水稻種質資源遺傳多樣性的ssr分析

水稻是重要的耕作種類。不同的地理、生態(tài)和文化環(huán)境形成了豐富多樣的資源組合。優(yōu)良種質資源長期保存的費用昂貴,收集新資源、鑒定和淘汰重復的資源是種質資源研究的經常性任務。隨著分子生物學的發(fā)展,分子標記技術已廣泛應用于水稻種質資源研究。研究以27個優(yōu)異水稻種質資源(包括15個優(yōu)質種質資源和12個光溫敏核不育種質資源)為材料,進行SSR分析、多樣性評價和聚類分析,以期為這些稻種資源的遺傳改良和雜交配組提供參考;同時制定各稻種資源的分子身份證,為品種的保護提供依據;進而探索新的分子身份證數據記錄方法的可行性,擬在不影響結果準確性的前提下,減少工作量,簡化步驟,為稻種資源鑒定提供技術支持。1材料和方法1.1試驗材料選取15個水稻優(yōu)質種質資源和12個水稻光溫敏核不育種質資源作為供試材料(表1)。1.2測試方法1.2.1引用ssor方法的選擇采用中華人民共和國農業(yè)行業(yè)標準《水稻品種鑒定DNA指紋方法》(NY/T1433-2007)1.2.2來自水稻組的dna提取參照Murray等1.2.3pcr反應和產物分離PCR反應及產物分離參照中華人民共和國農業(yè)行業(yè)標準NY/T1433-20071.2.4ssr帶型樹狀圖的繪制根據PAGE凝膠電泳的結果,在相同遷移率位置上,有帶的記為“1”,無帶的記為“0”,缺失條帶的記為“2”。將統(tǒng)計完的0、1、2數字矩陣輸入MicrosoftExcel工作表,隨后轉化為MicrosoftExcel5.0/95的版本保存,接著用NTedit軟件打開,讀取數據,將數據轉化為.nts的格式保存。然后用NTsys軟件對已經用NTedit軟件處理后的數據進行資源間遺傳相似系數(GS)的計算,由遺傳相似系數的數據矩陣,采用非加權配對算術平均法(UPGMA)繪制資源間遺傳關系樹狀圖。根據Smith等2結果與分析2.1ssr引物擴增條帶24對SSR引物在27個資源中共擴增出了104個等位變異片段,平均每對引物擴增的條帶數為4.3條,圖1是引物RM274擴增的結果,24對引物擴增的遺傳多樣性信息如表2所示。由表2可知,引物擴增的條帶數從2條至7條不等,其中SSR引物RM219與RM258擴增的條帶數均為7,為所有引物中最多。從各引物擴增的條帶數量分布上來看,擴增條帶數為2條和7條的引物數量均為2對,各占8.3%,擴增條帶數為6條的引物數量為3對,占12.5%,此外,分別有4對引物擴增的條帶數為3和5條,各占16.7%,而擴增條帶數量為4條的引物有9對,數量最多,占37.5%,即等位基因位點為3~5個的引物占全部引物的70.8%。24對SSR引物在27個資源中的平均Nei基因多樣性指數為0.533,不同引物的Nei基因多樣性指數變化范圍為0.071~0.820。由于Nei基因多樣性指數是等位基因數和頻率的函數24對SSR引物在15個優(yōu)質水稻資源中共擴增出85條條帶,引物擴增的條帶數從2條至6條不等,平均每對SSR引物擴增的條帶數為3.5條;不同引物的Nei基因多樣性指數變化范圍為0.124~0.738,平均Nei基因多樣性指數為0.482。而在光溫敏核不育資源中共擴增出76條條帶,每對引物的擴增條帶數同樣從2條至6條不等,平均每對SSR引物擴增條帶數為3.2條;不同引物的Nei基因多樣性指數變化范圍為0~0.778,平均Nei基因多樣性指數為0.497,略高于優(yōu)質資源。2.2聚類分析和分子標記的計算根據SSR分子標記數據得到的在優(yōu)質資源和光溫敏核不育資源總共27個資源中的遺傳相似系數變化范圍為0.5481~0.9327,平均遺傳相似系數為0.7536,其中資源1892S和C815S的遺傳相似系數最大,為0.9327,表明兩者的親緣關系在所用試驗種質資源中較近;資源04-657與04-658的遺傳相似系數最小,為0.5481,表明兩者的親緣關系在所用試驗種質資源中較遠。忽略優(yōu)質資源和光溫敏核不育資源各自自身的聚類,兩個資源群體間的遺傳相似系數為0.5865~0.8846,其中遺傳相似系數為0.8846的兩個資源分別是Basmatisuperfine與2301S,而遺傳相似系數為0.5865的兩個資源分別是04-658和1103S。將優(yōu)質資源的SSR分子標記數據單獨統(tǒng)計,進行遺傳相似系數的計算,其變化范圍為0.4471~0.8706,平均遺傳相似系數為0.7043。