第十一章微生物的分類和鑒定第一節(jié)

微生物在生物界的地位第二節(jié)

微生物的分類和命名第三節(jié)

微生物分類鑒定的方法第四節(jié)

微生物的分類系統(tǒng)第五節(jié)

微生物的快速鑒定和自動化分析技術(shù)第十一章微生物的分類和鑒定第一節(jié)微生物在生物界的地位1生物界的分類地球上的物種估計大約有150萬，其中微生物超過10萬種，而且其數(shù)目還在不斷增加。在生物進化歷史過程中演化形成生物種類和種群的多樣性。生物分類就是通過研究生物的系統(tǒng)發(fā)育及其進化歷史，揭示各類生物的多樣性及其系統(tǒng)關(guān)系，編制分類系統(tǒng)，還原生物的自然歷史位置。高等動植分類化石資料、形態(tài)學、比較胚胎學較正確反映其系統(tǒng)發(fā)育生物界的分類地球上的物種估計大約有150萬，其中微生物超過12微生物分類的難題：絕大部分微生物個體小、形態(tài)簡單、易受環(huán)境影響而變異、缺少有性繁殖、缺乏化石資料。生物分類的二種基本原則：a）根據(jù)表型(phenetic)特征的相似程度分群歸類，這種表型分類重在應用，不涉及生物進化或不以反映生物親緣關(guān)系為目標；b）按照生物系統(tǒng)發(fā)育相關(guān)性水平來分群歸類，其目標是探尋各種生物之間的進化關(guān)系，建立反映生物系統(tǒng)發(fā)育的分類系統(tǒng)。微生物分類的難題：絕大部分微生物個體小、形態(tài)簡單、易受環(huán)境影3★從兩界系統(tǒng)經(jīng)歷過三界系統(tǒng)、四界系統(tǒng)、五界系統(tǒng)甚至六界系統(tǒng)，最后又有了三原界（或三總界）系統(tǒng)。（圖10－2）★傳統(tǒng)的、為多數(shù)學者所接受的是1969年魏塔克（R.H.Whittaker）在《Science》上提出的五界學說。一、生物的界級分類學說第一節(jié)微生物在生物界的地位★從兩界系統(tǒng)經(jīng)歷過三界系統(tǒng)、四界系統(tǒng)、五界系統(tǒng)甚至六界系統(tǒng)，4利用16SrRNA建立分子進化樹的美國科學家CarlWoese

