中藥益氣化纖湯抗大鼠肺纖維化的實驗研究中藥益氣化纖湯抗大鼠肺纖維化的試驗討論

：蔡望喜，尹杉杉，常建方

【

中藥益氣化纖湯抗大鼠肺纖維化的試驗討論

餾水沖洗4次，吹干，-20℃保存。

肺間質(zhì)巨噬細胞分別培育：無菌新生牛血清(FCS)于56℃水浴30min滅活補體，加入Ⅰ型膠原酶、DNA酶配成含體積分數(shù)10%FCS的RPMI1640消化液，其中Ⅰ型膠原酶濃度為200U/mL，DNA酶濃度為0.02mg/L，抽濾滅菌，4℃保存。第28天處死大鼠，常規(guī)消毒，在超凈工作臺內(nèi)，取右肺于無菌培育皿中。用DHanks液洗凈，剪碎肺組織，玻璃勻漿器研磨，離心(4℃、2500r/min×15min)，棄上清，加入消化液消化(37℃、體積分數(shù)5%CO2)2～3h后取出，離心(4℃、2500r/min×10min)，DHanks液反復(fù)吹打后過100目篩網(wǎng)(使

之成為單細胞)，離心(4℃、2500r/min×15min)，棄上清。在試管中加入適量Ficoll分別液，將沉淀與DHanks液充分混勻，將混懸液緩慢滴加于分別液面上，水平離心(4℃、2500r/min×20min)。離心后管內(nèi)分為3層，上層為血漿和DHanks液，下層主要為紅細胞和粒細胞，中層為淋巴細胞分別液，在上、中層界面處有一以單個核細胞為主的白色云霧層狹窄帶，主要為淋巴細胞和單核細胞(包括巨噬細胞)，用毛細管吸取單個核細胞，置入另一試管中，加入5倍以上體積的DHanks液，離心(4℃、2500r/min×10min)，洗滌細胞2次，將滅菌蓋玻片置于6孔板內(nèi)，滴加分別的細胞，加入適量RPMI1640培育液，37℃、體積分數(shù)5%CO2培育2～3h，在倒置顯微鏡下觀看細胞貼壁后取出，生理鹽水沖洗2次，在玻片上用DEPC處理的多聚甲醛固定30min，蒸餾水沖洗4次，吹干，-20℃保存。分子原位雜交(ISH)按試劑盒說明書進行。

1.5觀看指標

1.5.1陽性細胞百分率光鏡下觀看，胞質(zhì)中消失棕黃色顆粒為陽性，每一玻片隨機取5個視野，計算陽性巨噬細胞數(shù)，再依據(jù)5個視野中總巨噬細胞數(shù)算出該片平均陽性細胞比例。

1.5.2積分光密度(D)樣本玻片置于高清楚度彩色病理圖文報告分析系統(tǒng)(HMIAS2000)配套的Olympus顯微鏡下，CCD系統(tǒng)攝取細胞圖像(40×10)，作尺寸及光密度定標。每例標本隨機選取100個分散、無重疊的目標細胞，采納不同彩色分刻法獲得圖形，由系統(tǒng)計算出該切片TGFβ1mRNA陽性面積的D值。

1.6統(tǒng)計學方法計量資料用F檢驗，計數(shù)資料采納Wilcoxon秩和檢驗，組間比較采納多因素方差分析。

2結(jié)果

大鼠模型組AM、IM中TGFβ1mRNA表達陽性細胞百分率及D值與假手術(shù)組比較顯著上升(均P0.01)，提示博萊霉素能造成大鼠TGFβ1mRNA表達增高;氫化可的松組AM、IM中TGFβ1mRNA表達陽性細胞百分率及D值與模型組比較差異均有顯著性意義(P0.05或P0.01);益氣化纖湯組與模型組比較，AM、IM中TGFβ1mRNA表達陽性細胞百分率及D值顯著下降(均P0.01)，提示益氣化纖湯組與氫化可的松組有同樣的生物學特性，能干預(yù)博萊霉素造成的TGFβ1mRNA表達增高。結(jié)果見表1、表2，圖1、圖2(彩圖見第316頁)。表1各組AM、IM中TGFβ1mRNA表達陽性①P0.01，與假手術(shù)組比較;②P0.05，③P0.01,與模型組比較3爭論對于肺纖維化的發(fā)病機理，近年來細胞因子網(wǎng)絡(luò)學說備受重視，各種致病因素引起肺泡上皮和(或)毛細血管內(nèi)皮細胞損傷,外周血中免疫細胞聚集到肺部，肺常駐細胞(主要是巨噬細胞)細胞因子的基因表達均增加,分泌大量細胞因子，活化后與靶細胞特異受體結(jié)合，致使成纖維細胞、成肌纖維細胞在病灶部位增殖，肺泡上皮細胞非正常增生，最終導致肺泡與肺間質(zhì)纖維化。

