓊脂,加蒸餾水至1L,最后用稀鹽酸調(diào)pH值至7.5~8.0就得到厭氧培養(yǎng)液。2.4正丁醇的制備取正丁醇適量(約20mL)加入蒸餾水稍過量(約15mL)混合,振搖,靜置,取上層液體即得。2.5地奧空心康膠囊制備取健康大鼠新鮮糞便,稱量得33.3g,按照1g∶5mL的比例將糞便與166.5mL厭氧培養(yǎng)液混合,攪拌制成懸濁液,用醫(yī)用紗布過濾得到126.0mL腸菌培養(yǎng)液,加入0.1522g地奧心血康膠囊內(nèi)容物使其溶解,然后將含藥物的腸菌培養(yǎng)液平均分成兩份,每份63.0mL。其中一份置于2.5L厭氧培養(yǎng)罐中,同時放入?yún)捬踔甘緞?用厭氧產(chǎn)氣劑耗去罐內(nèi)的氧氣(該厭氧產(chǎn)氣劑與氧氣接觸就生成二氧化碳和水)使罐內(nèi)形成厭氧環(huán)境用于腸道厭氧菌培養(yǎng),并把該厭氧培養(yǎng)罐置于37℃電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱中培養(yǎng)24h,培養(yǎng)混合物用21mL水飽和正丁醇萃取三次,合并萃取液,以速度為1500r/min離心20min,取上清液并蒸干,用甲醇溶解蒸干后的剩余物,并定容至5mL,為代謝24h的樣品溶液。另外一份馬上用21mL水飽和正丁醇萃取三次,合并萃取液,以速度為1500r/min離心20min,取上清液并蒸干,用甲醇溶解蒸干后的剩余物,并定容至5mL,為代謝0h的樣品溶液。在地奧心血康用大鼠腸內(nèi)菌代謝24h完成后,再取大鼠新鮮糞便,稱量得17.0g,按照1g∶5mL的比例將糞便與85.0mL厭氧培養(yǎng)液混合,攪拌制成懸濁液,用醫(yī)用紗布過濾后取63.0mL腸菌培養(yǎng)液,加入0.0763g地奧心血康膠囊內(nèi)容物使其溶解,置于2.5L厭氧培養(yǎng)罐中,同時放入?yún)捬踔甘緞?用厭氧產(chǎn)氣劑耗去罐內(nèi)的氧氣使罐內(nèi)形成厭氧環(huán)境用于腸道厭氧菌培養(yǎng),并把該厭氧培養(yǎng)罐置于37℃電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱中培養(yǎng)48h,培養(yǎng)混合物用21mL水飽和正丁醇萃取三次,合并萃取液,以速度為1500r/min離心20min,取上清液并蒸干,用甲醇溶解蒸干后的剩余物,并定容至5mL,為代謝48h的樣品溶液。另外稱取0.0761g地奧心血康膠囊內(nèi)容物直接加入63mL水飽和正丁醇并攪拌使藥物盡可能溶解,以速度為1500r/min離心20min,取上清液并蒸干,用甲醇溶解蒸干后的剩余物,并定容至5mL,作為沒有糞便和厭氧培養(yǎng)液的樣品溶液。再取大鼠新鮮糞便,稱量得17.9g,按照1g∶5mL的比例將糞便與89.5mL厭氧培養(yǎng)液混合,攪拌制成懸濁液,用醫(yī)用紗布過濾后取63.0mL腸菌培養(yǎng)液,該腸菌培養(yǎng)液不加藥物直接用21mL水飽和正丁醇萃取三次,合并萃取液,以速度為1500r/min離心20min,取上清液并蒸干,用甲醇溶解蒸干后的剩余物,并定容至5mL,作為沒有藥物的空白溶液。2.6代謝前后成分轉(zhuǎn)化及代謝產(chǎn)物的檢測5%磷鉬酸乙醇試劑與具有還原性的化合物、類脂體、生物堿、甾體都能發(fā)生作用產(chǎn)生反應(yīng)并顯藍色至深藍色分別用5μL定量毛細管對2.5中得出的定容至5mL的溶液取樣,并在0.5mm厚的硅膠H薄層板上點樣,再用不同展開系統(tǒng)作展開劑(先預(yù)飽和30min),以1%對二甲氨基苯甲醛鹽酸試劑或5%磷鉬酸乙醇試劑作為顯色劑,對藥物代謝前后的成分轉(zhuǎn)化及代謝產(chǎn)物作出檢測。2.7地奧血康膠囊內(nèi)容的識別2.7.1泡沫試驗取地奧心血康膠囊內(nèi)容物少許加適量蒸餾水溶解,置具塞試管中,強烈振搖1min,產(chǎn)生大量的持久性泡沫。2.7.2氯仿-高硫酸反應(yīng)取地奧心血康膠囊內(nèi)容物少許加適量氯仿溶解,滴加幾滴濃硫酸后,在氯仿層呈現(xiàn)紫紅色,在濃硫酸呈現(xiàn)淡綠色。3結(jié)果與討論3.1顯色劑的轉(zhuǎn)化藥物代謝前的薄層色譜見圖1,其中,A展開劑為氯仿∶甲醇∶水=65∶20∶2;顯色劑為5%磷鉬酸乙醇;B展開劑為氯仿∶甲醇∶水=65∶20∶2;顯色劑為1%對二甲氨基苯甲醛鹽酸試劑;C展開劑為氯仿∶甲醇∶水=75∶35∶4;顯色劑為1%對二甲氨基苯甲醛鹽酸試劑;D展開劑為乙酸乙酯∶石油醚=4∶6;顯色劑為5%磷鉬酸乙醇。從圖1中可以看出,藥物經(jīng)腸內(nèi)菌代謝24h后,許多成分(主要為皂苷類)都已經(jīng)明顯發(fā)生轉(zhuǎn)化(A);藥物經(jīng)腸內(nèi)菌代謝24h后,藥物中的對1%對二甲氨基苯甲醛鹽酸試劑顯色的甾體皂苷成分都已經(jīng)明顯發(fā)生轉(zhuǎn)化(B、C);藥物中的某種非極性成分在經(jīng)腸內(nèi)菌代謝24h并沒有發(fā)生多大變化,但在代謝48h后卻發(fā)生了明顯的轉(zhuǎn)化(D)。這些根據(jù)都說明了地奧心血康膠囊內(nèi)容物的腸內(nèi)菌代謝已經(jīng)代謝成功。3.2醛鹽酸試劑試劑藥物代謝后(代謝產(chǎn)物)的薄層色譜見圖2,其中,A展開劑為乙酸乙酯∶石油醚=4∶6;顯色劑為1%對二甲氨基苯甲醛鹽酸試劑;B展開劑為乙酸乙酯∶石油醚=2∶8;顯色劑為1%對二甲氨基苯甲醛鹽酸試劑。從圖2中可以看出,藥物經(jīng)腸內(nèi)菌代謝24h、48h以后,在Rf=0.691的地方都出現(xiàn)了比較明顯的紫紅色斑點,在Rf=0.016的地方也出現(xiàn)較模糊的紫紅色斑