二、三域?qū)W說的建立和發(fā)展利用16SrRNA建立分子進化樹的美國科學家CarlWo5（1）古生菌域（Archaea)：包括產(chǎn)甲烷細菌、極端嗜鹽菌和嗜熱嗜酸菌等（2）細菌域（Bacteria)：包括藍細菌和各種除古細菌以外的其它原核生物（3）真核生物域（Eukarya）：包括原生生物、真菌、動物和植物（1）古生菌域（Archaea)：包括產(chǎn)甲烷細菌、極端嗜鹽6經(jīng)典分類學：按微生物表型分類微生物系統(tǒng)學：按親緣關(guān)系和進化規(guī)律分類發(fā)展表型特征：形態(tài)學、生理生化學、生態(tài)學等，推斷微生物的系統(tǒng)發(fā)育。表型特征結(jié)合分子水平上比較微生物的基因型特征（如16SrRNA)探討微生物進化、系統(tǒng)發(fā)育和分類鑒定。★微生物分類學的三個任務：分類、鑒定及命名☆分類是根據(jù)微生物的相似性和親緣關(guān)系，將微生物歸入不同的分類類群?！铊b定是確定一個新的分離物屬于已經(jīng)確認的分類單元的過程。☆命名是根據(jù)國際命名法規(guī)給微生物分類單元以科學的名稱。第二節(jié)微生物的分類和命名經(jīng)典分類學：按微生物表型分類微生物系統(tǒng)學：按親緣關(guān)系和進化規(guī)7以啤酒酵母為例，它在分類學上的地位是：界(Kindom)：真菌界門(Phyllum)：真菌門綱(Class)：子囊菌綱目(Order)：內(nèi)孢霉目科(Family)：內(nèi)孢霉科屬(Genus)：酵母屬種(Species)：啤酒酵母微生物的分類單位界、門、綱、目、科、屬、種種是最基本的分類單位每一分類單位之后可有亞門、亞綱、亞目、亞科...以啤酒酵母為例，它在分類學上的地位是：微生物的分類單位界、門8種（species）：是一個基本分類單位；是一大群表型特征高度相似、親緣關(guān)系極其接近，與同屬內(nèi)其他種有明顯差別的菌株的總稱。菌株（strain）:表示任何由一個獨立分離的單細胞繁殖而成的純種群體及其一切后代（起源于共同祖先并保持祖先特性的一組純種后代菌群）。因此，一種微生物的不同來源的純培養(yǎng)物均可稱為該菌種的一個菌株。菌株強調(diào)的是遺傳型純的譜系。例如：大腸埃希氏桿菌的兩個菌株：EscherichiacoliB和EscherichiacoliK12★菌株的表示法：★種是分類學上的基本單位，菌株是實際上應用的基本單位，因為同一菌種的不同菌株在產(chǎn)酶上種類或代謝物產(chǎn)量上會有很大的不同和差別！種（species）：是一個基本分類單位；是一大群表型特征高9亞種(subspecies）或變種(variety)：為種內(nèi)的再分類。當某一個種內(nèi)的不同菌株存在少數(shù)明顯而穩(wěn)定的變異特征或遺傳形狀，而又不足以區(qū)分成新種時，可以將這些菌株細分成兩個或更多的小的分類單元——亞種。變種是亞種的同義詞，因“變種”一詞易引起詞義上的混淆，從1976年后，不再使用變種一詞。通常把實驗室中所獲得的變異型菌株，稱之為亞種。如：E.colik12（野生型）是不需要特殊氨基酸的，而實驗室變異后，可從k12獲得某氨基酸的缺陷型，此即稱為E.colik12的亞種。型(form):

常指亞種以下的細分。當同種或同亞種內(nèi)不同菌株之間的性狀差異不足以分為新的亞種時，可以細分為不同的型。

例如：按抗原特征的差異分為不同的血清型；亞種(subspecies）或變種(variety)：型(f10學名—是微生物的科學名稱，它是按照有關(guān)微生物分類國際委員會擬定的法則命名的。學名由拉丁詞、或拉丁化的外來詞組成。學名的命名有雙名法和三名法兩種。①雙名法：學名=屬名+種名+（首次定名人）+現(xiàn)定名人+定名年份屬名：拉丁文的名詞或用作名詞的形容詞，單數(shù)，首字母大寫，表示微生物的主要特征，由微生物構(gòu)造，形狀或由科學家命名。種名：拉丁文形容詞，字首小寫，為微生物次要特征，

如微生物色素、形狀、來源或科學家姓名等。微生物的命名必要，用斜體表示可省略，用正體字微生物的名字有俗名和學名兩種。如：紅色面包霉———粗糙脈孢霉綠膿桿菌———銅綠假單胞菌學名—是微生物的科學名稱，它是按照有關(guān)微生物分類國際委員會擬11例：大腸埃希氏桿菌

Escherichiacoli（Migula）CastellanietChalmers1919

金黃色葡萄球菌

StaphylococcusaureusRosenbach1884◆當泛指某一屬微生物，而不特指該屬中某一種（或未定種名）時，可在屬名后加sp.或ssp.（分別代表species縮寫的單數(shù)和復數(shù)形式）例如：Saccharomycessp.表示酵母菌屬中的一個種。例：大腸埃希氏桿菌◆當泛指某一屬微生物，而不特指該屬中某一種12◆菌株名稱——在種名后面自行加上數(shù)字、地名或符號等如：BacillussubtilisAS1.389AS=AcademiaSinica