肺泡巨噬細胞在肺纖維化時，不僅其數(shù)量和活性增加，細胞表面抗原的表達也增加。作為在纖維化早期階段上升的主要細胞類型之一，它在最初損傷及伴隨組織損傷后的炎癥反應(yīng)中起關(guān)鍵性的作用。它能合成和釋放大量具有多種生物活性的細胞因子(如TGFβ1)，在肺纖維化發(fā)生、進展過程中發(fā)揮重要作用，并產(chǎn)生和自分泌大量介質(zhì)，對其他炎癥和非炎癥細胞起化學趨化劑和生長因子作用。

肺間質(zhì)巨噬細胞位于肺間質(zhì)內(nèi)，其產(chǎn)生的生物活性物質(zhì)可直接作用于其他間質(zhì)細胞及細胞外基質(zhì)而影響肺間質(zhì)的代謝。有討論表明，IM的活化及其產(chǎn)生的生物學特性，對肺纖維化的形成更有意

中藥益氣化纖湯抗大鼠肺纖維化的試驗討論

義。

TGFβ1作為最重要的促纖維化細胞因子，是迄今發(fā)覺的最強的細胞外基質(zhì)沉積促進劑，能作用于多個環(huán)節(jié)，刺激各種細胞外基質(zhì)成分的合成和沉積，產(chǎn)生細胞外基質(zhì)(ECM)蛋白如膠原、糖蛋白、纖維結(jié)合蛋白(FN);是一種強大的細胞增殖調(diào)整劑,對成纖維細胞有增殖效應(yīng)，能夠誘導特征性成纖維細胞向肌成纖維細胞表型轉(zhuǎn)換，而肌成纖維細胞是膠原產(chǎn)生的主要位點;可抑制蛋白水解酶的產(chǎn)生，使細胞外基質(zhì)沉積進一步增加。

肺內(nèi)很多細胞能分泌TGFβ1，如肺泡巨噬細胞、上皮細胞、內(nèi)皮細胞、成纖維細胞等，其中巨噬細胞被認為是分泌TGFβ1的主要細胞。因此，討論肺纖維化AM，特殊是IM中TGFβ1的變化，對揭示肺纖維化的發(fā)病機理具有特殊重要的意義。本試驗結(jié)果顯示，博萊霉素誘導的肺纖維化大鼠，其肺泡炎癥期AM、肺纖維化期IM中TGFβ1mRNA表達與假手術(shù)組比較均顯著性增高(P0.01)，提示這些變化可能是肺纖維化演化進展的重要緣由。

中醫(yī)學認為，"肺虛絡(luò)痹"是肺纖維化的基本病機。若肺氣虧虛，絡(luò)中血氣運行無力，而血氣瘀滯于肺絡(luò)之中則形成肺虛絡(luò)阻之證。治當益肺補氣，活血通絡(luò)。葉天士在《臨證指南醫(yī)案》指出："大凡絡(luò)虛，通補最宜"，其所謂補是補益絡(luò)中之血氣，通是化其痰瘀以疏通絡(luò)道。

益氣化纖湯由黃芪、虎杖、水蛭等組成。方中黃芪為君，味甘，性微溫，功能補氣升陽，托毒生肌;虎杖味苦性平，有祛風、利濕、破瘀、通絡(luò)等功效;水蛭味咸性寒入血，且破瘀通絡(luò)而不傷正氣，二藥為臣，共佐黃芪奏益氣活血、化瘀通絡(luò)之效。以上諸藥并用,可從整體上對肺纖維化形成的諸多環(huán)節(jié)進行綜合性干預(yù)，減弱或阻斷肺內(nèi)持續(xù)進展的炎性細胞聚集，削減多種細胞因子尤其是致纖維化關(guān)鍵性細胞因子TGFβ1合成與分泌，調(diào)整致纖維化細胞因子與抗纖維化細胞因子之間的平衡，減弱或阻斷肺損傷后的特別修復(fù)過程，延緩或阻斷肺纖維化的發(fā)生與進展

。本討論結(jié)果表明益氣化纖湯可削減AM，特殊是IM中TGFβ1的表達，減弱細胞因子網(wǎng)絡(luò)對于肺纖維化形成的促進作用,抑制纖維化的進展進程。

【

中藥益氣化纖湯抗大鼠肺纖維化的試驗討論

呂長俊.肺巨噬細胞亞群：肺泡巨噬細胞和間質(zhì)巨噬細胞.國外醫(yī)學:呼吸系統(tǒng)分冊,1995,15(4):193.

BartramU，SpeerCP.Theroleoftransforminggrowthfactorbetainlungdevelopmentanddisease.Chest,2024，125(3):754.

KhalilN，BerezayO,SpornM,etal.Macrophageproductionoftransform