優(yōu)質資源霸王占與9598的遺傳相似系數最大(0.8706),而優(yōu)質資源04-657與04-658的遺傳相似系數最小(0.4471),該結果與27個資源總體聚類結果吻合。將光溫敏核不育資源的SSR分子標記數據單獨統(tǒng)計,進行遺傳相似系數的計算,其變化范圍為0.4474~0.9079,平均遺傳相似系數為0.6573。不育資源1892S和C815S的遺傳相似系數最大(0.9079),該結果符合27個資源總體聚類結果,而不育資源1103S與HN5S-12的遺傳相似系數最小(0.4474)。2.3類材料聚類分析圖2、圖3、圖4分別為優(yōu)質資源、光溫敏核不育資源以及優(yōu)質和光溫敏核不育資源總體的UPG-MA聚類分析結果。從圖2可以看出,在遺傳相似系數0.58處,可以將優(yōu)質資源分為兩類,Ⅱ類只包含一個泰國資源04-658,剩下的其他14個資源為Ⅰ類,表明泰國資源04-658與其他優(yōu)質資源的親緣關系較遠。在Ⅰ類中,在遺傳相似系數接近0.72處,又可分為5類,鑒真2號、Basmati、晚秈98分別單獨為一類,泰國資源04-657與Basmatisuperfine聚為一類,以鄂中5號、銀占等為代表的湖北資源聚為一類,以西山占、霸王占等為代表的廣西資源聚為一類,分類大致接近于同一地理資源來源聚為一類。分析不育資源聚類分析圖(圖3),在遺傳相似系數0.61處,可將這些不育資源分為三類,Ⅰ類中的資源有1892S、C815S、Y58S、15S、培矮64S、HN5S-12和HN5S-11,這7個資源中的前3個均與培矮64S有親緣關系;Ⅱ類資源有2301S、廣占63S、M6303S和HD9802S,其中的M6303S與廣占63S存在系譜上的親緣關系;Ⅲ類材料僅有1103S。分析優(yōu)質資源和不育資源的聚類分析圖(圖4),在遺傳相似系數0.70處可將27個資源分為四類,Ⅱ類包含珠海占與1103S,Ⅲ類為晚秈98,Ⅳ類包含04-658與HD9802S,其他22個資源組成Ⅰ類。2.4聚類分子身份證的內容將SSR分子標記條帶統(tǒng)計的“0”、“1”結果,按照表單中引物的順序統(tǒng)計成二進制數據,作為優(yōu)質及不育資源的二進制分子身份證,然后再將二進制數據轉化為十進制數據,作為優(yōu)質及不育資源的十進制分子身份證。通過將SSR分子標記統(tǒng)計的“0”、“1”數據轉換為十進制數據可知,在優(yōu)質資源中,各品種的DNA分子身份證由原來85位的二進制數據減少為25~26位的十進制數據,數據量減少至原數據量的30%左右,而在光溫敏核不育資源中,各資源的DNA分子身份證由原來76位的二進制數據減少為23位的十進制數據,數據量相比原來的數據量同樣減少了約70%。比較十進制的分子身份證數據,以優(yōu)質種質資源的聚類為例,可以發(fā)現,以二進制分子身份證聚類在一大類的資源,如西山占、霸王占、18-08和柳沙油占,它們的十進制分子身份證的前五位數均是相同的。而在聚類上與其他種質資源均較遠的資源04-658,它的十進制分子身份證與其他的種質資源均不相同。在不育資源的聚類中,遺傳相似系數最大的兩個資源(1892S與C815S)的十進制分子身份證的前8位數完全相同,超過了任何其他資源十進制分子身份證之間的相似度。以上這些都表明十進制分子身份證數據能夠大體反映二進制的數據,十進制分子身份證是以首位至末位數之間的相似程度來反映資源之間親緣關系遠近的。但是同時也可看到,在優(yōu)質資源二進制聚類中與霸王占較近的種質資源9598,它的十進制分子身份證卻與霸王占不同。關于這些有出入的地方還有待進一步研究。優(yōu)質及不育資源的二進制及十進制分子身份證見表3。3討論3.1ssr引物多態(tài)性分析前人研究表明,分子標記技術可以在DNA水平將作物的種質有效區(qū)分開來,而且分子標記技術的分析結果與系譜分析結果吻合性較高研究中24對SSR引物對光溫敏核不育種質資源的聚類結果與系譜圖具有較高的吻合度,說明用這24對引物可以將這些光溫敏核不育種質資源區(qū)分開。而反觀優(yōu)質種質資源的SSR分析聚類結果,雖與系譜圖大致吻合,但還是有出入,分析認為,推薦的24對SSR引物對于國內種質資源具有較好的區(qū)分度,所以對于國內種質資源使用這24對引物去區(qū)分已經足夠。而在優(yōu)質種質資源中,由于存在國外的以及一些不明來源的種質資源,可能對聚類結果的真實性有一定的干擾,因此僅僅使用24對引物可能還不夠,應該加大引物的使用數量。3.2種質資源指紋圖譜將二進制的分子身份證數字串轉化為十進制的數字串后,數據量