BacillussubtilisBF7658BF=北紡

ClostridiumacetobutylicumATCC824丙酮丁醇梭菌ATCC＝AmericanTypeCultureCollection美國模式菌種保藏中心◆當文章中前面已出現(xiàn)過某學名時，后面的可將其屬名縮寫成1～3個字母。如：Escherichiacoli可縮寫成E.coliStaphylococcusaureus可縮寫成S.aureus②三名法：用于對亞種的命名，這時在屬和種名后加寫一個subsp.或var，然后再附上亞種名稱（斜排體）。如：

Bacillusthuringiensis（subsp.）galleria

蘇云金芽孢桿菌臘螟亞種◆菌株名稱——在種名后面自行加上數(shù)字、地名或符號等13有關(guān)學名的其他知識屬名：是一個表示該微生物主要特征的名詞或用作名詞的形容詞，單數(shù)，第一個字母大寫。種名加詞：又稱種加詞，它代表一個物種的次要特征，字母一律小寫。屬名和種名都是由拉丁詞、希臘詞或其他拉丁化的外來詞或以組合方式拼成。按規(guī)定，學名均應按拉丁字母發(fā)音規(guī)則發(fā)音。有關(guān)學名的其他知識屬名：是一個表示該微生物主要特征的名詞或用14由于細菌分類單元的劃分缺乏一個易于操作的統(tǒng)一標準，為了減少因采用不同標準界定分類單元所造成的混亂，細菌系統(tǒng)分類也像其他生物分類一樣采用“模式概念”種和亞種指定模式菌株（typestrain）；亞屬和屬指定模式種（typespecies）；屬以上至目級分類單元指定模式屬（typegenus）；模式菌株應送交菌種保藏機構(gòu)保藏，以便備查考和索取。由于細菌分類單元的劃分缺乏一個易于操作的統(tǒng)一標準，種和亞種指15形態(tài)結(jié)構(gòu)、生理生化、少量的化石資料、行為習性，等等表型特征：b）形態(tài)特征在不同類群中進化速度差異很大，僅根據(jù)形態(tài)推斷進化關(guān)系往往不準確；缺點：a）由于微生物可利用的形態(tài)特征少，很難把所有生物放在同一水平上進行比較；第三節(jié)微生物分類鑒定的方法形態(tài)結(jié)構(gòu)、生理生化、少量的化石資料、行為習性，等等表型特征：16蛋白質(zhì)、RNA和DNA序列進化變化的顯著特點是進化速率相對恒定，也就是說，分子序列進化的改變量(氨基酸或核苷酸替換數(shù)或替換百分率)與分子進化的時間成正比。生物大分子作為分類鑒定的依據(jù)a）在兩群生物中，如果同一種分子的序列差異很大時，------------進化距離遠，進化過程中很早就分支了。b）如果兩群生物同一來源的大分子的序列基本相同，------------處在同一進化水平上。大量的資料表明：功能重要的大分子、或者大分子中功能重要的區(qū)域，比功能不重要的分子或分子區(qū)域進化變化速度低。蛋白質(zhì)、RNA和DNA序列進化變化的顯著特點是進化速率相對恒17RNA作為分類鑒定的依據(jù)16SrRNA被普遍公認為是一把好的譜系分析的“分子尺”：RNA作為分類鑒定的依據(jù)16SrRNA被普遍公認為是一把好18rRNA具有重要且恒定的生理功能在16SrRNA分子中，既含有高度保守的序列區(qū)域，又有中度保守和高度變化的序列區(qū)域，因而它適用于進化距離不同的各類生物親緣關(guān)系的研究；16SrRNA分子量大小適中，便于序列分析；rRNA在細胞中含量大(約占細胞中RNA的90%)，也易于提??；16SrRNA普遍存在于真核生物和原核生物中(真核生物中其同源分子是18SrRNA)。因此它可以作為測量各類生物進化的工具。rRNA具有重要且恒定的生理功能19Eubacteria（細菌域）Archaea（古生菌域）Eukarya（真核生物域）CarlWoese利用16SrRNA建立分子進化樹古生菌在進化譜系上與真細菌及真核生物相互并列，且與后者關(guān)系更近，而其細胞構(gòu)造卻與真細菌較為接近，同屬于原核生物。EubacteriaArchaea20微生物分類鑒定的指標和方法形態(tài)學特征、生理學特征、生態(tài)學特征1、生物分類的傳統(tǒng)指標：形態(tài)學特征培養(yǎng)特征、運動性等等、特殊的細胞結(jié)構(gòu)、細胞形態(tài)及其染色特性、微生物分類和鑒定的重要依據(jù)之一：a）易于觀察和比較，尤其是真核微生物和具有特殊形態(tài)結(jié)構(gòu)的細菌；b）許多形態(tài)學特征依賴于多基因的表達，具有相對的穩(wěn)定性；微生物分類鑒定的指標和方法形態(tài)學特征、生理學特征、生態(tài)學特征21☆生理生化特征與微生物的酶和調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的本質(zhì)和活性直接相關(guān)；代謝產(chǎn)物等營養(yǎng)類型；與氧的關(guān)系；對溫度的適應性；對pH的適應性；對滲透壓的適應性；酶及蛋白質(zhì)都是基因產(chǎn)物；對微生物生理生化特征的比較也是對微生物基因組的間接比較；測定生理生化特征比直接分析基因組要容易得多；☆生理生化特征與微生物的酶和調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的本質(zhì)和活性直接相關(guān)22常借助特異性的血清學反應來確定未知菌種、亞種或菌株?！锷鷳B(tài)特性包括在自然界的分布情況，與其他生物有否寄生或共生關(guān)系,宿主種類及與宿主關(guān)系,有性生殖情況,生活史等?！镅鍖W反應常借助特異性的血清學反應來確定未知菌種、亞種或菌株。★生態(tài)特23核酸的堿基組成和分子雜交特點：與形態(tài)及生理生化特性的比較不同，對DNA的堿基組成的比較和進行核酸分子雜交是直接比較不同微生物之間基因組的差異，因此結(jié)果更加可信。1、DNA的堿基比例的測定DNA堿基因組成是各種生物一個穩(wěn)定的特征，即使個別基因突變，堿基組成也不會發(fā)生明顯變化。分類學上，用G+C占全部堿基的克分子百分數(shù)(G+C）mol%來表示各類生物的DNA堿基因組成特征。二、微生物分類鑒定中的現(xiàn)代方法核酸的堿基組成和分子雜交特點：與形態(tài)及生理生化特性的比較不同24◆每個生物種都有特定的GC%范圍，因此后者可以作為分類鑒定的指標。細菌的GC%范圍為25--75%，變化范圍最大，因此更適合于細菌的分類鑒定?！裘總€生物種都有特定的GC%范圍，因此后者可以作為分類鑒定的25◆GC%測定主要用于對表型特征難區(qū)分的細菌作出鑒定，并可檢驗表型特征分類的合理性，從分子水平上判斷物種的親緣關(guān)系。使用原則：G+C含量的比較主要用于分類鑒定中的否定每一種生物都有一定的堿基組成，親緣關(guān)系近的生物，它們應該具有相似的G+C含量，若不同生物之間G+C含量差別大表明它們關(guān)系遠。但具有相似G+C含量的生物并不一定表明它們之間具有近的親緣關(guān)系?！鬐C%測定主要用于對表型特征難區(qū)分的細菌作出鑒定，并可檢驗26同一個種內(nèi)的不同菌株G+C含量差別應在4～5%以下；同屬不同種的差別應低于10～15%；G+C含量已經(jīng)作為建立新的微生物分類單元的一項基本特征，它對于種、屬甚至科的分類鑒定有重要意義。若二個在形態(tài)及生理生化特性方面及其相似的菌株，如果其G+C含量的差別大于5%，則肯定不是同一個種，大于15%則肯定不是同一個屬。在疑難菌株鑒定、新種命名、建立一個新的分類單位時，G+C含量是一項重要的，必不可少的鑒定指標。其分類學意義主要是作為建立新分類單元的一項基本特征和把那些G+C含量差別大的種類排除出某一分類單元。G+C含量的比較主要用于分類鑒定中的否定同一個種內(nèi)的不同菌株G+C含量差別應在4～5%以下；同屬不同27測定解鏈溫度(Tm):Tm值計算公式：Tm=69.3+0.41(G+C%),<20bp的寡核苷酸：Tm=4（G+C）+2（A+T）測定解鏈溫度(Tm):Tm值計算公式：Tm=69.3+0.428a）DNA-DNA雜交b）DNA-rRNA雜交c）rRNA-rRNA2、核酸的分子雜交法核酸分子雜交(hybridization)間接比較不同微生物DNA堿基排列順序的相似性。是比GC比更細致和更精確的遺傳性狀指標。不同生物DNA堿基排列順序的異同直接反映生物之間親緣關(guān)系的遠近，堿基排列順序差異越小，它們之間的親緣關(guān)系就越近，反之亦然。DNA-DNA雜交同源性>60%可以是同種，>70%同一亞種，同源性20％～60％范圍內(nèi)，則屬于同一個屬。a）DNA-DNA雜交2、核酸的分子雜交法核酸分子雜交(hy2916SrRNA被普遍公認為是一把好的譜系分析的“分子尺”：3、rRNA寡核苷酸編目分析普遍存在與一切細胞中生理功能即重要又穩(wěn)定細胞中含量高，易提取編碼rRNA的某些核苷酸序列非常保守相對分子質(zhì)量適中16SrRNA被普遍公認為是一把好的譜系分析的“分子尺”：3301、提純rRNA2、用T1RNA酶水解3、雙向電泳分離4、得到指紋圖譜5、對比分析基本原理：用一種RNA酶水解rRNA后，可產(chǎn)生一系列寡核苷酸片段，如果兩種或兩株微生物的親緣關(guān)系越近，則所產(chǎn)生的寡核苷酸片段的序列越接近，反之亦然。1、提純rRNA基本原理：用一種RNA酶水解rRNA后，可產(chǎn)31（二）細胞化學成分用作鑒定指標細胞壁的化學成分全細胞水解液的糖型磷酸類脂成分的分析枝菌酸的分析醌類的分析氣相色譜技術(shù)用于微生物的鑒定（三）數(shù)值分類學（統(tǒng)計分類學）p365表10－6數(shù)值分類學與傳統(tǒng)分類法的比較（二）細胞化學成分用作鑒定指標細胞壁的化學成分（三）數(shù)值分類32《伯杰氏鑒定細菌學手冊》(Bergey’sManualofDeterminativeBacteriology)美國賓夕法尼亞大學的細菌學教授伯杰(D.Bergey)(1860-1937)1957年第七版后，由于越來越廣泛地吸收了國際上細菌分類學家參加編寫(如1974年第八版，撰稿人多達130多位，涉及15個國家；現(xiàn)行版本撰稿人多達300多人，涉及近20個國家)，所以它的近代版本反映了出版年代細菌分類學的最新成果，因而逐漸確立了在國際上對細菌進行全面分類的權(quán)威地位。細菌分類系統(tǒng)第四節(jié)微生物的分類系統(tǒng)《伯杰氏鑒定細菌學手冊》美國賓夕法尼亞大學的細菌學教授伯杰(33《伯杰氏系統(tǒng)細菌學手冊》(Bergey’sManualofSystematicBacteriology)伯杰氏手冊是目前進行細菌分類、鑒定的最重要依據(jù)，其特點是描述非常詳細，包括對細菌各個屬種的特征及進行鑒定所需做的實驗的具體方法。（20世紀80年代末期）《伯杰氏系統(tǒng)細菌學手冊》伯杰氏手冊是目前進行細菌分類、鑒定的34放線菌：中國科學院微生物研究所編著的放線菌目分科、分屬檢索表。真菌：真菌界分類系統(tǒng)很多，各國采用不同的系統(tǒng)，比較混亂。近年來為較多人接受的是Ainsworth的綱要。Smith、Alexopou